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1、重庆医药高等专科学校 项目项目 9 氯化钠注射液的无菌检查法氯化钠注射液的无菌检查法u无菌检查法的定义: 无菌检查法是指用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。u符合规定的意义: 仅表明了供试品在该检验条件下未发现被微生物污染。仅表明了供试品在该检验条件下未发现被微生物污染。（一）实训目的（一）实训目的（二）原理及应用（二）原理及应用（三）仪器与试剂（三）仪器与试剂（四）操作步骤（四）操作步骤（五）实训报告（五）实训报告（六）注意事项（六）注意事项（七）思考与讨论（七）思考与讨论（一）实训目的1掌握注射剂（薄膜过滤法）的操作方法。掌握注射剂（薄膜过滤法）的
2、操作方法。2熟悉无菌检查（薄膜过滤法）的原理。熟悉无菌检查（薄膜过滤法）的原理。1.试验原理： 无菌检查法是利用无菌操作的方法，将被检查的药品分别加入适合需氧菌、厌氧菌和真菌生长的液体培养基中，置于适宜温度下培养一定时间后，观察有无微生物生长，以判断药品是否合格。（二）原理及应用2.操作流程及方法： 培养基的制备、培养基的适用性检查、稀释液和冲洗液的制备、方法验证试验、取样、供试品无菌检查。供试品无菌检查的方法有薄膜过滤法和直接接种法两种。只要供试品性状允许，应优先采用封闭式薄膜过滤法，也可用一般薄膜过滤器。哪些药物需要进哪些药物需要进行无菌检查？行无菌检查？思考：常见的无菌制剂（检验品种）包
3、括哪些?3.应用应用注射剂（水针、粉针、油乳注射剂）眼用及非注射产品（手术、烧伤、严重创伤面给药制剂）可吸收的止血剂无菌封装的原料药医疗器具和医用材料常见的无菌制剂（检验品种）：4.4.无菌检查的无菌检查的环境要求环境要求环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域一般要求 温度：1826 湿度： 4565例行消毒处理洁净度检查1.菌种金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC(B) 26 003铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CMCC(B) 10 104枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CMCC（B）63
4、501生孢梭菌（Clostridium sporogenes）CMCC(B) 64 941白色念珠菌（Candida albicans）CMCC(F) 98 001黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC(F) 98 003 均为国家药品检定机构分发的标准菌种（三）仪器与试剂2.培养基培养基u 一般采用商品脱水培养基、洁净玻璃器皿、纯水配制u培养基的pH应符合规定u分装好的培养基及时密封后必须在配制当天（2小时内最佳）进行灭菌处理u培养基的储存:225、避光环境，可保存3周左右u培养基装量符合规定要求u培养基适应性检查（无菌性检查、灵敏度检查）u需氧菌和厌氧菌培养基：硫乙醇酸盐流体
5、培养基硫乙醇酸盐流体培养基 3035（32左右） 红色氧化层（h深度的1/5） 100水浴加热10分钟以除去氧化层， 加热时间不超过20分钟。u真菌培养基：改良马丁培养基基 2328（25 左右） 沸水浴加热10min灭菌后放置灭菌后放置3天的培养基天的培养基3.3.供试品供试品 氯化钠注射液（氯化钠注射液（250ml250ml）4.4.稀释液及冲洗液稀释液及冲洗液u稀释液：稀释液：0.1%0.1%蛋白胨水溶液（蛋白胨水溶液（PH7.1PH7.1） （如果蛋白胨溶液（如果蛋白胨溶液浑浊，应过滤）或浑浊，应过滤）或 pH7.0pH7.0氯化钠氯化钠- -蛋白胨缓冲液。蛋白胨缓冲液。u冲洗液：聚山
6、梨酯冲洗液：聚山梨酯80-0.1%80-0.1%蛋白胨水溶液蛋白胨水溶液 （非水溶液制剂非水溶液制剂供试品的冲洗）供试品的冲洗）u溶剂：十四烷酸异丙酯溶剂：十四烷酸异丙酯 （膏剂和粘性油剂的溶剂膏剂和粘性油剂的溶剂 ，膜滤膜滤除菌）除菌）5.5.仪器及用具仪器及用具无菌室内常备器具恒温培养箱及生化培养箱离心机，显微镜，高压蒸汽灭菌器，恒温烤箱，开放或全封闭过滤系统等玻璃器皿无菌衣，裤，帽，口罩除菌滤器及滤膜薄膜过滤仪薄膜过滤仪2024/7/25171.培养基的适用性检查无菌性检查：每批培养基随机抽取不少于 5 支（瓶），培养 14 天，应无菌生长。灵敏度检查：用已知的标准菌种来检定培养基的敏感
7、度，检定培养基敏感度的菌种是由国家药品检定机构分发的标准菌种。 （四）操作步骤2024/7/2518生孢梭菌菌液：接种至硫乙醇酸盐流体培养基；3035培养1824小时。白色念珠菌菌液：接种至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基；2328培养2448小时。上述培养物用0.9%NaCl无菌溶液配制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。 （1）菌液制备金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌菌液：接种至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基；3035培养1824小时。培养基灵敏度检查方法：2024/7/2519黑曲霉菌菌液：接种至改良马丁琼脂培养基上，2328培养57天至产生大量孢子，加入35ml无菌的
