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1、DNA的生物合成的生物合成( (复制复制) )DNA Biosynthesis，Replication 第第 十十 章章复制复制( (replication)是指遗传物质的传代，以母链是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板为模板合成子链合成子链DNA的过程。的过程。复制复制亲代亲代DNA子代子代DNA复制的基本规律复制的基本规律Basic Rules of DNA Replication 第一节第一节l复制的方式复制的方式半保留复制半保留复制(semi-conservative replication)l复制的高保真性复制的高保真性(high fidelity) l双向复制双向复制(bidir
2、ectional replication)l半不连续复制半不连续复制(semi-discontinuous replication) 一、半保留复制的实验依据和意义 DNA生生物物合合成成时时，母母链链DNA解解开开为为两两股股单单链链，各各自自作作为为模模板板(template)按按碱碱基基配配对对规规律律，合合成成与与模模板板互互补补的的子子链链。子子代代细细胞胞的的DNA，一一股股单单链链从从亲亲代代完完整整地地接接受受过过来来，另另一一股股单单链链则则完完全全从从新新合合成成。两两个个子子细细胞胞的的DNA都都和和亲亲代代DNA碱碱基基序序列列一一致致。这这种种复复制制方式称为方式称为
3、半保留复制半保留复制。半保留复制的概念半保留复制的概念AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链母链DNA 复制过程中形成复制过程中形成的复制叉的复制叉子代子代DNA 目目 录录子链继承母链遗传信息的几种可能方式子链继承母链遗传信息的几种可能方式 全保留式全保留式 半保留式半保留式 混合式混合式 密度梯度实验密度梯度实验 实验结果支持实验结果支持半保留复制半保留
4、复制的设想。的设想。含重氮含重氮-DNA的细菌的细菌培养于普培养于普通培养液通培养液 第一代第一代继续培养于继续培养于普通培养液普通培养液 第二代第二代梯度离心结果梯度离心结果按按半半保保留留复复制制方方式式，子子代代DNA与与亲亲代代DNA A的的碱碱基基序序列列一一致致，即即子子代代保保留留了了亲亲代代的的全全部部遗遗传信息，体现了遗传的传信息，体现了遗传的保守性保守性。半保留复制的意义半保留复制的意义遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但但不是绝对的不是绝对的。原核生物复制时，原核生物复制时，DNA从从起始点起始点(origin)向两个方向解链，形
5、成两个延伸方向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为向相反的复制叉，称为双向复制双向复制。 二、双向复制复制中的放射自显影图象复制中的放射自显影图象A. 环状双链环状双链DNA及复制起始点及复制起始点B. 复制中的两个复制叉复制中的两个复制叉C. 复制接近终止点复制接近终止点(termination, ter)oriterA B C真核生物每个染色体有多个起始点，是多真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个一个复制子复制子(replicon) 。复制子是独立完成复。复制子是独立完成复制
6、的功能单位。制的功能单位。 53oriorioriori535533553复制子复制子3三、复制的半不连续性3 5 3 5 解链方向解链方向35335领头链领头链(leading strand)随从链随从链(lagging strand)顺顺着着解解链链方方向向生生成成的的子子链链，复复制制是是连连续续进进行行的的，这股链称为这股链称为领头链领头链。另另一一股股链链因因为为复复制制的的方方向向与与解解链链方方向向相相反反，不不能能顺顺着着解解链链方方向向连连续续延延长长，这这股股不不连连续续复复制制的的链链称称为为随随从从链链。复复制制中中的的不不连连续续片片段段称称为为岡岡崎崎片片段段(ok
7、azaki fragment)。 领领头头链链连连续续复复制制而而随随从从链链不不连连续续复复制制，就就是是复复制制的的半不连续性半不连续性。 DNA复制的酶学复制的酶学The Enzymology of DNA Replication第二节第二节参与参与DNA复制的物质复制的物质 底物底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP聚合酶聚合酶(polymerase): 依赖依赖DNA的的DNA聚合酶，简聚合酶，简写写 为为 DNA-pol模板模板(template) : 解开成单链的解开成单链的DNA母链母链引物引物(primer): 提供提供3 -OH末端使末端
8、使dNTP可以依次聚可以依次聚合合 其他的酶和蛋白质因子其他的酶和蛋白质因子一、复制的化学反应一、复制的化学反应 (dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi 目目 录录聚合反应的特点DNA 新链生成需新链生成需引物引物和和模板模板； 新链的延长只可沿新链的延长只可沿5 3 方向进行方向进行 。二、DNA聚合酶全称：全称：依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase)简称：简称：DNA-pol活性：活性：1. 53 的聚合活性的聚合活性2. 核酸外切酶活性核酸外切酶活性5 A G C T T C A G G A T A 3 |
