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1、微生物实验实验一显微镜的使用及微生物形态观察实验一实验一 显微镜的使用及微生物形态观察显微镜的使用及微生物形态观察 一一一一. . 目的目的目的目的 1. 1. 了解普通光学显微镜的构造，学习显微了解普通光学显微镜的构造，学习显微了解普通光学显微镜的构造，学习显微了解普通光学显微镜的构造，学习显微镜的使用方法和保养。（高、低倍镜的使用）镜的使用方法和保养。（高、低倍镜的使用）镜的使用方法和保养。（高、低倍镜的使用）镜的使用方法和保养。（高、低倍镜的使用） 2. 2. 观察蓝细菌、霉菌、酵母菌、放线菌的观察蓝细菌、霉菌、酵母菌、放线菌的观察蓝细菌、霉菌、酵母菌、放线菌的观察蓝细菌、霉菌、酵母菌、
2、放线菌的个体形态，学会生物图的绘制。个体形态，学会生物图的绘制。个体形态，学会生物图的绘制。个体形态，学会生物图的绘制。 二二二二. . 实验器材实验器材实验器材实验器材 1. 1. 光学显微镜光学显微镜光学显微镜光学显微镜 2. 2. 示范片：颤藻、曲霉、青霉、酵母菌、示范片：颤藻、曲霉、青霉、酵母菌、示范片：颤藻、曲霉、青霉、酵母菌、示范片：颤藻、曲霉、青霉、酵母菌、放线菌。放线菌。放线菌。放线菌。1-1 三三. 实验内容实验内容1. 1. 微生物大小的测定微生物大小的测定微生物大小的测定微生物大小的测定(1) (1) 标定目镜测微尺标定目镜测微尺标定目镜测微尺标定目镜测微尺 装装装装在在
3、在在目目目目镜镜镜镜上上上上的的的的目目目目测测测测微微微微尺尺尺尺中中中中央央央央刻刻刻刻有有有有等等等等分分分分为为为为100100格格格格或或或或更更更更多多多多格格格格的的的的标标标标尺尺尺尺，使使使使用用用用前前前前要要要要用用用用物物物物测测测测微微微微尺尺尺尺标标标标定定定定。物物物物测测测测微微微微尺尺尺尺中中中中央央央央刻刻刻刻有有有有1mm1mm长长长长的的的的标标标标尺尺尺尺，等等等等分分分分为为为为100100格格格格，1010mmmm格格格格。将将将将物物物物测测测测微微微微尺尺尺尺的的的的刻刻刻刻度度度度朝朝朝朝上上上上放放放放在在在在载载载载物物物物台台台台上上上
4、上，用用用用低低低低倍倍倍倍镜镜镜镜找找找找出出出出物物物物测测测测微微微微尺尺尺尺的的的的刻刻刻刻度度度度，移移移移动动动动物物物物测测测测微微微微尺尺尺尺使使使使其其其其第第第第一一一一条条条条线线线线与与与与目目目目测测测测微微微微尺尺尺尺的的的的第第第第一一一一条条条条线线线线重重重重合合合合，顺顺顺顺着着着着刻刻刻刻度度度度线线线线找找找找出出出出另另另另一一一一条条条条重重重重合合合合线线线线。算算算算出出出出低低低低倍倍倍倍镜镜镜镜下下下下目目目目测测测测微微微微尺尺尺尺每每每每格格格格的的的的长长长长度度度度。换换换换高高高高倍倍倍倍镜镜镜镜用用用用同同同同样样样样方方方方法法
