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1、现代生物技术概论现代生物技术概论授课36节任课教师：周盛TEL：13669693258E-mail:请你了解我周盛，华南理工大学工学博士主要研究方向：环境微生物学及分子生态学曾在企业当过技术员，工程师，总工程师，副厂长。至于做教师，我是半路出家。至于做教师，我是半路出家。我的教学原则：实用主义我的教学原则：实用主义第1章现代生物技术总论第一节生物技术的含义一生物技术的定义生物技术(biotechnology),有时也称生物工程(bioengineering),是指人们以现代生命科学为基础,结合其他基础学科的科学原理,采用先进的工程技术手段,按照预先的设计改造生物体或加工生原料,为人类生产出所需
2、产品或达到某种目的.现代生物技术是以20世纪70年代DNA重组技术的建立为标志的。物技术时期关键以分子生物学的理论为先导，基因工程技术开始能作为生物技术新产品的一种开发手段或关键技术后起始的。二生物技术的种类及其相互关系1基因工程基因工程(geneengineering)是20世纪70年代以后兴起的一门新技术,其主要原理是应用人工方法的生物的遗传物质,通常是脱氧核糖核酸(DNA)分离出来,在体外进行切割,拼接和重组,然后将重组了的DNA导入某种宿主细胞或个体,从而改变它们的遗传品性;有时还使新的遗传信息(基因)在新的宿主细胞或个体中大量表达,以获得基因产物(多太或蛋白质).2.细胞工程细胞工程
3、(cellengineering)是指以细胞为基本单位,在体外条件下进行培养,繁殖;或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿发生改变,从而达到改良生物品种和创造新品种;或加速繁育动、植物个体;或获得某种有用的物质的过程.3酶工程酶工程(enzymeengineering)是利用酶,细胞器或细胞所具有的特异催化功能,对酶进行修饰改造,并借助生物反应器和工过程来生产人类所需产品的一项技术.4发酵工程利用微生物生长速度快,生长条件简单以及代谢过程特殊等特点,在合适条件下,通过现代工程技术手段,由微生物的某种特定功能生产出人类所需的产品称为发酵工程.5蛋白质工程蛋白质工程(proteinenginee
4、ring)是指在基因工程的基础上,结合蛋白质结晶学,计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识,通过对基因的人工定向改造等手段,从而达到对蛋白质进行修饰,改造,拼接以产生能满足人类需用要的新型蛋白质的技术.五大工程相互关系生化工程生化工程生物化学工程是生物化学反应的工程应用，生物化学工程是生物化学反应的工程应用，主要包括了发酵工程下游技术。即后提取。主要包括了发酵工程下游技术。即后提取。第二节，第三节不讲第四节现代生物技术的应用及发展前途应用：一、提高生命质量，延长人类寿命二、解决能源危机、治理环境污染三、改善农业生产、解决食品短缺一、提高生命质量，延长人类寿命（一）用于开发新型药品1977
5、年，美国首先采用大肠杆菌作为基因工程菌生产了人类第一个基因工程药物人生长激素释放抑制激素，开辟了药物生产的新纪元。若采用常规方法生产5mg该激素，则需要50万头羊的下丘脑，而用大肠杆菌基因工程法生产同等量生长激素释放抑制激素，则仅需9L（升）细菌发酵液，使其价格隆到每克300美元。如今通过基因工程琳琅满目如生物活性物质酶、激素、疫苗、干扰素、免疫球蛋白、白细胞介素、生长因子、集落刺激因子等。过分依赖抗生素催生超级细菌过分依赖抗生素催生超级细菌噩梦或从此开始噩梦或从此开始最近，“超级细菌”肆虐，据报道，一些赴印度接受治疗的患者感染了一种新型超级细菌，其含有一种叫NDM-1的基因。这种细菌对现有的
6、绝大多数抗生素都“刀枪不入”，甚至对碳青霉烯类抗生素也具有耐药性，而碳青霉烯类抗生素通常被认为是紧急治疗抗药性病症的最后方法。这种变种超级细菌目前已经传播到英国、美国、加拿大、澳大利亚、荷兰等国家，有可能进一步在全世界蔓延。有专家甚至认为，这可能预示着人类抗生素时代的终结。“超级细菌超级细菌”增多新药研制赶不上耐药菌繁殖增多新药研制赶不上耐药菌繁殖有有75%感冒患者使用抗生素，视为感冒患者使用抗生素，视为“万能药万能药”抗菌药的三大不良反应：毒性反应毒性反应过敏反应过敏反应二重感染二重感染毒性反应毒性反应肾脏：氨基糖苷类、多黏菌素类、四环素类、万古霉素、磺胺药等均可导致不同程度的肾脏损害。肝脏
7、：红霉素类、磺胺类、利福平、氯霉素等均可引起肝损害。胃肠道：各类抗菌药物尤其口服给药者均可由药物本身刺激作用引起恶心、呕吐、腹痛、腹泻等反应。神经精神系统：青霉素类可对大脑皮层产生直接刺激，出现肌阵挛、惊厥、癫痫、昏迷等；链霉素、卡那霉素等均可损害第八对脑神经，导致听力或前庭功能损害；氯霉素、普鲁卡因霉素等有时可引起幻觉、幻听、定向力丧失等精神症状。造血系统：氯霉素、磺胺类、头孢菌素类可能引起贫血、再生障碍性贫血。过敏反应过敏反应过敏性休克：青霉素所致者最常见，链霉素所致也较多见，头孢菌素类、红霉素等偶亦可引起。药疹及药物热：多见使用青霉素、链霉素、磺胺药等，药物热可与药疹同时出现，也可单独发
8、生。光敏反应：服药期间在暴露部位出现皮疹，四环素类以及某些喹诺酮类较多见，严重者可出现皮肤红肿、水疱等。血管神经性水肿、血清病样反应：大多由青霉素引起。二重感染二重感染此为应用抗菌药物中出现的新感染，在长期应用广谱抗菌药物的患者中较多见。广谱抗菌药物可抑制人体内敏感菌的生长，导致耐药菌大量繁殖，成为优势菌，此时如各种原发疾病、大手术等使机体免疫功能受损，优势菌就可引起消化道、肺部、尿路、血流等感染，且治疗困难，病死率较高。（二）用于疾病的预防和诊治由于传统的疫苗生产方法对某些疫苗的生产和使用存在着免疫效果不佳、被免疫者有被感染的风险等缺点，较多的基因工程式法生产重组疫苗则可达到安全、高效的目的
9、，现已临床广泛而目前应用的基因重组疫苗有病毒性肝炎疫苗（包括甲肝和乙肝疫苗等）、肠道传染病疫苗（包括零乱和痢疾等）、寄生虫疫苗（包括疟疾和血吸虫等）、流行性出血热疫苗、EB病毒疫苗等。利用细胞工程技术生产单克隆抗体则为利用生物技术进行疾病防治的另一途径。例如：用于治疗肿瘤的“生物导弹”，就是将用于治疗肿瘤的药物与抗肿瘤细胞连接在一起，利用抗原抗体结合的高度专一性，使得抗肿瘤药物集中于肿瘤部位，以达到高效杀伤肿瘤细胞并减少对正常细胞的毒性反应。此外。还可以应用基因工程技术生产诊断用DNA试剂，称为DNA探针，主要用于诊断遗传性疾病和各种传染病等。一种“超级病菌”已经从南亚传入英国，并很可能向全球
10、蔓延抗生素是人类抵御细菌感染类疾病的主要武器。但是，最近，这种武器遭到巨大挑战。医学权威杂志柳叶刀11日刊登的一篇论文警告说，研究者已经发现一种“超级病菌”，它可以让致病细菌变得无比强大，抵御几乎所有抗生素。目前，这种“超级病菌”已经从南亚传入英国，并很可能向全球蔓延（三）用于基因治疗基因治疗（基因治疗（genetherapy）是指将外源正常）是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。也就和异常引起的疾病，以达到治疗目的。也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受
11、体细胞中，使外源基因制造的人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。从广义说，基因治疗产物能治疗某种疾病。从广义说，基因治疗还可包括从还可包括从DNA水平采取的治疗某些疾病的水平采取的治疗某些疾病的措施和新技术。措施和新技术。目前，基因治疗已涉及到恶性肿瘤、遗传病、代谢性疾病、传染病等多种疾病。(一)治疗性基因的获得(二)基因载体的选择(三)靶细胞的选择(四)基因转移方法(五)转导细胞的选择鉴定(六)回输体内基因治疗策略基因治疗策略目的基因的转移在基因治疗中迄今所应用的目的基因转移方法可分为两大类：病毒方法和非病毒方法。基因转移的病毒方法中，RNA和DNA病毒都可用为基因转移的
12、载体。常用的有反转录病毒载体和腺病毒载体。转移的基本过程是将目的基因重组到病毒基因组中，然后把重组病毒感染宿主细胞，以使目的基因能整合到宿主基因组内。非病毒方法有磷酸钙沉淀法、脂质体转染法、显微注射法等。基因治疗的基本步骤目的基因的表达目的基因的表达是基因治疗的关键之一。为此，可运用连锁基因扩增等方法适当提高外源基因在细胞中的拷贝数。在重组病毒上连接启动子或增强子等基因表达的控制信号，使整合在宿主基因组中的新基因高效表达，产生所需的某种蛋白质。安全措施为避免基因治疗的风险，在应用于临床之前，必须保证转移-表达系统绝对安全，使新基因在宿主细胞表达后不危害细胞和人体自身，不引起癌基因的激活和抗癌基