9、 | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性 5 3 外切酶活性外切酶活性?能切除突变的能切除突变的 DNA片段。片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。能辨认错配的碱基对，并将其水解。 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 目目 录录（一）原核生物的（一）原核生物的DNA聚合酶聚合酶DNA-pol DNA-pol DNA-pol （一）原核生物的（一）原核生物的DNA聚合酶聚合酶功能功能：对复制中的错误进行校读，对复制和对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。修复中出现的空隙进行填补。DN
10、A-pol （109kD）323个氨基酸个氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 604个氨基酸个氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是实验室合成片段是实验室合成DNA，进行，进行分子生物学研究中常用的工具酶。分子生物学研究中常用的工具酶。 DNA-pol （120kD） DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活基因发生突变，细菌依然能存活 它参与它参与DNA损伤的应急状态修复。损伤的应急状态修复。 功能功能是原核生物复制延长中真正起催化作用
11、的酶。是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。 DNA-pol (250kD)（二）真核生物的（二）真核生物的DNADNA聚合酶聚合酶DNA-pol 起始引发，有引物酶活性。起始引发，有引物酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。参与低保真度的复制参与低保真度的复制 。在复制过程中起校读、修复和填补缺在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。口的作用。在在线粒体线粒体DNA复制中起催化作用。复制中起催化作用。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol （二）真核生物的（二）真核生物的DNA聚合酶聚合酶三、复制保真性的酶学依据三、复制保真性
12、的酶学依据复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。确传代的基本原理。复制保真性的酶学机制：复制保真性的酶学机制：（一）（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读的核酸外切酶活性和及时校读 （二）复制的保真性和碱基选择（二）复制的保真性和碱基选择（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。其聚合活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，：碱基配对正确， DNA-pol不表现活性。不表现活性。（二）复制的保真性和碱基选择 DNA
13、聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。 嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型反式构型。 1. 遵守严格的碱基配对规律；遵守严格的碱基配对规律；2. 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；3. 复制出错时复制出错时DNA-pol的及时校读功能。的及时校读功能。DNA复制的保真性至少要依赖三种机制复制的保真性至少要依赖三种机制 五、五、DNA连接
14、酶连接酶连连接接DNA链链3 -OH末末端端和和相相邻邻DNA链链5 -P末末端端，使使二二者者生生成成磷磷酸酸二二酯酯键键，从从而而把把两两段段相邻的相邻的DNA链连接成一条完整的链。链连接成一条完整的链。 DNA连接酶连接酶(DNA ligase)作用方式作用方式HO5335DNA连接酶连接酶ATPADP5353目目 录录DNA连连接接酶酶在在复复制制中中起起最最后后接接合合缺缺口口的的作用。作用。在在DNA修修复复、重重组组及及剪剪接接中中也也起起缝缝合合缺缺口作用。口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。也是基因工程的重要工具酶之一。功能功能DNA生物合成过程生物合成过程The Proc
15、ess of DNA Replication第三节第三节（一）复制的起始（一）复制的起始需要解决两个问题：需要解决两个问题：1. DNA解开成单链，提供模板。解开成单链，提供模板。2. 合成引物，提供合成引物，提供3 -OH末端。末端。一、原核生物的一、原核生物的DNA生物合成生物合成 E.coli复制起始点复制起始点 oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 245 串联重复序列串
16、联重复序列 反向重复序列反向重复序列5 3 5 3 1. DNA解链解链 Dna A Dna B、 Dna CDNA拓扑异构酶拓扑异构酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5 2. 引发体和引物引发体和引物含有解螺旋酶、含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。复制起始区域的复合结构称为引发体。 3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短链引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。分子。 引物引物3 HO5引物引物酶酶（二）复制的延长（二）复制的延长复复制制的的延延长长指指在在DNA-pol催催化化下下，dNTP以以dNMP的的方方式式逐逐个个加加入入引