5、法法标标标标定定定定出出出出高高高高倍倍倍倍镜镜镜镜下下下下目目目目测测测测微微微微尺尺尺尺每每每每格格格格的长度。的长度。的长度。的长度。2-2测测微微尺尺示示意意图图(2) (2) (2) (2) 微生物大小的测量微生物大小的测量微生物大小的测量微生物大小的测量 将物测微尺取下，换上标本片，选择适当物将物测微尺取下，换上标本片，选择适当物将物测微尺取下，换上标本片，选择适当物将物测微尺取下，换上标本片，选择适当物镜测量微生物的长度和宽度占目测微尺的格数，再镜测量微生物的长度和宽度占目测微尺的格数，再镜测量微生物的长度和宽度占目测微尺的格数，再镜测量微生物的长度和宽度占目测微尺的格数，再按目
6、测微尺按目测微尺按目测微尺按目测微尺1 1 1 1格的长度算出微生物的长度和宽度。格的长度算出微生物的长度和宽度。格的长度算出微生物的长度和宽度。格的长度算出微生物的长度和宽度。2-3 2.2.压滴法观察活性污泥中生物相压滴法观察活性污泥中生物相 （1）压滴法制作标本片）压滴法制作标本片 用用滴滴管管取取活活性性污污泥泥混混合合液液一一小小滴滴，放放在在载载玻玻片片中中央央。取取一一块块盖盖玻玻片片先先将将一一边边与与混混合合液液接接触触，然然后后慢慢慢慢将将盖盖玻玻片片放放下下使使其其盖盖在在混混合液上。片内不能有气泡。合液上。片内不能有气泡。 （2）观察活性污泥中生物相）观察活性污泥中生物
7、相 先先用用低低倍倍镜镜观观察察活活性性污污泥泥中中菌菌胶胶团团、原原生生动动物物、后后生生动动物物。画画出出所所观观察察到到的的生生物物形形态图。态图。标明名称、放大倍数和微生物的大小标明名称、放大倍数和微生物的大小。2-4 四四.实验结果实验结果 1.低、高倍镜下目测微尺每格的长度。低、高倍镜下目测微尺每格的长度。 2.画出画出23种污泥中所观察到的生物形态图。标种污泥中所观察到的生物形态图。标明名称、放大倍数和微生物的大小。明名称、放大倍数和微生物的大小。 3.画出两种藻类生物形态图，标明名称、放大画出两种藻类生物形态图，标明名称、放大画出两种藻类生物形态图，标明名称、放大画出两种藻类生
8、物形态图，标明名称、放大倍数倍数倍数倍数和微生物的大小。和微生物的大小。 。3. 观察几种藻类的个体形态观察几种藻类的个体形态 观观观观察察察察几几几几种种种种藻藻藻藻类类类类的的的的个个个个体体体体形形形形态态态态，画画画画出出出出生生生生物物物物形形形形态态态态图图图图，标明名称、放大倍数。标明名称、放大倍数。标明名称、放大倍数。标明名称、放大倍数。2-5实验三实验三 微生物的染色微生物的染色 一一. 目的目的 1. 1. 学学学学习习习习微微微微生生生生物物物物的的的的染染染染色色色色技技技技术术术术，掌掌掌掌握握握握微微微微生生生生物物物物的的的的单染色法和革兰氏染色法。单染色法和革兰
9、氏染色法。单染色法和革兰氏染色法。单染色法和革兰氏染色法。 2. 2. 学习油镜的操作。学习油镜的操作。学习油镜的操作。学习油镜的操作。3-1二染色原理和油镜的工作原理二染色原理和油镜的工作原理1 1油镜工作原理油镜工作原理油镜工作原理油镜工作原理 油镜的放大倍数最大（油镜的放大倍数最大（油镜的放大倍数最大（油镜的放大倍数最大（100100），故镜头焦距短，直），故镜头焦距短，直），故镜头焦距短，直），故镜头焦距短，直径小径小径小径小, ,但所需光照强度却最大。从标本片透过的光线是但所需光照强度却最大。从标本片透过的光线是但所需光照强度却最大。从标本片透过的光线是但所需光照强度却最大。从标本片