13、因的失活等，尤其是在将反转录载体用于基因转移时，必须在应用到人体前预先在人骨髓细胞、小鼠体内和灵长类动物体内进行类似的研究，以确保治疗的安全性。（四）人类基因组计划从整体上研究人类的基因组，分析人类基因组全部序列以获得人类基因所携带的全部遗传信息。该计划的实施极大地促进了生命科学领域一系列基础研究的发展，进一步阐明基因的结构与功能关系、生命的起源和进化、细胞发育、分化的分子机制及疾病发生的机制等，为人类自身疾病诊断和治疗提供依据，为医药产业带来了翻来覆去的变化。二、解决能源危机、治理环境污染（一）解决能源危机生物能源是最有希望的新能源之一，通过微生物发酵或固定化酶技术，将工、农业废弃物变为沼气
14、或氢气，将是一种取之不尽、用之不竭的能源。应用生物技术，加入能分解蜡质的微生物后，利用微生物分解蜡质使石油流动性增加而获得更多的石油，被称为三次采油。一般认为起驱油作用的是微生物产生的气体和表面活性剂,还有产酸作用、对原油的降解作用。微生物注入地层后,通过间隙水与临近的油滴结合之后运移,微生物吸附于油滴边界,将烃类分子转化成有机溶剂、表面活性剂、酸、醇和气体。有机溶剂溶解于石油,降低其粘度,提高有效渗透率;表面活性剂可降低油与岩石和油与水的界面张力，提高驱油效率,改变岩石润湿性,使岩石更加水湿;消除岩石孔壁油膜,提高油相流动能力;分散乳化原油,降低原油粘度。微生物采油国际国际能源能源网讯：美国
15、加州大学洛杉矶分校的科学家于网讯：美国加州大学洛杉矶分校的科学家于2009年年12月中旬宣布，他们成功开发出一种能将二氧月中旬宣布，他们成功开发出一种能将二氧化碳转化为液体燃料的转基因蓝藻。这种蓝藻能通过光化碳转化为液体燃料的转基因蓝藻。这种蓝藻能通过光合作用消耗合作用消耗二氧化碳二氧化碳并产生并产生异丁醇异丁醇。该研究被认为具有。该研究被认为具有较大的应用价值。较大的应用价值。据介绍，通过基因技术，研究人员首先增加了聚球据介绍，通过基因技术，研究人员首先增加了聚球蓝藻菌中具有吸收二氧化碳作用的蓝藻菌中具有吸收二氧化碳作用的核酮糖二磷酸羧化酶核酮糖二磷酸羧化酶（RuBisCO）的数量。而后又插
16、入了其他微生物的基）的数量。而后又插入了其他微生物的基因以增强其对二氧化碳的吸收能力。通过光合作用，转因以增强其对二氧化碳的吸收能力。通过光合作用，转基因蓝藻就可以产生异丁醇气体。这种气体具有沸点低，基因蓝藻就可以产生异丁醇气体。这种气体具有沸点低，承压能力强的特点，容易从系统中分离。承压能力强的特点，容易从系统中分离。研究人员称，这种新方法有两个优势：第一，它能研究人员称，这种新方法有两个优势：第一，它能回收二氧化碳，有助于减少由燃烧化石燃料所产生的温回收二氧化碳，有助于减少由燃烧化石燃料所产生的温室气体；第二，它能将太阳能和二氧化碳转化为燃料，室气体；第二，它能将太阳能和二氧化碳转化为燃料
17、，并应用于现有的并应用于现有的能源能源设施和大多数汽车上。除此之外，设施和大多数汽车上。除此之外，与其他汽油替代方案相比，这种转基因海藻在转化过程与其他汽油替代方案相比，这种转基因海藻在转化过程中不需要中间步骤，可直接将二氧化碳转化为燃料。中不需要中间步骤，可直接将二氧化碳转化为燃料。把二氧化碳直接转化为液体燃料的细菌把二氧化碳直接转化为液体燃料的细菌（二）保护环境1、微生物脱硫治理空气污染2、运用生物技术处理、净化污水3、应用生物农药控制病虫害4、使用基因工程生产可降解塑料运用生物技术处理、净化污水解决白色污染的替代材料是微生物生产的PHA塑料被称为白色污染，是近年来环境的大敌。以聚乙烯为代
18、表的塑料，在自然条件下极难降解，在土里埋50100年仍旧安然无恙。由于塑料广泛应用于农业生产及日常生活中，造成了这种人工化合物的大量积累。积累在农田中的塑料可导致土壤板结，活力下降，防碍作物生长，可使作物减产2040%。现在人们正在积极寻找可以取代原有塑料的可生物降解的新材料。一类由微生物合成的化合物引起了人们的兴趣，这类化合物为聚-羟基烷酸酯，简称PHA，它们是由许多个-羟基化的饱和脂肪酸聚合而成的。脂肪酸可以是丁酸，戊酸或己酸等。三、改善农业生产、解决食品短缺（一）有利于提高农作物的产量和品质（二）有助于发展畜牧业生产生化武器生化武器是指以细菌、病毒、毒素等使人、生化武器是指以细菌、病毒、
19、毒素等使人、动物、植物致病或死亡的物质材料制成的动物、植物致病或死亡的物质材料制成的武器。作为一种大规模杀伤性武器，至今武器。作为一种大规模杀伤性武器，至今仍然对人类构成重大威胁。它包括生物武仍然对人类构成重大威胁。它包括生物武器和化学武器。器和化学武器。当前和今后的生物武器研究的重点主要表现在如下几方面：一、是毒素类战剂成为研究的热点。毒素是由细菌、微生物、动物、植物和真菌等生物体产生的有毒化学物质，这类战剂又称生物化学战剂，其毒性比现有化学战剂高出1001000倍，并难于检测和核查。二、是运用分子遗传学方法研究和改造各种生物战剂。通过基因重组，使致病的细菌和病毒中接人能抗普通疫苗或药物的基
20、因，使感染者难以治愈；或者在一些非致病微生物体内“插入”致病基因，制造出新的生物战剂。例如，在相中接人炭疽病基因，将眼镜蛇毒液的基因“插入”流感病毒等。三、是研究提高生物战剂杀伤效应的技术。施放方法对生物战剂的杀伤效果影响很大。研究表明，以气溶胶形式施放生物战刘是使用生物武器的主要手段。一些国家很重视提高气溶胶的发生率、稳定性、感染力及控制气溶胶粒度的研究。四、是利用现代生物技术特别是基因工程发展新型生物战剂。生物战剂已经从由自然界筛选致病微生物与毒素发展到利用DNA重组与蛋白质工程技术改造、构建新的致病微生物和毒素的阶段。第2章基因工程基因工程的特点基因工程的特点1.打破了物种的界限打破了物
21、种的界限,突破了亲缘关系的限制突破了亲缘关系的限制可以大大加快变异的程度，例如,通过基因工程技术,可使人的生长激素基因在大肠杆菌中进行表达,从而通过微生物发酵来获得人生长激素。2.可进行定向变异和育种可进行定向变异和育种这也是普通微生物遗传学方法所做不到的，例如,可以将固氮微生物的基因引入到非豆科植物中,从而创造出能够固氮的非豆科作物。3.可创造出自然界中原本没有的生可创造出自然界中原本没有的生物基因工程的主要操作步骤基因工程的基本操作1.目的基因的取得目的基因的取得选择目的基因的途径有3种：选择适宜的给体细胞,以便从中采集分离到有生产意义的目的基因；通过反转录酶的作用由mRNA合成cDNA(
22、互补DNA)；用化学方法合成特定功能的基因。通过PCR把目的基因扩增出来选择适宜的给体细胞,以便从中采集分离到有生产意义的目的基因；通过反转录酶的作用由mRNA合成cDNA(互补DNA)；用化学方法合成特定功能的基因。通过PCR把目的基因扩增出来动画原理2.选择载体选择载体载体必须具备下列几个条件:是一个有自我复制能力的复制子;能在受体细胞内大量增殖,有较高的拷贝数最好只有一个限制性内切酶的切口,使目的基因能固定地整合到载体DNA的一定位置载体上必须有一种选择性遗传标记,如具有四环素、氨苄青霉素等的抗性基因,以便及时把极少数“工程菌”选择出来。载体的种类载体的种类微生物基因工程所用的载体微生物
23、基因工程所用的载体大肠杆菌质粒大肠杆菌质粒穿梭质粒载体噬菌体载体植物基因工程所用的载体植物基因工程所用的载体植物病毒DNA载体已用于构建植物载体的有双链病毒花椰菜花叶病毒(CaMV)，单敛病毒番茄金黄花叶病毒(TGMV),非洲木薯花叶病毒(ACMV),玉米线条病毒(maizestreakvirusMSV)，小麦矮缩病毒(WDV),以及RNA病毒雀麦草花叶病毒(BMV),大麦条纹花叶病毒(BSMV),蕃茄丛矮病毒(TBSV),马铃薯X病毒(PVX),烟草花叶病毒(TMV),烟草蚀刻病毒(TEV),李痘病毒(PPV)等.构建植物病毒克隆载体的基本策略是对病毒DNA(包括RNA反转录的DNA)进行加
24、工,消除其对植物的致病性,保留其通过转导或转染能进入植物细胞的特性,使携带的目的基因导入植物细胞.植物基因克隆的载体Ti质粒（1）Ti质粒的结构和特性致癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)含有一种内源质粒,当农杆菌同植物接触时,这种质粒会引发植物产生肿瘤(冠瘿瘤),所以称此质粒为Ti质粒(tumorinducingplasmid)。能进入植物细胞的只是一小部分，约25kb，称为T-DNA(transferDNA)。T-DNA左右两边界（LB，RB）各有一个25kb长的正向重复序列（LTS和RTS），对T-DNA的转移和整合是不可缺少的。动物基因工程所用的载体动物基因工程
25、所用的载体目前用于构建克隆载体的动物病毒有目前用于构建克隆载体的动物病毒有痘苗病毒痘苗病毒,腺腺病毒病毒,杆状病毒杆状病毒,猿猴空泡病毒和反转录病毒猿猴空泡病毒和反转录病毒等等.柯斯质粒载体柯斯质粒（cosmid）是一类由人工构建的含有DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。1柯斯质粒载体的组成柯斯质粒的大小为46kb，这类质粒的基因组都由三部分成。一个抗药性标记和一个质粒的复制起始部位。一个或多个限制酶的单一切割位点。一个带有噬菌体的粘性末端片段。柯斯质粒载体的特点：有以下三个方面的特点：第一，具有噬菌体的特性。第二，具有质载体的特性。第三，具有高容量的克隆能力。人工染色体克隆载
