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1、从细胞中分从细胞中分离出离出DNA从大肠杆菌从大肠杆菌中提取质粒中提取质粒限制限制 酶酶提取目的基因提取目的基因限制酶限制酶目的基因与运目的基因与运载体结合载体结合DNA连连 接酶接酶目的基因导入目的基因导入受体细胞受体细胞目的基因的检目的基因的检测与表达测与表达三、基因工程操作的基本步骤三、基因工程操作的基本步骤基因操作基因操作“四部曲四部曲”即四个基本步骤：即四个基本步骤：1 1）提取目的基因）提取目的基因）提取目的基因）提取目的基因2 2）目的基因于运载体结合）目的基因于运载体结合）目的基因于运载体结合）目的基因于运载体结合3 3）将目的基因）将目的基因）将目的基因）将目的基因导入导入导
2、入导入受体细胞受体细胞受体细胞受体细胞4 4）目的基因的检测和表达）目的基因的检测和表达）目的基因的检测和表达）目的基因的检测和表达步骤一：步骤一：提取目的基因提取目的基因 目的基因目的基因是人们所是人们所需要转移需要转移或或改造改造的基因的基因,获取目的基因是实施基因工程的第一步获取目的基因是实施基因工程的第一步 。 如苏云金芽孢杆菌的如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因抗虫基因，还有植，还有植物的物的抗病抗病（抗病毒抗病毒、抗细菌抗细菌）基因基因、种子、种子贮贮藏蛋白的基因藏蛋白的基因，以及人的，以及人的胰岛素基因胰岛素基因、干扰干扰素基因素基因等。等。目的基因的提取方法目的基因的提取方法直接分离基
3、因直接分离基因人工合成基因人工合成基因反转录法反转录法根据已知的氨基酸序列根据已知的氨基酸序列合成合成DNA：鸟枪法鸟枪法1 . 鸟枪法（散弹射击法）鸟枪法（散弹射击法） 用用用用限制酶限制酶限制酶限制酶将将将将供体细胞供体细胞供体细胞供体细胞中的中的中的中的DNADNA切成许多片段切成许多片段切成许多片段切成许多片段，将这些片，将这些片，将这些片，将这些片段分别段分别段分别段分别载入运载体载入运载体载入运载体载入运载体，然后通过，然后通过，然后通过，然后通过运载体分别转入不同的受体细运载体分别转入不同的受体细运载体分别转入不同的受体细运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞提供的外源胞，让供
4、体细胞提供的外源胞，让供体细胞提供的外源胞，让供体细胞提供的外源DNADNA的所有片段分别在各个的所有片段分别在各个的所有片段分别在各个的所有片段分别在各个受受受受体细胞体细胞体细胞体细胞中中中中大量复制大量复制大量复制大量复制（即（即（即（即扩增扩增扩增扩增），），），），从中从中从中从中找出含有目的基因找出含有目的基因找出含有目的基因找出含有目的基因的细胞，的细胞，的细胞，的细胞，再利用一定发方法将目的基因再利用一定发方法将目的基因再利用一定发方法将目的基因再利用一定发方法将目的基因的的的的DNADNA片段片段片段片段分离分离分离分离出来。出来。出来。出来。用限制酶切断成用限制酶切断成许多
5、片段许多片段（2 2）基因文库的建立方法基因文库的建立方法提取某种生物的全部提取某种生物的全部DNADNA用适当的限制酶酶切用适当的限制酶酶切一定大小的一定大小的DNADNA片段片段将将DNADNA片段与运载体连接片段与运载体连接导入受体菌中储存导入受体菌中储存基因组文库基因组文库方法一：直接分离法方法一：直接分离法( (鸟枪法鸟枪法) )1）反转录法反转录法： 以以目的基因目的基因转录成转录成的的信使信使RNA为模板，为模板，反反转录转录成互补的成互补的单链单链DNA，然后在酶的作用下，然后在酶的作用下合合成双链成双链DNA，从而获得，从而获得所需的基因。所需的基因。目的基因的目的基因的mR
6、NA单链单链DNA(cDNA)双链双链DNA(即目的基因即目的基因)反转录反转录反转录反转录合成合成合成合成2.2.人工合成基因法人工合成基因法2）根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNA法法 ： 根据根据已知已知蛋白质蛋白质的的氨基酸序列氨基酸序列，推测推测出相应的出相应的信使信使RNA序序列，然后按照列，然后按照碱基互碱基互补配对补配对原则，原则，推测推测出出它的它的结构基因的核苷结构基因的核苷酸序列酸序列，再通过化学，再通过化学方法，以方法，以单核苷酸为单核苷酸为原料合成目的基因原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的
7、核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成化学合成化学合成上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？优点优点缺点缺点鸟枪法鸟枪法反转录法反转录法根据已知氨基酸根据已知氨基酸合成合成DNADNA法法操作简便操作简便广泛使用广泛使用工作量大，盲目，分工作量大，盲目，分离出来的有时并非一离出来的有时并非一个基因个基因专一性强专一性强操作过程麻烦，操作过程麻烦，mRNAmRNA很不稳定，要求的技很不稳定，要求的技术条件较高术条件较高专一性最强专一性最强仅限于合成核苷酸对仅限于合成核苷酸对较少的简单基因较少的简单基因哪