10、透过的光线是从玻片进入空从玻片进入空从玻片进入空从玻片进入空 气，再进入镜头。由于玻璃和空气的介气，再进入镜头。由于玻璃和空气的介气，再进入镜头。由于玻璃和空气的介气，再进入镜头。由于玻璃和空气的介质密度不同，有些光会质密度不同，有些光会质密度不同，有些光会质密度不同，有些光会 因折射或反射而因折射或反射而因折射或反射而因折射或反射而 不能进入不能进入不能进入不能进入 镜头。物象就显镜头。物象就显镜头。物象就显镜头。物象就显 现不清。现不清。现不清。现不清。 为了不使通过的为了不使通过的为了不使通过的为了不使通过的 光线有光线有光线有光线有 所损失，须在油镜与玻片所损失，须在油镜与玻片所损失，
11、须在油镜与玻片所损失，须在油镜与玻片 之间加入折射率和玻璃之间加入折射率和玻璃之间加入折射率和玻璃之间加入折射率和玻璃 (n=1.52 (n=1.52）相仿的香柏油）相仿的香柏油）相仿的香柏油）相仿的香柏油 (n=1.515) (n=1.515)。故而称之为。故而称之为。故而称之为。故而称之为 “ “油镜油镜油镜油镜” ”。 2单染色法：单染色法： 微微微微生生生生物物物物不不不不但但但但个个个个体体体体微微微微小小小小，且且且且无无无无色色色色半半半半透透透透明明明明。要要要要在在在在显显显显微微微微镜镜镜镜下下下下观观观观察察察察清清清清楚楚楚楚，必必必必须须须须染染染染上上上上颜颜颜颜色
12、色色色 。微微微微生生生生物物物物细细细细胞胞胞胞中中中中含含含含有有有有大大大大量量量量的的的的蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质等等等等一一一一类类类类两两两两性性性性电电电电解解解解质质质质：在在在在酸酸酸酸性性性性溶溶溶溶液液液液中中中中结结结结合合合合质质质质子子子子带带带带正正正正电电电电；在在在在碱碱碱碱性性性性溶溶溶溶液液液液中中中中给给给给出出出出质质质质子子子子而而而而带带带带负负负负电电电电。等等等等电电电电点点点点一一一一般般般般在在在在pH=25pH=25。所所所所以以以以，在在在在中中中中性性性性、碱碱碱碱性性性性或或或或弱弱弱弱酸酸酸酸性性性性溶溶溶溶液液液液中中中中，微微
13、微微生生生生物物物物细细细细胞胞胞胞通通通通常常常常带带带带负负负负电电电电荷荷荷荷。碱碱碱碱性性性性染染染染料料料料在在在在电电电电离离离离时时时时，染染染染色色色色部部部部分分分分是是是是带带带带正正正正电电电电荷荷荷荷的的的的，容容容容易易易易与与与与带带带带负负负负电电电电荷荷荷荷的的的的菌菌菌菌体体体体结结结结合合合合使使使使之之之之着着着着色色色色。经经经经染染染染色色色色后后后后的的的的菌菌菌菌体体体体细细细细胞胞胞胞与与与与背背背背景景景景形形形形成成成成鲜鲜鲜鲜明明明明的的的的对对对对比比比比，在在在在显显显显微微微微镜镜镜镜下下下下很很很很容易观察。容易观察。容易观察。容易