26、体人工染色体克隆载体人工染色体载体实际上是一种人工染色体载体实际上是一种“穿梭穿梭”载体，含有质粒载体所必载体，含有质粒载体所必备的第一受体（备的第一受体（大肠杆菌）内源质粒复制起始位点（大肠杆菌）内源质粒复制起始位点（ori），），还还含有含有第二受体（如酵母菌）染色体第二受体（如酵母菌）染色体DNA着丝点，端粒和复制起始着丝点，端粒和复制起始位点的序列，位点的序列，以及合适的选择标记基因。这样的载体与目的以及合适的选择标记基因。这样的载体与目的DNA片段重组后，在第一受体细胞内按质粒复制形式进行高拷贝复制，片段重组后，在第一受体细胞内按质粒复制形式进行高拷贝复制，再转入指点二受体细胞，按染
27、色体再转入指点二受体细胞，按染色体DNA复制的形式进行复制和传复制的形式进行复制和传递。筛选第一受体的转化子，一般采用抗菌素抗性选择标记；而递。筛选第一受体的转化子，一般采用抗菌素抗性选择标记；而筛选第二受体的转化子，常用与受体互补的营养缺陷型。筛选第二受体的转化子，常用与受体互补的营养缺陷型。与其他与其他的克隆载体相比，人工染色体载体的特点是能容纳长达的克隆载体相比，人工染色体载体的特点是能容纳长达1000kb甚至甚至3000kb的外源的外源DNA片段片段，主要用于构建基因组文库，也可，主要用于构建基因组文库，也可用于基因治治疗和基因功能鉴定。用于基因治治疗和基因功能鉴定。酵母人工染色体（酵
28、母人工染色体（YAC）是早期构建的人工染色体是早期构建的人工染色体克隆载体，克隆载体，将含有酵母染色体的将含有酵母染色体的DNA端粒（端粒（TEL），），DNA复制起点复制起点（ARS）和着丝粒（和着丝粒（CEN）以及必要的选择标记（以及必要的选择标记（HISA4和和TRP）基因和多克隆位点（基因和多克隆位点（MSC）的）的DNA片段克隆到片段克隆到pBR322中，中，构建成构建成YAC载体，载体，表达载体表达载体诱导型表达载体诱导型表达载体诱导型表达载体指启动子必须在特殊的诱导条件诱导型表达载体指启动子必须在特殊的诱导条件下才有转录活性或比较高的转录活性的表达载体。下才有转录活性或比较高的转
29、录活性的表达载体。外源基因处于这样的启动子下，必须在合适的诱外源基因处于这样的启动子下，必须在合适的诱导条件下才能表达。目前用作诱导型的启动子有导条件下才能表达。目前用作诱导型的启动子有二价金属离子诱导启动子，红光诱导启动子，热二价金属离子诱导启动子，红光诱导启动子，热诱导启动子和干旱诱导启动子等。诱导启动子和干旱诱导启动子等。组织特异性表达载体组织特异性表达载体在较高等的真核生物中，有一类特殊的调控序列（启动在较高等的真核生物中，有一类特殊的调控序列（启动子等）可以调控基因只能在一定的组织中才进行有效的子等）可以调控基因只能在一定的组织中才进行有效的表达。先用这样的调控序列可以构建一系列组织
30、特异性表达。先用这样的调控序列可以构建一系列组织特异性表达载体，为研究动植物以育和人类基因治疗等提供了表达载体，为研究动植物以育和人类基因治疗等提供了有效的手段。目前已构建的组织特异性表达载体有乳腺有效的手段。目前已构建的组织特异性表达载体有乳腺组织特异性表达载体，肿瘤细胞特异性表达载体，神经组织特异性表达载体，肿瘤细胞特异性表达载体，神经组织特异性表达载体，花药特异性表达载体和种子特异组织特异性表达载体，花药特异性表达载体和种子特异性表达载体等。性表达载体等。反义表达载体反义表达载体反义核酸技术是目前人工干预基因表达的一项反义核酸技术是目前人工干预基因表达的一项重要技术，它利用人工合成或重组
31、的与靶基因重要技术，它利用人工合成或重组的与靶基因互补的一段反义互补的一段反义DNA或或RNA片段，特异性地与片段，特异性地与靶基因结合，达到封闭其表达的目的。此技术靶基因结合，达到封闭其表达的目的。此技术已成为基因治疗的重要手段，其中构建反义表已成为基因治疗的重要手段，其中构建反义表达载体就可能在靶细胞内直接产生致病基因的达载体就可能在靶细胞内直接产生致病基因的反义反义RNA片段。将获得的致病基因反向组入表片段。将获得的致病基因反向组入表达载体，即可构建成反义表达载体。当反义表达载体，即可构建成反义表达载体。当反义表达革体导入靶细胞后，就可转录出与致病基因达革体导入靶细胞后，就可转录出与致病
32、基因mRNA互补的反义互补的反义RNA，特异性地封闭致病基特异性地封闭致病基因的表达。因的表达。3.目的基因与载体目的基因与载体DNA的体外重组的体外重组对目的基因与载体DNA均采用限制性内切酶处理,从而获得互补粘性末端或人工合成粘性末端。然后把两者放在较低的温度(56)下混合“退火”。由于每一种限制性内切酶所切断的双链DNA片段和粘性未端有相同的核苷酸组分,所以当两者相混时,凡粘性末端上碱基互补的片段,就会因氢键的作用而彼此吸引,重新形成双链,这时,在外加连接酶的作用下,供体的DNA片段与质粒DNA片段的裂口处被“缝合”,形成一个完整的有复制能力的环状重组体嵌合体。连接的几种方法通过粘性末端
33、连接平末端连接3.DNA接头（adpater）连接法，是一种具BamHI粘性末端的典型的有粘性末端的新的DNA分子而易于连接重组。衔接物连接法所谓衔接物（linker）是指用化学方法合成的一段由1012个核苷酸组成，具有一个或数个限制酶识别位点的平齐末端的双链寡聚核工业苷酸片段。4.重组载体导入受体细胞重组载体导入受体细胞体外反应生成的重组载体只有将其引入受体细胞后,才能使其基因扩增和表达。受体细胞可以是微生物细胞,也可以是动物或植物细胞。目前使用最广泛的是微生物细胞E.coli。其次为枯草杆菌和酿酒酵母。把重组载体DNA分子引入受体细胞的方法很多。若以重组质粒作载体时,可以用转化的手段;若以
34、病毒DNA作重组载体时,则用感染的方法。在理想情况下,上述重组载体进入受体细胞后,能通过自主复制而得到大量扩增,从而使受体细胞表达出供体基因所提供的部分遗传性状,受体细胞就成了“工程菌”。导入的几种方式转化：以质粒为载体，将携带外源基因的载体DNA导入受体细胞。电脉冲(电转化)原理：电穿孔是一种方法，利用控制的电流脉冲，使活细胞的细胞膜产生孔道，该孔道是暂时的、可逆的。形成的孔道容许大分子物质，如：DNA、蛋白质、染料或代谢物进入细胞。用途：通过电击可以使大肠杆菌或哺乳动物细胞穿孔。动画原理转染：以噬菌体为载体，用DNA连接酶使噬菌体DNA环化，再通过质粒转化方式导入受体菌。这里所用的噬菌体D
35、NA并没有包上它的外壳感染：以噬菌体为载体，在体外将噬菌体DNA包装成病毒颗粒，使其感染受体菌。这里所用的噬菌体DNA被包上了它的外壳，不过这外壳并不是在噬菌体感染过程中包上，而是在离体情况下包上的，所以称为离体包装。注射:如果宿主是比较大的动植物细胞则可以用注射方法把重组DNA分子导入2.4.1受体细胞选择受体细胞时应重点考虑以下几点:安全性高，不会对外界造成生物污染；便于重组DNA分子的导入；便于筛选克隆子；重组DNA分子在受体细胞内能稳定维持；适于外源基因的高效表达，表达产物的分泌或积累；具有较好的翻译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达；对遗传密码的应用上无明显偏倚性；遗传性稳定，易
36、于扩大培养或发酵；在理论研究或生产实践上有较高的应用价值。2.4.2.1外源DNA转化法：（1）直接转化法有的微生物细胞在不加任何处理的情况下就能直接摄取外源DNA，只要外源DNA与这样的细胞混合，在适宜的条件下悬浮培养，就能完成外源DNA的转化。（2）化合物诱导转化法用二价阳离子（Mg2+、Ca2+、Mn2+）处理某些受体细胞，可以使其成为感受态细胞，即处于能摄取外源DNA分子的生理状态的细胞。（3）接合转化法接合转化是通过供体细胞同受体细胞间的直接接触而传递外源DNA的方法。该转化系统一般需要三种不同类型的质粒，即接合质粒、辅助质粒和运载质粒（载体）。这三种质粒共存于同一宿主细胞，与受体细
37、胞混合，通过宿主细胞与受体细胞的直接接触，使运载质粒进入受体细胞，并在其中能稳定维持。（4）微弹轰击转化法微弹轰击转化法又称基因枪转化法，这是利用高速运行的金属颗粒轰击细胞时，将包裹在金属颗粒表面的外源DNA分子随金属颗粒进入细胞的转化方法。基因枪法简单快速，可直接处理植物组织，接触面积大，并有较高的转化率。（5）激光微束穿孔转化法是利用直径很小，能量很高的激光微束照射受体细胞，可导致细胞膜的可逆性穿孔。根据这一原理，在荧光光源进行照射，导致细胞膜穿孔，处于细胞周围的外源DNA分子随之进入细胞。（6）超声波处理转化法超声波处理细胞时可击穿细胞膜并形成过膜通道，使外源DNA进入细胞。超声波处理转
38、化法的转化率较高，并且利用超声波处理可以避免使用电穿孔转化时高电压脉冲对细胞的损伤，有利于细胞存活。（7）脂质体介导转化法脂质体是由磷脂双分子层组成的人工膜状结构，可以将DNA包在其内，并通过脂质体与原生质体的融合或原生质体和吞噬过程，把外源DNA转运到细胞内，此方法的优点是包在脂质体内的DNA可免受细胞内核酸酶的降解，所以可直接转化外源DNA。（8）花粉管通道转化法此方法只用于植物。植物授粉过程中，将外源DNA涂在柱头上，使DNA沿花粉管通道或传递组织通过珠心进入胚囊，转化还不具正常细胞壁的卵、合子及早期的胚胎细胞。（9）精子介导法精子介导的基因转移是指精子同外源DNA共浴后再给卵子受精，使