8、含0.05（v/v）聚山梨酯80的0.9%氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用无菌的含 0.05（v/v）聚山梨酯80的0.9%NaCl溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。（2）培养基接种 取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，培养3天；取每管装量为9ml的改良马丁培养基5支，分别接种小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，培养5天。逐日观察结果。 （3）结果判断 空白对照管应无菌生长，若加菌的
9、培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。 生孢梭菌生孢梭菌64901铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌10104枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌 63501金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌26003硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基灵敏度检查试验灵敏度检查试验 2.方法验证（1）菌种及菌液制备 金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭茵、白色念珠茵、黑曲霉同培养基灵敏度检查。（2）薄膜过滤法 无菌操作法取规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于100cfu的试验菌，过滤。如用封闭式薄膜过滤器，分别将100ml硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基加入相应的滤筒内，另
10、取一份同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为阳性对照；如采用一般薄膜过滤器，取出滤膜，将其分成3等份，分别置于含50ml硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基的容器中，其中一份作为阳性对照用。置规定温度（细菌3035 ，真菌2328 ）培养35天，观察结果。（3）结果判定： 与阳性对照比较，含供试品的各容器细菌均生长良好，则供试品在该检验量和检验条件下无抑菌作用或可忽略不计，供试品可按该法进行无菌检查。3.供试品无菌检查检验量（接种量）：是指一次试验所用的供试品总量。检验数量：根据供试品的情况，确定检样数量批出厂or上市抽检；固体制剂or液体制剂；直接接种法or薄膜过滤法 参考药典附录90-9
11、1页表1，表2，表3液体制剂液体制剂最少检验用量最少检验用量及上市抽验样品的及上市抽验样品的最少检验数量最少检验数量 供试品装量供试品装量V（ml）每支供试品接入每种培养每支供试品接入每种培养基的最少量基的最少量供试品最少检验数量（瓶或供试品最少检验数量（瓶或支）支）1全量10*1V5半量105V202ml1020V505ml1050V10010ml1050V100（静脉给药）半量10100V500半量6500500ml6*4.4.操作方法操作方法 按无菌操作取规定量供试品，直接过滤，或混合至含适量稀释按无菌操作取规定量供试品，直接过滤，或混合至含适量稀释液的无菌容器内，混匀，立即过滤。如供试
12、品具有抑菌作用或含防液的无菌容器内，混匀，立即过滤。如供试品具有抑菌作用或含防腐剂，须用冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数一般不少于三次，所用的冲腐剂，须用冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数一般不少于三次，所用的冲洗量、冲洗方法同方法验证试验。冲洗后，如用封闭式薄膜过滤器，洗量、冲洗方法同方法验证试验。冲洗后，如用封闭式薄膜过滤器，分别将分别将100ml100ml硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基加入相应的滤硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基加入相应的滤筒内，如采用一般薄膜过滤器，取出滤膜，将其分成筒内，如采用一般薄膜过滤器，取出滤膜，将其分成3 3等份，分别置等份，分别置于含于含50ml50ml硫乙醇酸盐流
13、体培养基及改良马丁培养基的容器中，其中硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基的容器中，其中一份作为阳性对照用。一份作为阳性对照用。 5.培养和观察培养和观察u阳性对照：阳性对照：以金黄色葡萄球菌作为阳性对照菌。取其中以金黄色葡萄球菌作为阳性对照菌。取其中1 1份硫乙醇酸盐流份硫乙醇酸盐流体培养基，加入小于体培养基，加入小于100cfu100cfu金黄色葡萄球菌，金黄色葡萄球菌，343411培养培养48724872小时应生小时应生长良好。长良好。u阴性对照：阴性对照：用与供试品同量的用与供试品同量的0.1%0.1%蛋白胨水代替供试品，同法操作，作蛋白胨水代替供试品，同法操作，作为阴性对照。为阴性对