14、观察。3-2 3 3革兰氏染色法：革兰氏染色法：革兰氏染色法：革兰氏染色法： 革革革革兰兰兰兰氏氏氏氏染染染染色色色色法法法法将将将将细细细细菌菌菌菌分分分分为为为为GG和和和和GG- - ，这这这这由由由由两两两两类类类类细细细细菌菌菌菌细细细细胞胞胞胞壁壁壁壁的的的的结结结结构构构构和和和和组组组组成成成成的的的的不不不不同同同同而而而而决决决决定定定定。用用用用结结结结晶晶晶晶紫紫紫紫初初初初染染染染后后后后，所所所所有有有有的的的的细细细细菌菌菌菌都都都都染染染染上上上上蓝蓝蓝蓝紫紫紫紫色色色色。碘碘碘碘作作作作为为为为媒媒媒媒染染染染剂剂剂剂能能能能与与与与结结结结晶晶晶晶紫紫紫紫结
15、结结结合合合合形形形形成成成成结结结结晶晶晶晶紫紫紫紫- -碘碘碘碘的的的的复复复复合合合合物物物物，增增增增强强强强了了了了染染染染料料料料与与与与菌菌菌菌体体体体的的的的结结结结合合合合力力力力。用用用用乙乙乙乙醇醇醇醇脱脱脱脱色色色色处处处处理理理理时时时时，两两两两类类类类细细细细菌菌菌菌的的的的脱脱脱脱色色色色效效效效果果果果是是是是不不不不同同同同的的的的。GG细细细细菌菌菌菌的的的的细细细细胞胞胞胞壁壁壁壁主主主主要要要要由由由由肽肽肽肽聚聚聚聚糖糖糖糖形形形形成成成成的的的的网网网网状状状状结结结结构构构构组组组组成成成成，且且且且壁壁壁壁厚厚厚厚、类类类类脂脂脂脂含含含含量量
16、量量低低低低，用用用用乙乙乙乙醇醇醇醇脱脱脱脱色色色色时时时时使使使使细细细细胞胞胞胞壁壁壁壁脱脱脱脱水水水水、网网网网状状状状结结结结构构构构孔孔孔孔径径径径缩缩缩缩小小小小，通通通通透透透透性性性性降降降降低低低低，使使使使得得得得结结结结晶晶晶晶紫紫紫紫碘碘碘碘的的的的复复复复合合合合物物物物不不不不易易易易被被被被洗洗洗洗脱脱脱脱而而而而保保保保留留留留在在在在细细细细胞胞胞胞内内内内。虽虽虽虽经经经经洗洗洗洗脱脱脱脱和和和和复复复复染染染染仍仍仍仍然然然然保保保保持持持持初初初初染染染染剂剂剂剂的的的的蓝蓝蓝蓝紫紫紫紫色色色色。GG- -细细细细菌菌菌菌则则则则不不不不同同同同，由由
17、由由于于于于其其其其细细细细胞胞胞胞壁壁壁壁肽肽肽肽聚聚聚聚糖糖糖糖层层层层较较较较薄薄薄薄，类类类类脂脂脂脂含含含含量量量量高高高高，所所所所以以以以在在在在脱脱脱脱色色色色处处处处理理理理时时时时，类类类类脂脂脂脂被被被被乙乙乙乙醇醇醇醇溶溶溶溶解解解解，细细细细胞胞胞胞壁壁壁壁的的的的通通通通透透透透性性性性增增增增大大大大，使使使使结结结结晶晶晶晶紫紫紫紫碘碘碘碘的的的的复复复复合合合合物物物物比比比比较较较较容容容容易易易易被被被被洗洗洗洗脱脱脱脱出出出出来来来来，用用用用复复复复染染染染剂剂剂剂复复复复染染染染后后后后，细细细细胞胞胞胞被被被被染染染染上上上上复复复复染剂的颜色。染
18、剂的颜色。染剂的颜色。染剂的颜色。3-3 三实验器材三实验器材 1 1显微镜、香柏油、接种环、酒精灯等。显微镜、香柏油、接种环、酒精灯等。显微镜、香柏油、接种环、酒精灯等。显微镜、香柏油、接种环、酒精灯等。 2 2结晶紫染液、碘液、结晶紫染液、碘液、结晶紫染液、碘液、结晶紫染液、碘液、95%95%乙醇、沙黄染液。乙醇、沙黄染液。乙醇、沙黄染液。乙醇、沙黄染液。 3 3菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。3-4四实验内容四实验内容 ( (一一一一) ) 单染色单染色单染色单染色 1 1涂涂涂涂片片片片 取取取取一