39、外源DNA通过受精过程进入受精卵并整合于受体的基因组中。（10）磷酸钙转染法磷酸钙转染法的依据是有的动物细胞能捕获黏附在细胞表面的DNA-磷酸钙沉淀物，使DNA转入细胞。基本操作过程：将待转染的外源DNA同CaCl2混合制成CaCl2-DNA溶液，逐滴加入到不断搅拌的Hepers-磷酸钙溶液中，形成DNA-磷酸钙共沉淀复合物；然后用吸管将沉淀复合物黏附在哺乳动物单层培养细胞的表面上；保温几小时后，用新鲜培养液洗净细胞，再用新鲜培养基继续培养，直至外源基因表达。2.4.2.2病毒（噬菌体）颗粒转导法用病毒（噬菌体）DNA（或RT-DNA）构建的克隆载体或携带目的基因的克隆载体，在体外包装成病毒（
40、噬菌体）颗粒后，感染受体细胞，使其携带的重组DNA进入受体细胞。重组子的筛选7.2组体克隆的筛选与鉴定目前已经发展和应用了一系列构思巧妙，可靠性较高的重组体克隆检测法，包括使用特异性探针的核酸杂交法，免疫化学法，遗传检测法和物理检测法等。7.2.11遗传检测法根据载体分子表型特征选择生组体分1.子的直接选择法抗药性标记插入失活选择法2.4.3克隆子的筛选2.4.3.1根据载体选择标记基因筛选转化子(1)根据载体抗生素抗性基因和相应的选择药物筛选转化子(2)根据载体除草剂抗性基因和相应的选择药物筛选转化子由于植物细胞对多数抗生素不敏感,所以常用抗除草剂的蕾作为选择标记基因.基因编码磷化乙酰转移酶
41、(PAT),使转化子对含有磷化麦黄酮(PPT)成分的除草剂具有抗性.(3)根据lacZ基因互补显色筛选转化子(4)根据生长调节剂非依赖型筛选转化子这类选择标记基因产物是激素合成必需的酶类,离体培养不含这类选择基因的细胞时,必须添加外源激素,而含有这类选择标记基因的转化子能合成激素,变为激素自养型.因此在培养基中不添加外源激素的情况下,只有转化子才能生长.此类选择标记基因常用于筛选植物转化子.这样的基因如色氨酸单加氧酶基因(iaaM)和吲哚乙酢胺水解酶基因(iaaH),其表达产物可将色氨酸转化为吲哚乙酸.(5)根据核苷酸合成代谢相关酶基因的缺失互补筛选转化子胸腺核苷激酶基因(tk).二氢叶酸还原
42、酶基因(dhfr),及次黄呤一鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因(hgprt),等的表达产物直接参与核苷酸合成代谢.这些基因缺失的缺陷型细胞因核苷酸合成代谢失调而死亡,只有在添加某些核苷酸的培养基中才能生长.如果用这样的缺陷型细胞作为受体细胞,导入含有这些基因的外源DNA,补充原来缺失的基因,使核苷酸合成代谢恢复正常,可以在不添核苷酸的培养基中正常生长.根据这一性质可以在不添加核苷酸的培养基中筛选出转化子.此方法主要用于筛选动物转化子.2.4.3.2根据报告基因筛选转化子作为报告基因,其表达产物应是便于检测,定量和灵敏度高的基因.(1)-葡醛糖酸酶基因(gus)(2)萤火虫荧光素酶基因(luc)gus表
43、达产物萤火虫荧光素酶(LUC)在Mg2+的作用下,可以与荧光素和ATP底物发生反应,形成与酶结合的腺苷酸荧光素酰化复合物,经过氧化脱羧作用后,该复合物转变成为处于激活状态的氧化荧光素,可以用荧光测定仪快速灵敏地检测出产生的荧光,是目前研究动植物转基因很好用的一种报告基因.(3)绿色荧光蛋白基因(gfp)当绿色荧光蛋白暴露于395nm波长的灯光下,便会被激发出绿色荧光,因此可作为报告基因.水母绿色荧光蛋白基因已广泛地用于筛选动植物的转化子.2.4.3.3根据形成噬菌斑筛选转化子2.5重组子的鉴定2.5.1根据重组DNA分子特征鉴定重组子.2.5.1.1根据重组DNA分子大小鉴定重组子2.5.1.
44、2根据重组DNA分子限制性内切核酸酶酶切图谱鉴定重组子2.5.1.3根据PCR扩增片段鉴定重组子2.5.1.4采用DNA杂交法鉴定重组子2.5.1.5应用DNA芯片鉴定重组子2.5.1.6根据DNA核苷酸序列鉴定重组子TTCCACTGGACATAAATCCCCCAAGATTCATACTTATAAATACCCTTGAAAAGAACCAAAGAACCATCCATCAAGAATGAAGATTACAGGCTATAAATACATAGACATCATGATCCAACTATCCCCATTGTTGCTACTCCCATTATTCTCAGTATTCAACTCCATTGCTGATGCTTCAACTGAATACCTTA
45、GACCTCAAATCCATTTAACCCCAGATCAAGGTTGGATGAATGATCCGAATGGGATGTTTTATGATAGGAAAGACAAGTTATGGCATGTTTATTTCCAACATAATCCAGATAAGAAATCAATTTGGGCTACACCTGTCACTTGGGGTCATTCCACTTCAAAAGATTTATTAACTTGGGATTATCACGGTAATGCATTAGAACCTGAAAATGATGATGAAGGTATCTTTTC2.5.2根据目的基因转录产物(mRNA)鉴定重组子.2.5.3根据目的基因翻译产物(蛋白质、酶、多肽)鉴定2.5.3.1蛋白质凝胶电泳法鉴定
46、重组子重组子由于含有外源基因,如果能够正确表达,在总的表达产物中增加了外源基因表达的多肽(蛋白质),所以从重组子中提取的总蛋白质进行凝胶电泳时,电泳图谱上会出现新的蛋白带,根据这一现象就可以初步鉴定是重组子.2.5.3.2免疫检测法鉴定重组子(1)酶联免疫吸附法(ELISA)(2)Westhern印迹法(3)免疫沉淀测定法(immuno-precipitationtest)(4)固相放射性免疫测定(RIA)法细胞工程3-1细胞工程基本介绍。细胞工程细胞工程（cellengineering）是指应用现代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的理论与方法，按照人们的需要和设计，在细胞水平上的遗
47、传操作，重组细胞的结构和内含物，以改变生物的结构和功能，即通过细胞融合、核质移植、染色体或基因移植以及组织和细胞培养等方法，快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。细胞工程的基本操作(三大技术即无菌操作技术,细胞培养技术,细胞融合技术)。1无菌操作技术：就是细胞工程的所有实验却要求无菌条件下进行。对人消毒。对实验室内一切用品消毒。对周围环境保持清洁。2，细胞培养技术：是指动植物和微生物细胞在体外无菌条件下的保存和生长。该技术的主要流程是：取材和除菌。细胞培养基的配制（配制灭菌接种）。最佳条件下进行培养（温度，湿度，光照，氧气，CO2）收获或传代。3，细胞融合技术：就是两个或多个细胞相
48、互接触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并，染色体等遗传物质重组的过程。细胞融合的技术流程：原生质体的制备（对微生物或植物细胞去除胞壁）。诱导细胞融合常田聚乙二醇（PEG）或电激方法进行细胞融合。原生质体的再生融合后的细胞涂布在某种特殊培养基上，让细胞壁再生。杂合细胞的筛选（把生壁的培养物涂在筛选培养基上，杂合细胞生长，未融合细胞不长。3-2植物细胞工程一.植物组织培养定义：组织培养是在无菌和人为控制外因（营养成分，光，温，湿）条件下培养，研究植物组织器官，甚至从中分化，发育出整体植物的技术。植物组织培养的理论依据就是：植物细胞具全能性。植物组织培养流程：1预备阶段外植体的选择大小要适宜，选
49、择部位要准确，一般是幼嫩组织和器官，如芽尖或根尖。除菌外植体自来水多次漂洗消毒剂处理无菌水反复冲洗无菌滤低吸干(动画)适宜培养基的配制。2去分化阶段的诱导。外植体是已分化成各种器的切段，故必让这些器官去分化，使各细胞重新处于旺盛有丝分裂的分生状态，一般在培养基中添加较高浓度的生长素类激素。3继代增殖：愈伤组织长出后经4-6周的细胞迅速分裂，原有培养基中的水分及营养成分已被耗光，有害代谢物积蓄，必须进行移植，继代。4生根成芽：愈伤组织只有经过就分化才能形成胚状体，继而长成小植株.胚状指的是在组织培养中分化产生的具有芽端和根端类似合子胚的构造，通常要将愈伤组织移置于合适是细胞分裂类和生长类的分化培
50、养基中，才能诱导胚状体的生成。光照是本阶段的必备外因。5移栽成活：把长在人工照明玻璃瓶内的小苗移室外以利于生长此时保证适度的光温，湿度条件。动画原理二植物细胞培养悬浮细胞培养和固定化细胞培养和次生代谢物的生产。植物次生代谢物（plantsecondarymetabolites）是指植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物.植物次生代谢物种类繁多，化学结构迥异。现在，已知大约有10，000种次生代谢物，包括酚类、黄酮类、香豆素、木脂素、生物碱、糖苷、萜类、甾类、皂苷、多炔类、有机酸等，可分为酚性化合物、萜烯类化合物、含氮有机物三大类。植物次生代谢物的应用，以医药为例，至今人们依赖于从