14、照。u分别观察一份供试品接种到硫乙醇酸盐流体培养基中，置分别观察一份供试品接种到硫乙醇酸盐流体培养基中，置30 30 35 35 培培养养14 14 天；另一份供试品接种到改良马丁培养基中，置天；另一份供试品接种到改良马丁培养基中，置20 20 25 25 培养培养14 14 天，培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。天，培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。如在加入供试品后或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养如在加入供试品后或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养14 14 天后，不天后，不能从外观上判断有无细菌生长，可取该培养液转种至同种新鲜培养基中及能从外观上判断有无细菌生长，可取该培养液转
15、种至同种新鲜培养基中及营养琼脂斜面和改良马丁琼脂斜面培养基上，细菌培养营养琼脂斜面和改良马丁琼脂斜面培养基上，细菌培养2 2天，真菌培养天，真菌培养3 3天，天，观察接种的同种新鲜培养基及营养琼脂和改良马丁琼脂斜面培养基上是否观察接种的同种新鲜培养基及营养琼脂和改良马丁琼脂斜面培养基上是否有菌生长；或取培养液（物）涂片，染色，镜检，判断是否有菌，必要时有菌生长；或取培养液（物）涂片，染色，镜检，判断是否有菌，必要时做菌种鉴定。做菌种鉴定。6.实验结果判定实验结果判定阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长。否则，试验无效。阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长。否则，试验无效。若供试
16、品管均澄清，或虽浑浊但经确证无细菌生长，判供试品符合规定；若供试品管均澄清，或虽浑浊但经确证无细菌生长，判供试品符合规定；若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。充分证明试验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。当符合下列至少当符合下列至少1 1个条件时方可判试验结果无效：个条件时方可判试验结果无效： （1 1）无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要）无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求。求。
17、（2 2）回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素。）回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素。 （3 3）阴性对照有菌生长。）阴性对照有菌生长。 （4 4）供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和）供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。（或）无菌操作技术不当引起的。试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法检查若无菌生试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法检查若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符
18、合规定。（五）实训报告无菌试验结果记录无菌试验结果记录品名： 批 号： 规格： 检验日期： 检定依据检定依据： 中国药典2010年版检测环境检测环境：温度： 湿度： 培养箱（I）： 培养箱（II）： 培养基种类、温度及装量培养基种类、温度及装量：液体硫乙醇酸盐培养基（I批号： ）：培养需养菌、厌养菌、阳性菌及阴性对照，温度3035，装量100ml。改良马丁培养基（II批号： ）：培养真菌，温度2328，装量100ml。营养肉汤培养基（III批号： ）：培养对照菌，温度3035，装量10ml。对照菌对照菌： 菌液制备菌液制备：取对照菌一白金耳，接种于10ml（III）培养基内，经3035培养 1
19、824小时后，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍递增稀释至每毫升小于100个，备用。样品处理样品处理：取样 ，全量通过全封闭式薄膜过滤器过滤后，再分别注入上述培养基，置3035（I）及2328（II）培养。 结论：结论： 符合规定符合规定 不符合规定不符合规定 检验人：检验人： 复核人：复核人： （六）注意事项（六）注意事项无菌检查用培养基应每批进行灵敏度检查，合格后方可使用。无菌检查用培养基应每批进行灵敏度检查，合格后方可使用。培养基应进行适用性检查，包括灵敏度和无菌性检查两项。培养基应进行适用性检查，包括灵敏度和无菌性检查两项。无菌检查所用的菌株应符合相关规定，并应采用适宜的菌种保存技无菌检查
20、所用的菌株应符合相关规定，并应采用适宜的菌种保存技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。当建立药品的无菌检查法时，应进行方法学的验证，以证明所采用当建立药品的无菌检查法时，应进行方法学的验证，以证明所采用的方法适合于该药品的无菌检查。若药品的组分或原检验条件发生的方法适合于该药品的无菌检查。若药品的组分或原检验条件发生改变时，检查方法应重新验证。改变时，检查方法应重新验证。供试品的接种量及检验数量应符合供试品的接种量及检验数量应符合中国药典中国药典规定。规定。 （七）思考与讨论（七）思考与讨论举例说明哪些生物制剂需要作无菌检查举例说明哪些生物制剂需要作无菌检查? ? 出现怎样的试出现怎样的试验结果可判断该供试品为无菌检查合格的生物制剂？验结果可判断该供试品为无菌检查合格的生物制剂？在上述实验中，为何要设阳性和阴性对照？若阳性对照在上述实验中，为何要设阳性和阴性对照？若阳性对照出现了阴性结果，请分析其产生原因，又该如何处理？出现了阴性结果，请分析其产生原因，又该如何处理？