19、一一一块块块块载载载载玻玻玻玻片片片片，用用用用记记记记号号号号笔笔笔笔划划划划分分分分出出出出两两两两区区区区域域域域并并并并做做做做上上上上记记记记号号号号，在在在在两两两两区区区区域域域域中中中中央央央央各各各各滴滴滴滴半半半半滴滴滴滴无无无无菌菌菌菌水水水水，用用用用接接接接种种种种环环环环以以以以无无无无菌菌菌菌操操操操作作作作法法法法分分分分别别别别取取取取两两两两种种种种菌菌菌菌种种种种在在在在左左左左右右右右两两两两滴滴滴滴水水水水中中中中，和和和和匀后涂成薄膜。匀后涂成薄膜。匀后涂成薄膜。匀后涂成薄膜。 2 2干燥干燥干燥干燥 室温自然干燥或吹干。室温自然干燥或吹干。室温自然
20、干燥或吹干。室温自然干燥或吹干。 3 3固定固定固定固定 涂面朝上，通过火焰涂面朝上，通过火焰涂面朝上，通过火焰涂面朝上，通过火焰2323次。次。次。次。 4 4染染染染色色色色 在在在在涂涂涂涂片片片片薄薄薄薄膜膜膜膜上上上上滴滴滴滴加加加加结结结结晶晶晶晶紫紫紫紫染染染染液液液液，使使使使之之之之覆覆覆覆盖盖盖盖2 2分钟。分钟。分钟。分钟。 5 5水水水水洗洗洗洗 傾傾傾傾倒倒倒倒去去去去染染染染液液液液，斜斜斜斜置置置置载载载载玻玻玻玻片片片片，用用用用洗洗洗洗瓶瓶瓶瓶小小小小水水水水流沿玻片边缘冲洗，直至水呈无色为止。流沿玻片边缘冲洗，直至水呈无色为止。流沿玻片边缘冲洗，直至水呈无色
21、为止。流沿玻片边缘冲洗，直至水呈无色为止。 6 6干燥干燥干燥干燥 室温自然干燥或用吸水纸吸干。室温自然干燥或用吸水纸吸干。室温自然干燥或用吸水纸吸干。室温自然干燥或用吸水纸吸干。3-5 (二二)革兰氏染色革兰氏染色 完成单染色的完成单染色的完成单染色的完成单染色的1616步骤后步骤后步骤后步骤后 7. 7. 媒媒媒媒染染染染 加加加加媒媒媒媒染染染染剂剂剂剂碘碘碘碘液液液液使使使使之之之之覆覆覆覆盖盖盖盖1 1分分分分钟钟钟钟，水水水水洗洗洗洗，吸水纸吸干。吸水纸吸干。吸水纸吸干。吸水纸吸干。 8. 8. 脱脱脱脱色色色色 滴滴滴滴加加加加95% 95% 乙乙乙乙醇醇醇醇数数数数滴滴滴滴使使
22、使使之之之之覆覆覆覆盖盖盖盖1616秒秒秒秒钟钟钟钟，立立立立即水洗即水洗即水洗即水洗, ,吸干。吸干。吸干。吸干。 9. 9. 复复复复染染染染 用用用用沙沙沙沙黄黄黄黄（番番番番红红红红）液液液液复复复复染染染染 2 2 分分分分钟钟钟钟，水水水水洗洗洗洗，吸干。吸干。吸干。吸干。 3-6(二二) 镜检镜检 先先先先分分分分别别别别用用用用低低低低倍倍倍倍镜镜镜镜和和和和高高高高倍倍倍倍镜镜镜镜找找找找到到到到要要要要观观观观察察察察的的的的样样样样品品品品区区区区域域域域后后后后，用用用用转转转转换换换换器器器器将将将将物物物物镜镜镜镜转转转转到到到到空空空空挡挡挡挡，在在在在样样样样品