51、植物中提取的重要的药物就有五十多种。随着“重返大自然”的呼声日益高涨，人们已认识到：现在是从高等植物的次生代谢产物中去寻找、开发新药的时代。1药用植物次生代谢产物药用植物次生代谢产物是指药用植物体内的一大类化合物，它们是细胞生命活动或植物生长发育正常运行的非必需的小分子化合物，其产生和分布通常有种属、器官、组织以及生长发育时期的特异性。不同药用植物的次生代谢产物的合成和积累经常在不同的部位，薄荷属植物次生代谢产物积累在油腺等特殊的结构当中，还有青蒿中的青蒿素的合成和储藏均在腺体特异细胞器中进行。药用植物次生代谢物种类繁多，结构迥异。这些次生代谢产物可分为苯丙素类、醌类、黄酮类、单宁类、类萜、甾
52、体及其甙、生物碱七大类。还有人根据次生产物的生源途径分为酚类化合物、类萜类化合物、含氮化合物（如生物碱）等三大类，据报道每一大类的已知化合物都有数千种甚至数万种以上。2.药用植物细胞培养技术在次生代谢产物的生产中，药用植物细胞培养技术是通过给予体外生长的植物细胞一定的营养条件，使其生长，并根据植物或植物不同组织的细胞调节生长条件来获取所需的次生代谢产物的生物技术。由于植物体内的任何一个细胞都包含有整体植物全部的遗传信息，在一定条件下具有发育成一个完整植株的能力，所以通过细胞培养技术可得到药用植物的次生代谢产物。用药用植物细胞培养技术生产次生代谢产物有很大潜力。首先次生代谢产物是在完全人工控制的
53、条件下生产的，可一年四季不断进行，不受地区和季节限制，节约土地，较便于工业化生产。其次，通过改变培养条件和选择优良系的方法可得到超越原植物产量的代谢物，例如通过新疆紫草的细胞培养获得了比原植株含量高6倍的紫草素。再者，药用植物的细胞培养是在无菌条件下完成的，因此可排除病菌及虫害对药用植物的侵扰。我们还可以对有效成分的合成路线进行遗传操作，以提高所需的次生代谢产物含量，也可以进行特定的生物转化反应，大规模生产我们所需的有效次生代谢产物。为了探索新的合成路线和获得新的化合物，可以往组织培养物中加入一种前体，以产生正常情况下原植物所不含的底物，甚至是至今在自然界还没有的化合物。如植物组织培养选择出来
54、的毛花洋地黄品系能使毛地黄毒苷或其6甲基衍生物在C12位置羟基化而转化成地高辛或6甲基地高辛，通过这种细胞悬浮培养物的生物转化，能迅速有效地几乎全部转化成更有医药价值的强心剂地高辛。3.药用植物细胞培养生产次生代谢产物的研究进展到了90年代，国内的药用植物细胞培养技术取得了很大的进展，新疆紫草、人参的细胞培养进入了工业化生产，水母雪莲等进入了中试，其他如黄连、银杏等多种药用植物的细胞培养也十分成功。到目前为止，已经从400多种药用植物中建立了组织和细胞培养物，从中分离出600多种代谢产物。在我国，许多重要药用植物如人参、西洋参、丹参、紫草、甘草、黄连等的植物细胞培养都十分成功，且人参、新疆紫草
55、细胞培养所达到的技术已接近了国际先进水平。1悬浮培养系统：，缺点次生代谢产物积聚少。2固定化细胞培养系统：细胞固定化是将细胞包埋在性支持物的内部或贴付在它的表面。其前提就是通过悬浮培养获得足够数量是细胞。常见的固定化细胞培养系统有两类；平床培养系统：本系统由培养床，贮液缸和蠕动泵构成。缺点：占地面积大。立柱培养系统：本方法将植物细胞与琼脂或藻酸钠混合。制成一个个123的细胞团块，并将它们集中于细菌立柱中（扫描70页）动画原理三植物细胞原生质体制备与融合原生质体去除全部细胞壁的细胞。原生质球或球状体是在酶解过程中残存少量细胞壁的原生质体。1原生质体的制备（取材和除菌酶解分离洗涤鉴定）（用过滤把原
56、生质体和残留组织块和破碎细胞分离）取材和除菌原则上植物任何部位的外植体都可成为制备原生质体的材料。但人们往往对活跃生长的器官和组织更感兴趣，因为由此制得的原生质体一般都生活力较强，再生与分生比例较高，常用的外植体包括：幼根、子叶、下胚轴、胚细胞、花粉母细胞、悬浮培养细胞和嫩叶。酶解由于植物细胞和细胞壁含纤维、半纤维、本质素以及果胶质等成分，因此市售的纤维素酶实际上大多是含多种成分的复合酶。分离在反应液中除了大量的原生质体外，尚有一些残留的组织块和破碎的细胞。为了取得高纯度的原生质体就必需进行原生质体的分离，可选取200400目的不锈钢网或尼龙布进行过滤除渣，也可采用低速离心法或比重漂浮法直接获
57、取原生质体。洗涤刚分离得到的原生质体往往还含有酶及其他不利于原生质体培养、再生的试剂，应以新的渗透压稳定剂或原生质体培养液离心洗涤24次。鉴定只有经过鉴定确认已获得原生质体后才能进行下阶段的细胞融合工作。如果把它放入低渗溶液中，则很容易胀破，也可用荧光增白剂染色后置荧光显微镜下观察，残留的细胞壁呈明显荧。通过以上观测，基本上可判别中否原生质体及其百分率。2原生质体的融合（有化学法诱导融合和电极法诱导融合（1）化学法诱导融合：混合双亲原生质体滴加PEG溶液，摇匀，静置滴加高钙高PH值溶液，摇匀，静置滴加原生质体细胞团筛选，再生杂合细胞。（2）电激融法：将双亲原生质体的适当的溶液悬浮混合后，插入微
58、电极，接通一类的高变电。原生质体极化后顺着电场排列成紧密接触的珍珠串状。此时瞬间施以适当的电脉冲，别使原生质体质膜被穿而发生融合。动片原理3杂合体的鉴别与筛选：双亲本原生质体经融合处理后产生的杂合细胞，一般要经合有渗透压稳定剂的原生质体培养基培养，再生出细胞壁后转移到合适培养基中，待长出愈伤组织后按常规方法诱导其长芽，生根，成苗。鉴别杂合体的方法有四种（显微镜鉴别，互补法筛选，细胞分子生物学鉴别，根椐植株形态特征鉴别。）显微镜鉴别根据以下牲特征可以在显微镜下直接识别杂合细胞:若一方细胞在,另一方细胞小,则大、小细胞融合的就是杂合细胞;若一方细胞基本无色,另一方为绿色,则白绿色结合的细胞是杂合细
59、胞质;如果双方原生质体在特殊显微镜下或双方经不同染料着色后可见不同的特征,则可作为识别杂合细胞的标志。互补法筛选遗传互补法的前提是获得各种遗传突变细胞株系。假如某个细胞株具某种抗性（如抗青霉素），另一个细胞株具另一种抗性（如抗卡那霉素)，则它们的杂合株将可在含上述两种抗生素的培养基上再生与分裂，这种筛选方式即所谓的抗性互补筛选。细胞分子生物学鉴别经细胞融合后长出的愈伤组织或植株，可进行染色体核型分析、染色体显带分析、同工酶分析以及更为精细的核酸分子杂交、限制性内切酶片段长度多态性和随机扩增多态性DNA（RAPD）分析。根椐植株形态特征鉴别四.单倍体植物的诱发与利用单倍体生物是指细胞中仅含一组染
60、色体的个体。单倍体植物比单倍体动物多见。单倍体植物与正常二倍体植物相比，叶小、株矮、生活力弱，且高度不育，然而由于它们种质纯，不受显性等位基因的掩盖与遮蔽效应影响，人们易于从中挑选出具有可用性状的陷性突变体，所以其经济意义十分显著。在育种中培植利用单倍体生物，然后加倍获得正常二倍体植株的设想。在自然界中偶尔也能见到天然诱发的单倍体植株。它们通常经以下途径发育而成：（1）孤雌繁殖途径植物卵细胞不经受精而发育成单倍体胚，继而长成单倍体植物。（2）孤雄繁殖途径精子进入胚囊后不与卵细胞受精而独自发育成单倍体胚，再发育成株，卵细胞退化消失。（3）无融合生殖精卵结合后，不仅受精卵发育，由于某种原因，助细胞
61、或反足细胞也与受精卵形成的二倍体胚同步发育成单倍体胚，形成双胚或多胚种子。自发产生单倍体植株的机率很低，小于千分之一，现在已经可以通过实验室诱导，大量培育出符合需要的单倍体植株。（一）花药培养（1）选取成熟度适中的花蕾或幼穗所谓成熟度适中是指花蕾或幼穗中的花粉正处于形成营养细胞和生殖细胞的阶段（对多数植物而言）。过早或过迟的花粉效果多不理想。（2）花药预处理花药经无菌操作从上述材料中取出后，经下述方法之一进行预处理：用甘露醇或其他糖、无机盐配成的高渗溶液（约25%的质量浓度）处理68min，或者低速（2000r/min）离心30min，将有利于单倍体愈伤组织的形成；低温（410）或高温（35）
62、处理220天，可明显提高某些植物单倍体胚的比例；零磁处理利用航天器将培养中的花药送入太空一段时间（几天）后再回收有助于获得高质量的愈伤组织及其再生苗。（3）选择适当的培养基与培养条件花药培养基大体有两种类型。对多数植物而言，在愈伤组织培养基中一般已添加适量的生长素类激，如2，4-D，奈乙酸或吲哚丁酸等，花药可以在这种培养基中去分化而长成愈伤组织，但通常不会长成单倍体植株；但有些植物，如烟草、曼陀罗等则只需在简单的蔗糖和无机盐培养基上即可完成从花粉去分化、单倍体胚的形成乃至单倍体植株的长出这一完整的过程。无论哪种情况，在培养基中加入适量的脯氨酸或羟脯氨酸，对促进单倍体愈伤组织的形成都有明显的作用
63、。适当密植花药是必要的。无论是长出愈伤组织还是单倍体胚，都应像组织培养那样，适时转移至添加细胞分裂素激素的分化培养基中，以利植株生成。（二）花粉培养由于花药培养时一些二倍性的花药壁细胞亦形成愈伤组织,从而增加了培育单倍体植株的难度.（三）未授粉子房或胚珠的培养子房,胚珠中的成熟胚囊由6个单倍体细胞(包括1个卵细胞)和1个具有2个极核的中央细胞构成。理论上这6个单倍体细胞都可能发育成单倍体植株。（四）杂交法获单倍体植株杂交，特别是远缘朵交，杂种胚在胚胎发育这程中往往会将一方亲本的染色体逐步排除，最终将得到仅含一方染色体的单倍体植物。（五）单倍体培养的加倍我们之所以要得到单倍体培养物（愈伤组织、幼