17、引物物或或延延长长中中的的子子链链上上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。 5 35dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33 3DNA-pol目目 录录领头链的合成领头链的合成目目 录录随从链的合成随从链的合成目目 录录目目 录录阶段一阶段一阶段二阶段二阶段三阶段三阶段四阶段四复复制制过过程程简简图图目目 录录复复 制制 过过 程程 动动 画画原核生物基因是环状原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制，双向复制的复制片段在复制的终止点片段在复制的终止点(ter)处汇合。处汇合。oriter E.coli8232 ori ter
18、SV40500（三）复制的终止（三）复制的终止5 5 5 RNA酶酶OHP5 DNA-pol dNTP5 5 PATP ADP+Pi5 5 DNA连接酶连接酶 随从链上不连续性片段的连接随从链上不连续性片段的连接目目 录录哺乳动物的哺乳动物的细胞周期细胞周期DNA合成期合成期G1G2SM二、真核生物的二、真核生物的DNA生物合成生物合成 细细胞胞能能否否分分裂裂，决决定定于于进进入入S期期及及M期期这这两两个个关关键键点点。G1S及及G2M的的调调节节，与与蛋蛋白白激激酶酶活活性有关。性有关。 蛋蛋白白激激酶酶通通过过磷磷酸酸化化激激活活或或抑抑制制各各种种复复制制因因子子而实施调控作用。而实
19、施调控作用。 真真核核生生物物每每个个染染色色体体有有多多个个起起始始点点，是是多多复复制制子子复复制制。复复制制有有时时序序性性，即即复复制制子子以以分分组组方方式式激激活活而不是同步起动。而不是同步起动。 复复制制的的起起始始需需要要DNA-pol（引引物物酶酶活活性性）和和pol（解解螺螺旋旋酶酶活活性性）参参与与。还还需需拓拓扑扑酶酶和和复复制制因子因子(replication factor, RF)。 增增殖殖细细胞胞核核抗抗原原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。在复制起始和延长中起关键作用。 （一）复制
20、的起始（一）复制的起始3 5 5 3 领头链领头链3 5 3 5 亲代亲代DNA随从链随从链引物引物核小体核小体（二）复制的延长（二）复制的延长染色体染色体DNA呈线状，复制在末端停止。呈线状，复制在末端停止。复制中岗崎片段的连接，复制子之间的连接。复制中岗崎片段的连接，复制子之间的连接。染色体两端染色体两端DNA子链上最后复制的子链上最后复制的RNA引物，引物，去除后留下空隙。去除后留下空隙。（三）复制的终止（三）复制的终止5 3 3 5 5 3 3 5 +5 3 3 3 3 5 5 目目 录录目目 录录切除引物的两种机制切除引物的两种机制目目 录录端粒端粒(telomere)指真核生物染色
21、体线性指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。分子末端的结构。功能功能 维持染色体的稳定性维持染色体的稳定性 维持维持DNA复制的完整性复制的完整性结构特点结构特点 由末端单链由末端单链DNA序列和蛋白质构成。序列和蛋白质构成。 末端末端DNA序列是多次重复的富含序列是多次重复的富含G、C碱碱基的短基的短 序列。序列。TTTTGGGGTTTTGGGG端粒酶端粒酶(telomerase)端粒酶端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR)端粒酶协同蛋白端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1, hTP1)端粒酶逆转录酶端粒
22、酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT) 组成组成端粒酶的催端粒酶的催化延长作用化延长作用爬爬行行模模型型目目 录录DNADNA聚合酶复制子链聚合酶复制子链进一步加工进一步加工目目 录录逆转录和其他复制方式逆转录和其他复制方式Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways第四节第四节逆转录酶逆转录酶(reverse transcriptase) 逆转录逆转录(reverse transcription) 逆转录逆转录酶酶一、逆转录病毒和逆转录酶一、逆转录病毒和逆转录酶 逆转录
23、病毒细胞内的逆转录现象逆转录病毒细胞内的逆转录现象RNA 模板模板逆转录酶逆转录酶DNA-RNA 杂化双链杂化双链RNA酶酶单链单链DNA逆转录酶逆转录酶双链双链DNA逆转录酶逆转录酶 A AA A T T T TAAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T分子生物学研究可应用逆分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法的基因的重要方法之一，此法称为称为cDNA法。法。 以以mRNA为模板，经逆转为模板，经逆转录合成的与录合成的与mRNA碱基序列互碱基序列互补的补的DNA链。链。 试管内合成试管内合成cD