8、些新技术能大大简化基因工程的操作技术？哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？1）DNA序列自动测序仪：序列自动测序仪：2）PCR技术：技术： 对提取出来的基因进对提取出来的基因进行核苷酸序列分析。行核苷酸序列分析。 使目的基因的片段使目的基因的片段在短时间内成百万倍在短时间内成百万倍地扩增。地扩增。步骤二：目的步骤二：目的基因与运载体结合基因与运载体结合 1）用一定的）用一定的限制酶切割质粒限制酶切割质粒，使其出现，使其出现一一个切口个切口，露出，露出黏性末端黏性末端。 2）用）用同一种同一种限制酶限制酶切断目的基因切断目的基因，使其产，使其产生生相同相同的的黏性末端黏性末端。 3）将切下的
9、目的基因片段）将切下的目的基因片段插入质粒插入质粒的切口的切口处，再加入适量处，再加入适量DNA连接酶连接酶，形成了一个，形成了一个重重组组DNA分子分子（重组质粒）（重组质粒） 目的基因与运载体的结合过程，实际目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的上是不同来源的基因重组的过程基因重组的过程。常用的受体细胞：常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。酵母菌和动植物细胞等。将目的基因导入受体细胞的原理将目的基因导入受体细胞的原理借鉴借鉴细菌或病毒侵染细胞细菌或病毒侵染细胞的途径。的途径。步骤三：将目的基因导入受体细胞步骤三
10、：将目的基因导入受体细胞 1）将细菌用）将细菌用CaCl2处理处理，以，以增大增大细菌细菌细细胞壁的通透性胞壁的通透性。 2）使含有目的基因的）使含有目的基因的重组质粒进入重组质粒进入受体受体细胞。细胞。 3）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制复制，由于细菌，由于细菌繁殖的速度繁殖的速度非常快，在很非常快，在很短的时间内就能获得短的时间内就能获得大量大量的目的基因。的目的基因。例如：将目的基因导入微生物细胞例如：将目的基因导入微生物细胞步骤四：步骤四：目的基因的检测和表达目的基因的检测和表达四环素四环素抗性基因抗性基因氨苄青霉氨苄青霉素抗性基因素抗性基因检测
11、是否导入：检测是否导入： 看标记基因控制的性状是否表现看标记基因控制的性状是否表现 不能，受体细胞必须表现出特定的性状，不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了才能说明目的基因完成了表达表达。受体细胞摄入受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因分子后就说明目的基因完成了表达吗？完成了表达吗？若不能表达，若不能表达，要对抗虫基因要对抗虫基因再进行再进行修饰修饰。检测是否表达：检测是否表达： 看目的基因控制的性状是否表现看目的基因控制的性状是否表现多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄养并诱导发育成完整
12、个体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应变化的个体进一步培养、研究。变化的个体进一步培养、研究。例：用棉铃饲喂棉例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。抗虫基因并得到表达。1）以下说法正确的是）以下说法正确的是 （ ） A、所所有有的的限限制制酶酶只只
13、能能识识别别一一种种特特定定的的核核苷苷酸序列酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运运载载体体必必须须具具备备的的条条件件之之一一是是：具具有有多多个限制酶切点，以便与外源基因连接个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来、基因控制的性状都能在后代表现出来C练习练习2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是）不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能能复复制制 （ ） B、有多个限制酶切点、有多个限制酶切点 C、具有标记基因、具有标记基因 D、它是环状、它是环状DNAD练习练习3）有有关关基基因因工工程程的的叙叙述述中中，错错误误
14、的的是是（ ） A、DNA连连接接酶酶将将黏黏性性末末端端的的碱碱基基对对连连接接起起来来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶人工合成目的基因不用限制性内切酶A练习练习4）有有关关基基因因工工程程的的叙叙述述正正确确的的是是 （ ） A、限制酶只在获得目的基因时才用、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体、质粒都可作为运载体 D、蛋蛋白白质质的的结结构构可可为为合合成成目目的的基基因因提提供供资料资料D练习练习5）基基因因工工程程是是在在DNA分分子子水水平平上上进进行行设设计计施施工工的的。在在基基因因操操作作的的基基本本步步骤骤中中，不不进进行行碱碱基基互互补补配配对对的的步步骤骤是是 （ ） A、人工合成目的基因、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达、目的基因的检测和表达C练习练习