64、胚以及植株），其目的是为了对它们进行染色体加倍，从而获得所谓“纯系”的二倍植物。在诱发单倍体植株的各阶段（形成愈伤组织、幼胚及小苗），都可用0.2%0.4%秋水仙素处理2448h,然后按常规途径培养,即可能得到染色体加倍的能正常开花、结果的二倍体植株。五.人工种子的研制人工种子即人为制造的种子，它是一种含有植物胚状体或芽、营养成分、激素以及其分成分的人工胶囊。（一）人工种子的构成及特点人工种子由以下三部分构成：（1）人工种皮（2）人工胚乳（3）胚状体人工种子具有以下突出的优点：可以不受环境因素制约，一年四季进行工厂化生产；由于胚状体是经人工无性繁育产生，因此有利于保存该种系的优良性状；与试管苗
65、相比，人工种子成本更低，更适合于机械化田间播种；可根据需要在人工胚乳中添加适量的营养物、激素、农药、抗生素、除草剂等，以利于胚状体的健康生长。但人工种子仍有一些关健技术尚未攻克。如：人工种皮的性能尚不尽人意；还未找到一种符合多数物种需用要的人工胚乳；胚状体如何让它处于健康的休眠状态；人工种子怎样做到既延长其保存时间又不明显降低萌发率等。（二）人工种子的制备（1）胚状体的制备及其同步生长低温法：在细胞培养的早期对培养物进行适当低温处理若干小时。由于低温阻碍了微管蛋白的合成，纺锤体形成受阻，所以滞留于有丝分裂中期的细胞增多。此时再让培养物回复到正常温度，细胞则同步分裂。分离法：在细胞悬浮培养的适当
66、时期，用一定孔径的尼龙网或钢丝网或密度梯度离心法，收取处于胚胎发育某个阶段的胚性细胞团，然后转移到无生长素的培养基上，使多数胚状体同步正常发育。通气法：有人发现，在细胞悬浮培养液中每天通入氮气或乙烯12次，每次几秒或更长时间，可显著提高有丝分裂同步率。渗透压法：随着植物胚状体的发育，其渗透压值呈现规律性的从高到低的变化。（2）人工胚乳的制备人工胚乳的营养需求因种而异，但与细胞，组织培养的培养基大体上相仿，通常还要配加一定量的天然大分子碳水化合物（淀粉，糖类）以减少营养物泄漏。（3）配制包埋剂及包埋褐藻酸钠是目前最好的人工种子包埋剂，它无毒、使用方便，具有一定的保水、透气性能，价格较低，经CaC
67、l2离子交换后，机械性能较好。其次是琼脂、白明胶等，通常以人工胚乳溶液调配成4的褐藻酸钠，再按一定比例加入胚状体，混匀后，逐滴滴到2.0%2.5%CaCl2溶液中。（三）人工种子的贮存与萌发人工种子的贮存与萌发是迄今尚未攻克的难关，一般要将人工种子保存在低温（47）和干燥（相对湿度小于67%）条件下。但这种贮存方式的费用是昂贵的，自然条件下人工种子的贮存时间较短，萌发率较低。动原理片3-3动物细胞工程定义：动物细胞工程主要从细胞生物学和分子生物学的层次根据人类的需要，一方面深入探索，改造生物遗传特性，另一方面应用工程技术的手段，大量培养细胞或动物本身，以期收获细胞或其代谢产物以及可供利用的动物
68、。一动物细胞，组织培养：1细胞培养：流程如下：无菌取出目的细胞所在组织，以培养液漂洗干净以锋利无菌刀具割除多余部分，切成小组织块将小组织块置解离液离散细胞。（解离液合蛋白酶类，无钙，镁离子）低速离心洗涤细胞后，将目的细胞吸移培养瓶培养，动物细胞培养特点：贴壁生长。培养方法主要有：（1）微导管培养法，2）微载体培养法以葡萄糖聚合物或其他聚合物制成与培养基比重基本相等的直径从几十微米到几百微米的小珠-微载体。将这些微载体与培养基混合均匀，通入无菌空气，动物细胞则贴附在微载体表面旺盛地生长，最终，培养基中细胞的密度可达到1000万个/。（3）微胶囊培养法将一定量动物细胞与褐藻酸钠混合后，滴到CaCL
69、2溶液中，发生离子交换而逐渐硬化成半透性微胶囊。可通过控制离子交换的时间调控微胶囊的刚性。细胞在微胶囊内生长，既可吸收外界营养，又可排出自身代谢废物。其最突出的优点是微胶囊内细胞及其产物可不受培养液中血清所含大分子（包括病毒，蛋白质等。）的污染。2动物细胞组织培养：和细胞培养类似，主要区别在于省略蛋白酶对组织离解作用。无菌取出目的细胞所在组织，以培养液漂洗干净以锋利无菌刀具割除多余部分，切成12mm3小组织块将小组织块置解离液离散细胞。（解离液合蛋白酶类，无钙，镁离子）低速离心洗涤细胞后，将目的细胞吸移培养瓶培养，3.培养物的传代悬浮培养的细胞只需定期将其吸移部分到新鲜培养基中即可，比较方便。
70、组织培养物的传代往往会遇到细胞贴壁生长的麻烦。要这种情况下可用物理法（培养液冲洗，刮刀刮取）或化学法（0.25%胰酶解析)剥离培养组织,视组织块大小进行适当争割后再漂洗,移置于新培养瓶中.4无血清培养上述细胞和组织的体外培养一般都需添加一定量的血清,不仅价格昂贵易混进污染物(包括病毒和病菌),而且其成分不能完全确定,不同批次的血清之间难以保证实验结果的可重复性。因此无血清培养日益受到重视，并已取得了较大的进展。无血清培养基由于必须包括血清中的主要有效成分，因此组成相当复杂，一般包括三大部分：基础培养基，大多以DME培养基与HamF12培养基等量混合为基础培养基；基质因子，包括纤黏素，血清铺展因
71、子，胎球蛋白，胶原和多聚赖氨酸等；生长因子，激素和维生素等约30种有机和无机微量物质，其中包括哺乳动物的绝大多数内分泌激素。培养基配制繁琐是无血清培养的最大缺点。5培养物的长期保存方法基本上有两大类：经典传代法和冷冻保存法.Carrel是经典传代法的创始人之一，每隔几天把鸡胚心肌细胞传代一次。经典传代法手续较为繁琐，维持费用较高。冷冻保存法珍有操作简便，保存期长的特点。液氮保存法简介：将成熟培养物（细胞）与5%10%的甘油或二甲亚砜混匀，封装于若干个安瓿瓶中；缓慢降温（13min）至-30；继续降温（1530min）至-150；转移至液氮冻存，可无限期保存。若安瓿瓶置-70冷存，保活期通常只有
72、几个月，在-90下培养物可保存半年以上。6细胞组织培养污染的防治对于一般性细菌污染可试用氨苄青霉素（终浓度200g/mL）或链霉素（终浓度200g/mL）除菌。若霉菌蔓延，除小心地铲除菌落（丝）外，还应在培养基中加制霉菌素达100U/mL以抑杀散落的孢子，菌丝。支原体的感当令人棘手，即使以100g/mL的卡那霉处理后也只能抑制其繁衍而未能根除。建议用庆大霉素或去污剂加以清除。此外，细胞系，株之间的交叉污染是一个值得重视的问题。一定要突出强调以下的规定：在一个工作区内不能同时放置两种以上细胞株，除非由于细胞融合等工作需要的暂时存放。同时，两种细胞株不能共享培养器具，即使器具消毒后也是如此。二.动
73、物细胞融合（主要有三条途径：病毒诱导融合，化学诱导融合，电激诱导融合。）1病毒诱导融合：流程如下2化学诱导融合：和植物细胞融合一样，以下是两个动物细胞融合的宪例：3，电激诱导融合以下是两个动物细胞融合的宪例：三淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体技术淋巴细胞中的B细胞有单一特导性的抗体，但不能在体外长时间生存，骨髓瘤是一种癌变浆细胞能产生免疫球蛋白，可以在体外长期培养生存，但不具有符合需要的抗体特异性，最后把淋巴细胞中的B细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，使之形成新的杂交瘤，这种杂交瘤具有B细胞的单一特异性抗体又能在体外长期存活，给医学上带来方便。制作过程：（附图）四细胞核移植与动物克隆细胞拆合：从不同的
74、细胞中分离出细胞器及其组成，在体外将它们重新组装成是生物活性的细胞或细胞器的过程称为细胞拆合。（主要有核移植和染色体转移两种）核移植：主要研究异种核质之间遗传相互关系，探讨已分化细胞核的遗传全能性。下面主要讲一下“细胞核遗传全能性”的代表例子“克隆羊”的制作过程体细胞克隆五染色体转移微细胞介导法直接转移法磷酸钙沉淀法脂质体载体法显微注射法DEAE葡聚糖转染技术。六.干细胞研究干细胞（）是动物（包括人）胚胎及某些器官中具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是重建，修复病原体损或衰老组织，器官功能的理想种子细胞。按分化潜能的大小，干细胞基本上可分三种类型：一类是全能性干细胞，即胚胎干细胞，是最原始
75、的干细胞，具有自我更新，高度增殖和多向分化发育成为人体全部206种组织和细胞，甚至形成完整个体的分化潜能。另一类是多能性干细胞，这种干细胞具有分化多种细胞，组织的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制。如骨髓造血干细胞可分化成至少十二种血细胞，但一般不能分化出造血系统以外的其他细胞。还有一类干细胞为专一性干细胞，这类干细胞只能分化成一种类型或功能密切相关的两种类型的细胞，如上皮组织基底层的干细胞，肌肉中的成几细胞等。开展干细胞研究一般要经过以下三个阶段：获得干细胞系：这是本研究最重要的第一些步。可以从动物或人的早期胚胎或各器官，组织中分离并经鉴定，且能在体外长期保持干细胞