24、NAcDNA complementary DNA 二、逆转录研究的意义二、逆转录研究的意义 逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。的重大发现。 逆转录现象说明：至少在某些生物，逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样同样兼有遗传信息传代与表达功能。兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意世纪初已注意到的病毒致癌理论。到的病毒致癌理论。 滚环复制滚环复制(rolling circle replication)三、滚环复制和三、滚环复制和D环复制环复制 是某些低等生物的复制形式，如是某些
25、低等生物的复制形式，如 X174和和M13噬菌体等。噬菌体等。3 -OH5 -P5 5 5 3 3 3 3 5滚环复制滚环复制5 5 3 3 5 目目 录录dNTPDNA-pol D环复制环复制(D-loop replication) 是线粒体是线粒体DNA (mitochondrial DNA，mtDNA)的复制形式。的复制形式。 DNA损伤（突变）与修复损伤（突变）与修复DNA Damage (Mutation) and Repair第五节第五节遗传物质的结构改变而引起的遗传信息遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为改变，均可称为突变。突变。在复制过程中发生的在复制过程中发生的D
26、NA突变称为突变称为DNA损伤损伤(DNA damage)。从分子水平来看，突变就是从分子水平来看，突变就是DNA分子上分子上碱基的改变。碱基的改变。 一、突变的意义一、突变的意义（一）突变是进化、分化的分子基础（一）突变是进化、分化的分子基础（二（二）突变导致基因型改变突变导致基因型改变（三（三）突变导致死亡突变导致死亡（四）突变是某些疾病的发病基础（四）突变是某些疾病的发病基础 二、引发突变的因素二、引发突变的因素物理因素物理因素 紫外线紫外线(ultra violet, UV)、各种辐射、各种辐射 UV化学因素化学因素目目 录录三、突变的分子改变类型三、突变的分子改变类型错配错配 (mi
27、smatch)缺失缺失 (deletion)插入插入 (insertion)重排重排 (rearrangement)框移框移(frame-shift) DNA分子上的碱基错配称分子上的碱基错配称点突变点突变(point mutation)。发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。 1. 转换转换发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。或嘧啶变嘌呤。 2. 颠换颠换（一）错配（一）错配镰形红细胞贫血病人镰形红细胞贫血病人Hb (HbS) 亚基亚基N-val his leu thr
28、 pro val glu C 肽链肽链CAC GTG基因基因正常成人正常成人Hb (HbA)亚基亚基N-val his leu thr pro glu glu C 肽链肽链CTC GAG基因基因（二（二）缺失缺失、插入插入和框移和框移缺失：缺失：一个碱基或一段核苷酸链从一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上大分子上消失。消失。插入：插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到到DNA大分子中间。大分子中间。框移突变框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。 缺失或插
29、入都可导致缺失或插入都可导致框移突变框移突变 。谷谷 酪酪 蛋蛋 丝丝5 G C A G U A C A U G U C 丙丙 缬缬 组组 缬缬正常正常5 G A G U A C A U G U C 缺失缺失C缺失引起框移突变缺失引起框移突变（三（三）重排重排DNA分子内较大片段的交换，称为分子内较大片段的交换，称为重组或重排。重组或重排。 由基因重排引起的两种地中海贫血基因型由基因重排引起的两种地中海贫血基因型目目 录录四、四、DNA损伤的修复损伤的修复修复修复(repairing) 是对已发生分子改变的补偿措施，使其是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态。回复为原有的天然状
30、态。光修复光修复(light repairing)切除修复切除修复(excision repairing)重组修复重组修复(recombination repairing)SOS修复修复 修复的主要类型修复的主要类型（一）光修复（一）光修复光修复酶光修复酶(photolyase) UVUvrAUvrBUvrCOHPDNA聚合酶聚合酶OHP （二）切除修复（二）切除修复是细胞内最重要和是细胞内最重要和有效的修复机制，主要有效的修复机制，主要由由DNA-pol和连接酶完和连接酶完成。成。DNA连接酶连接酶ATPE.coli的切除的切除修复机制修复机制目目 录录切切 除除 修修 复复 动动 画画（三
31、）重组修复（三）重组修复（四）四）SOS修复修复当当DNA损损伤伤广广泛泛难难以以继继续续复复制制时时，由由此此而而诱诱发出一系列复杂的反应。发出一系列复杂的反应。在在E. coli，各各种种与与修修复复有有关关的的基基因因，组组成成一一个个称为称为调节子调节子(regulon)的网络式调控系统。的网络式调控系统。这这种种修修复复特特异异性性低低，对对碱碱基基的的识识别别、选选择择能能力力差差。通通过过SOS修修复复，复复制制如如能能继继续续，细细胞胞是是可可存存活活的的。然然而而DNA保保留留的的错错误误较较多多，导导致致较较广泛、长期的突变。广泛、长期的突变。附附 录录催化催化DNA聚合聚合参与参与DNA损损伤的应急状态伤的应急状态修复修复修复合成、修复合成、切除引物、切除引物、填补空隙填补空隙功能功能2040400分子数分子数/细胞细胞1011亚基数亚基数+-+5 外切酶活性外切酶活性+ 5 外切酶活性外切酶活性+5 聚合酶活性聚合酶活性pol IIIpol IIpol IE. Coli中的中的DNA聚合酶聚合酶