76、特性（一般应稳定传25代以上）；建立干细胞诱导分化模型：可利用基因工程手段引入外源目的基因（对原有致病基因进行置换改造），探索诱导干细胞向特定组织，器官分化的化学或/和物理条件；将上述干细胞或干细胞培育体系植入动物或人的相应器官或组织，考察其效果。发酵工程发酵工程是生物技术的重要组成部分，是生物技术产业化的重要环节，是一门利用微生物的生长和代谢活动来生产各种有用物质的工程技术。一发酵工程的重要内容包括生产菌种的选育，发酵条件的优化与控制，反应器的设计产物的分离，提取和精制。二发酵的一般过程：菌种制备（选已纯化或工程菌）发酵控制产物提取三发酵的种类（分批发酵，连续发酵，补料分批发酵）1分批发酵：
77、营养物和菌种一次进行培养，直到结束放出，中间除了空气进入和尾气排出，与外部没有物料交换。缺点：总的生产能力不高。2连续发酵：是指以一定的速度向发酵缸内添加新鲜培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使发酵缸内的液是维持恒定，微生物在稳定状下生长。优点：可以维持稳定的操作条件，使产率和产品居稳定。提高自动化降低劳动强度。减少设备清洗，准备，病菌非生产占用时间，提高设备和率，省力，省工时。减少病菌次数，测量仪器探头寿命延长。过程易于优化，提高发酵产率。缺点：易污染杂菌，微生易发生变异，对各种控制元件和技术在求较高。3，补料分批发酵：又称半连续发酵，是介于人分批发酵和连续发酵之间的一种发酵技术，是在
78、微生物分批发酵中，以某种方式向培养系统补加一定物料的培养技术。补料分批发酵又可分为：单一补料分批发酵和反复补料分批发酵。单一补料分批发酵：在开始时投入一定是基础培养基，到发酵过程的适当时期，开始连续补加C源或N源其他必需其质，直到发酵液体积达到以酵缸最大操作容积后停止补料，最后将发酵液一次全部放出。反复补料分批发酵：是在单一补料发酵的基础上，每隔一定时间按一定比例放出一部分发酵液，使发酵液体积始终不超过发酵缸的最大操作容积，从理认上可以延长发酵周期，直至发酵产率明显下降，才最终将发酵液全部放出。和分批和连续发酵相比其优点：首先它可以解除营养物基质的抑制,产物反馈抑制和葡萄糖分解阻遏效应(葡萄糖
79、效应葡萄糖被快速分解代谢所积累的产物在抑制所需产物合成的同时，也抑制其他一些碳源，氮源的分解利用)，对于好氧发酵，它可以避免在分批发酵中因一次性投入糖过多造成细胞大量生长，耗氧过多，以至通风搅拌设备不能匹配的状况，还可以在某些情况下减少可以降低发酵液的粘度，便于物料输送及后处理，与连续发酵相比，它不会产生菌种老化和变异问题。四发酵工艺控制：1，温度：温度对发酵过程影响影响发酵反应速率，必改变菌体代谢产物的合成方向，影响微生物的代谢调控机制，影响发酵液的理化性质（如发酵液粘度，基质和氧在发酵液中的溶解度和传递速率，某些基质的分解和吸收率。理论上整个发酵，过程中不应只选一个培养温度，而应根据发酵的
80、不同阶段，选择不同的培养温度，在生长繁殖阶段，应选择最适生长温度，在产物分泌阶段，选择最适生产温度。2PH值：pH值对微生物的生长繁殖和产物合成的影响有以下几方面：影响酶的活性，当pH值抑制菌体中某些酶的活性时，会阻碍菌体的新陈代谢；影响微生物细胞膜所带电荷的状态，改变细胞膜的通透性，影响微生物对营养物质的吸收代谢产物的排泄；影响培养基中某些组分和中间代谢产物的离解，从而影响微生物对这些物质的利用；pH值不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。发酵过程中,pH值的变化取决于所用的菌种，培养基的成分和培养条件。培养基中的营养物质的代谢，是引起pH值变化的重要原因。而且微
81、生物生长阶段和产物合成段的最pH值往往不一样，首先要考滤和试验发酵培养基的基础配方，使它们有个适当的配比，使发酵过程中的H值变化在合适的范围。如果达不到要求，还可在发酵过程中补加酸或碱。过去是直接加入酸（如H2SO4）或碱（如NaOH）来控制，现在常用的是以生理酸性物质（NH4）2SO4和生理碱性物质氨水来控制，它们不仅可以调节H值，还可以补充氮源。这种方法，既可以达到稳定H值的目的，又可以不断补充营养物质。3溶解氧浓度对于好氧发酵，溶解氧浓度是最生要的参数之一。好氧性微生物在进行深层培养时，需要适量的溶解氧以维持其呼吸代谢和某些产物的合成，氧的不足会造成代谢异常，产量降低。现在可采用复膜氧电
82、极来检测发酵液中的溶解氧浓度。要维持一定的浓氧水平，需从供氧和需氧两方面着手。在供氧方面，主要是设法提高氧传递的推动力和氧传递系数，可以通过调节搅拌转速和通气速率来控制。同时要有适当的工艺条件来控制需氧量，使菌体的生长和产物形成对氧的需求量不超过设备的供氧能力。其中以菌浓的影响最为明显，发酵液的摄氧率随菌浓增大而增大，但氧的传递速率随菌浓的对数关系减少。因此可以控制合适的菌体浓度，使得产物的比生产速率维持在最大值。又不会导致需氧大于供氧。这可以通过控制基质的浓度来实现，如控制补糖速率。还可以采用调节温度（降低培养温度可提高溶氧浓度），液化培养基，中间补水，添加表面活性剂等工艺措施，来改善溶氧水
83、平。确定放罐的指标有：发酵产物的产量，发酵液的过滤速度，发酵液中氨基氮的含量，菌丝的形态，发酵液的pH，外观和黏度等。五发酵产物的提取：发酵产物的加工一般流程1发酵液预处理和固液分离：常用过滤，离心，或破预处理，常用酸化，加热，加聚凝剂改善发酵液性质利于分离，2提取：常用方法有吸附法，离子交换法，沉淀法，萃取法，超滤法。3精制：常用的方法的沉淀超滤层析结晶。4成品加工：经提取和精制后，最后还需浓缩，无菌过滤和去热原，干燥，加稳定剂包装成品。六发酵设备：发酵缸通常分为机械搅拌或发酵缸和通风搅拌或发酵缸。1机械搅拌发酵缸又可分：（1）通用式发酵（2）自吸式发酵缸自吸式发酵罐罐体的结构大致上与通用式
84、发酵罐相同,主要区别在于搅拌器的形状和结构不同。自吸式发酵罐使用的是带中央吸气口的搅拌器。搅拌器由从罐底向上伸入的主轴带动，叶轮旋转时叶片不断排开周围的液体使其背侧形成真空，于是将罐外空气通过搅拌器中心的吸气管而吸入罐内，吸入的空气与发酵液充分混合后在叶轮末端排出，并立即通过导轮向罐壁分散，经挡板折流涌向液面，均匀分布。空气吸入管通常用一端轴封与叶轮连接，确保不漏气。2通风搅拌式发酵缸3厌氧发酵设备七固体发酵某些微生物生长需水很少，可利用疏松而含有必需营养物的固体培养基进行发酵生产，称为固体发酵。如：酿酒、制酱等。还用于蘑菇的生产、奶酪和泡菜的制作以及动植物废料的堆肥等。固体发酵一般都是开放式
85、的，因而不是纯培养，无菌要求不高，它的一般过程为：将原料预加工后再经蒸煮灭菌，然后制成含一定水分的固体物料，接入预先培养好的菌种，进行发酵。发酵成熟后要适时出料。用到的设备有帘子，曲盘和曲箱等。优点：固体发酵所用原料一般为经济易得，富含营养物质的工农业中的副、废产品，如麸皮、薯粉、大豆饼粉、高梁,玉米粉等.尿素、硫酸铵、无机酸、碱等辅料。固体发酵所需设备简单，操作容易，并可因陋就简，因地制宜地利用一些来源丰富的工农业副产品，因此至今仍在某些产品的生产上不同程度地沿用着。缺点：劳动强度大，不便于机械化操作，微生物品种少，生长慢，产品有限等。酶工程定义:酶工程是研究酶的生产和应用的一门技术学科,它
86、包括酶制剂的制备,酶的固定化,酶的修饰与改造及酶反应器等方面内容。一酶的制备：酶的生产可以通过动植物组织和某些微生物提出取，但从动植物组织中提取酶成本高，得率低，所以现在一般用微生物发酵生产酶。1发酵：选择合适的产酶菌株，采用适当的培养基和培养方式进行发酵使微生物生长繁殖并合成大量所需的酶。2酶的分离纯化：一般流程：破碎细胞离心分离-溶剂抽提过滤浓缩干燥。注意事项：酶在抽提过程易失活，所以低温操作，用缓冲液作溶剂，选择适合的盐浓度避免盐现象，避免搅拌剧烈。破碎细胞破碎细胞有许多方法,动植物细胞常用高速组织捣碎机和组织匀浆器破碎,而微生物细胞的破碎则有机械破碎法、酶法、化学试剂法和物理破碎法等多
87、种.珠磨机珠磨机高压均质机高压均质机溶剂抽提大多数酶蛋白都可用稀碱或稀盐溶液浸泡抽提,选用溶剂和抽提条件视酶的溶解性和稳定性而定，抽提时应注意溶剂种类、溶剂量、溶剂等的选择吊篮式萃取设备吊篮式萃取设备萃取工艺流程图萃取工艺流程图离心分离离心分离是酶分离提纯中最常用的方法，主要用于除去细胞碎片或抽提过程中生成的沉淀物。工业上常用板框压滤机来完成酶的粗分离。过滤不锈钢板框过滤机不锈钢板框过滤机碟片离心机碟片离心机浓缩由于发酵液或酶抽提液中酶的浓度一般都比较低，必须经过进一步纯化以便于保存、运输和应用。大多数纯化酶的操作如吸附、沉淀、凝胶过滤等均包含了酶的浓缩作用，工业上常采用真空薄膜浓缩法以保证酶
88、在浓缩过程中基本不失活。离子交换树脂柱设计图离子交换树脂柱设计图干燥酶溶液或含水量高的酶制剂即使在低温下也极不稳定，只能作短期保存。为便于酶制剂的长时间的运输、储存，防止酶变性，往往需用对酶进行干燥，制成含水量较低的制品。常用的干燥方法有真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥等。喷雾干燥设备喷雾干燥设备3酶的纯化与精制：1根据酶分子大小和形状的分离方法(1)离心分离(2)凝胶过滤分离酶蛋白时，分子大小大于凝胶孔径的蛋白质被凝胶排阻，因而在凝胶颗粒间隙中移动，速度较快；小分子蛋白质则可自由出入凝胶颗粒的小孔内，路径加长，移动缓慢。(3)透析与超滤透析膜的截留极限是相对分子质量为5000左右，如果将相对分子
89、质量小于10000的酶液进行透析就有泄漏的危险。超滤是在一定压力下，将料液强制通过一定孔径的滤膜以达到分离纯化或酶液的浓缩及脱色等目的。2根据酶分子电荷性质的分离方法(1)离子交换层析由于不同的蛋白质分子暴露在外表面的侧链基团的种类和数量不同，因此在一定pH和离子强度的缓冲液中，所带的电荷情况也不相同。根据不同的蛋白质与离子交换剂的亲合力不同而达到分离目的的方法称为离子交换层析。(2)层析聚焦层析聚焦类似于等电聚焦电泳，但其连续的pH梯度是在固相郭交换载体上形成的。它既具有等电聚焦电泳的高分辨率，又具有柱内容量大的特点，具有较大的应用价值。(3)电泳由于不同蛋白质所带净电荷的大小和性质不同，在
90、外电场作用下，其泳动方向和速率也不同，从而达到分离的目的。(4)等电聚焦具体操作方法如下：先从阳极顶端扩散装入一种酸如磷酸，然后从阴极端扩散装入一种碱如乙醇胺，这样便于可在两端建立起一pH梯度。每一种两性电解质在电场作用下泳致力到其等电点的pH区时便停留在那儿，形成一pH梯度。3根据酶分子专一性结合的分离方法(1)亲和层析亲和层析法进行分离，即利用酶分子的专一性结合位点或特异的结构性质来达到分离的目的；为了使载体能与酶进行亲和结合，载体需进行活化，即将载体与待分离的酶的配基结合，这些配基可能是酶的底物、抑制剂、辅因子，也可以是酶的特异性抗体。(2)染料配体亲和层析染料配基(3)共价层析利用层析
91、介质与被分离的酶之间形成共价键而达到分离的目的，目前主要用于含巯基的酶的分离纯化。4根据分配系数的分离方法某些聚合物与一些无机盐或另一种聚合物相混合，当浓度达到一定范围时，体系会自动分为两相，由于生物活性物质在两种中具有不同的分配比,经过反复处理则可达到分离的目的，这种分离方法称为水相萃取分离。常用于生物物质分离的体系有聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(DEXTRAN)、PEG/磷酸盐、PEG/硫酸氨等。由于双水相体系具有含水比例高、选用的聚合物及盐类对酶无损害、分离设备与化学工业通用等优点，因而在工业上作为酶的提取分离的新工艺日益受到重视。双水相体系的分配行为受到所用聚合物分子大小、成相浓度、pH
92、、无机盐种类等因素的影响。现在已发展出具有亲和双水相萃取以及膜分离双水相萃取等新型双水相分离技术。4酶的纯度与酶活力的测定酶的纯度可用酶的比活力来衡量。比活力是以每毫克蛋白所具有的酶活力单位数。一般情况下，酶的比活力随酶的纯度的提高而提高。酶活力的测定方法有（1）终点法（2）动力学法。酶的活力单位习惯上根据酶在最适条件下，单位时间内催化底物的减少量或产物的生成量来表示。5酶制剂的保存：注意温度（04）添加缓冲液带有巯基的酶类要加巯基保护剂一般酶浓度越高（如晶体或干粉）越稳定或加各种稳定剂如辅酶，无机离子。二酶分子的改造因为酶自身在应用上存在的一些缺点，所以人们要对酶分子进行进行改造，改变酶特性
93、，有两种主要方法：一是通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的结构，二是通过基因工程方法改造编码酶分子的基因从而达到改造酶的目的。1酶分子修饰：是指通过对蛋白质的主链的剪接割和侧链的化学修饰对酶分子进行改造，改造的目的在于改变酶的一些性质，改造出天然酶不具备的某些优良性状，扩大酶的应用以达到较高的经济效益，如常用方法有：部分水解酶蛋白的非活性主链，利用小分子或大分子物质对活性部位或活性部位以外的侧链基因进行共价修饰；酶辅因子的置换。2酶的生物工程：主要有三方面内容，酶的基因工程解决酶的大量生产修饰酶基因产生遗传修饰酶的蛋白质工程是设计出新酶基因，合成自然界未有过的酶，下面简单述叙一下酶基因
94、的克隆。三酶的固定化：酶稳定性差，而且在催化结束后难以回收，所以人们把酶（或细胞）固定，让其活性稳定，又能回收再用。酶的固定化方法：1.物理吸附法是制备固定化酶最早采用的方法，它是以固体表面物理吸附为依据，使酶与水不溶性载体相接触而达到酶吸附的目的。吸附的载体可以是石英砂、多孔玻璃、硅胶、淀粉、高岭土、活性炭告示对蛋白质有高度吸附力的吸附剂.离子吸附法该法是通过离子效应，将酶分子固定到含有离子交换基团的固相载体。交换剂DEAE-葡聚糖凝胶固定化的.常见的载体有DEAE-纤维素、CM-衍生物等。螯合法这是一种比较吸引人的技术，它主要是利用螯合作用将酶直接螯合到表面含过渡金属化合物的载体上，具有较
95、高的操作稳定性。已知能用于酶固定化的金属氢氧化物有钛（二价和四价）、锆（四价）和钒（三价）等。共价结合法共价结合法是通过酶分子上的官能团。与载体表面上的反应基团发生化学反应形成共价键的一种固定化方法，是研究得最多的固定化方法之一。结合的基团应当是酶催化活性的非必需基团。载体选择，尽可能选用亲水性载体，表面积尽可能大，并应具有一定的机械强度和稳定性，它可以天然高分子物质，也可以是合成高分子或其他支持物如纤维素、尼龙、多孔玻璃等。用于共价结合的酶分子官能团可以是自由的-或-NH2，另外、-SH、-OH、咪唑基或自由的羧基也可。共价交联法共价交联法是通过双功能或多功能试剂，在酶分子间或酶分子和载体间
96、形成共价键的连接方法。这些具有两种相同或不同功能基团的试剂叫做交联剂。常见的交联剂有顺丁烯二酸酐和乙烯共聚物，戊二醛等，其中以戊二醛最为常用包埋法将酶包埋在高聚物凝胶网格中或高分子半透膜内的固定方法。前者又称为凝胶包埋法，后者则称为微囊法。用于凝胶包埋的高分子化合物可以是天然高分子化合物、如明胶、海藻酸钠、淀粉等,也可以是合成的高分子化合物如聚内丙烯酰胺、光敏树脂等。微囊法是利用各类型的膜将酶封闭起来，这类膜能使低分子产物和底物通过，而酶和其他高分子不能通过。例如可将酶封装于胶囊、脂质体各中空纤维内、胶囊和脂质体适用于医学治疗，中空纤维包埋适于工业使用。2.细胞（酶）的固定化方法；（168页）
97、细胞固定化的主要方法有:（1）包埋法:将细胞包埋在多微孔载体内部制备固定化细胞的方法称包埋法，可分为凝胶包埋法、纤维包埋法和微胶囊包埋法，其中凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定化方法，适用于各种微生物、动植物细胞的固定化。（2）吸附法。主要是利用细胞与载体之间的吸引力（范德华力、离子键或氢键），使细胞固定在载体上、常用的吸附剂有玻璃、陶瓷、硅藻土、多孔塑料、中空纤维等。用吸附法制备固定化细胞所需条件温和，方法简便，但载体和细胞的吸引力与细胞性质，载体性质以及二者的相互作用有关，只有当这些参数配合得当，才能形成较稳定的细胞载体复合物，才能用于连续生产。3固定化酶（细胞）的性质（1）酶活力的变化：固
98、定化酶的活力在多数情况下比天然酶的活力低，专一性也可能发生变化，原因可能是：酶构象的改变导致了酶与底物结合能务或催化底物转化能力的改变；载体的存在给酶的活性部位或调节部位造成某种空间障碍，影响酶与称臣物或其他效应物的作用；底物和酶的作用受其扩散速率的限制。（2）酶稳定性提高酶稳定性包括热稳定性，对各种有机试剂的稳定性，对酸碱的稳定性，对蛋白水解酶的抗性及储存稳定性等。固定化酶长稳定性提高的原因可能是由于固定化后酶与载体多点连接或酶分子间的交联，防止了酶分子的伸展变形，同时也抑制了自降解反应。（3）最适pH的变化酶固定化后，催化底物的最适和pH活性曲线常发生变化，其原因是微环境表面电荷的影响。（
99、4）最适温度的变化在一般情况下，固定化后的酶失活速度下降，所以最适温度也随之提高。（5）动力学常数的变化表观米氏常数往往比游离酶的米氏常数高，而最大反应速度变小；此外，动力学常数的变化还受溶液中离子强度的影响。4固定化酶（细胞）的指标为考察它的性质，可以参通过测定固定化酶的各种参数，来判断固定化立法的优劣，及其固定化酶的实用性，常见的评估指标有以下几条：（1）相对酶活力具有相同酶蛋白量的固定化酶与游离酶活力的比值称为相对酶活力，它与载体结构，颗粒大小，底物分子质量大小及酶的结合效率有关，相对酶活力低于75%的固定化酶，一般没有实际应用价值。（2）酶的活力回收率固定化酶的总活力与用于固定化的酶的
100、总活力之比称为酶的活力回收率，将酶进行固定化时，总有一部分酶没有与载体结合在一起，测定酶的活力回收率可以确定固定化的效果。（3）固定化酶的半衰期即固定化酶的活力下降到为初始活力一闰所经历的时间，用表示，它是衡量固定化酶操作稳定性的关键。四酶反应器：以酶为催化剂进行反应所需要的设备称之为反应器。1酶反应器的基本类型搅拌缸型反应器固定床型反应器流化床型反应器膜式反应器。2酶反应器的操作：谨防微生物污染控制好反应器中流动方式（针对流动式反应器）控制好填充床内的样品流速（对固定化）生物传感器的应用人类基因组计划后基因组学蛋白质组学基因诊断基因治疗基因药物基因芯片生物技术在环保上的应用1.活性污泥处理法2.生物膜处理法