23、品品品区区区区域域域域滴滴滴滴加加加加香香香香柏柏柏柏油油油油，再再再再将将将将油油油油镜镜镜镜慢慢慢慢慢慢慢慢转转转转到到到到工工工工作作作作位位位位置置置置浸浸浸浸入入入入油油油油中。若不清晰，慢慢转动微调直至清楚。中。若不清晰，慢慢转动微调直至清楚。中。若不清晰，慢慢转动微调直至清楚。中。若不清晰，慢慢转动微调直至清楚。 油油油油镜镜镜镜用用用用完完完完后后后后，用用用用镜镜镜镜头头头头纸纸纸纸沾沾沾沾取取取取乙乙乙乙醇醇醇醇- -乙乙乙乙醚醚醚醚混混混混合合合合液液液液檫拭油镜头。再用干的镜头纸檫干镜头。檫拭油镜头。再用干的镜头纸檫干镜头。檫拭油镜头。再用干的镜头纸檫干镜头。檫拭油镜头
24、。再用干的镜头纸檫干镜头。 五实验结果五实验结果 观察两种细菌的形态和颜色，绘出油镜下细观察两种细菌的形态和颜色，绘出油镜下细菌形态图，说明革兰氏染色的结果。菌形态图，说明革兰氏染色的结果。 六思考题六思考题 通通通通过过过过实实实实验验验验，你你你你认认认认为为为为革革革革兰兰兰兰氏氏氏氏染染染染色色色色成成成成功功功功关关关关键键键键是是是是那那那那一一一一步步步步？为为为为了了了了避避避避免免免免假假假假阳阳阳阳性性性性或或或或假假假假阴阴阴阴性性性性出出出出现现现现，在在在在对对对对未未未未知知知知菌菌菌菌种种种种做做做做革革革革兰兰兰兰氏氏氏氏染染染染色色色色鉴鉴鉴鉴定定定定时时时时
25、，你你你你认认认认为为为为应应应应该该该该怎怎怎怎样样样样做做做做？3-7实验四微生物的计数实验四微生物的计数（显微镜直接计数法）（显微镜直接计数法） 一目的一目的一目的一目的 1. 1.了解血球计数板的计数原理，掌握血球计数了解血球计数板的计数原理，掌握血球计数了解血球计数板的计数原理，掌握血球计数了解血球计数板的计数原理，掌握血球计数板的计数方法。板的计数方法。板的计数方法。板的计数方法。 2. 2.观察酵母菌的形态，学习区分酵母菌死活观察酵母菌的形态，学习区分酵母菌死活观察酵母菌的形态，学习区分酵母菌死活观察酵母菌的形态，学习区分酵母菌死活细胞的方法。细胞的方法。细胞的方法。细胞的方法。
26、 二二二二. . 实验器材实验器材实验器材实验器材 显微镜、血球计数板、酵母菌液、美蓝染液、显微镜、血球计数板、酵母菌液、美蓝染液、显微镜、血球计数板、酵母菌液、美蓝染液、显微镜、血球计数板、酵母菌液、美蓝染液、盖玻片。盖玻片。盖玻片。盖玻片。4-1 三原理三原理 1. 血球计数板计数原理血球计数板计数原理 血球计数板是一块特制的载玻片，有四条竖槽和一条血球计数板是一块特制的载玻片，有四条竖槽和一条血球计数板是一块特制的载玻片，有四条竖槽和一条血球计数板是一块特制的载玻片，有四条竖槽和一条横槽。横槽两边的平台上各有一个有九个大方格的方格网，横槽。横槽两边的平台上各有一个有九个大方格的方格网，横
27、槽。横槽两边的平台上各有一个有九个大方格的方格网，横槽。横槽两边的平台上各有一个有九个大方格的方格网，中间大方格为计数室：边长为，深为中间大方格为计数室：边长为，深为中间大方格为计数室：边长为，深为中间大方格为计数室：边长为，深为0.1mm0.1mm，容积，容积，容积，容积为为为为0.1mm0.1mm3 3(10(10-4-4ml)ml)。计数室有两种规格：一是分为计数室有两种规格：一是分为计数室有两种规格：一是分为计数室有两种规格：一是分为1616个中个中个中个中方格，每中方格中有方格，每中方格中有方格，每中方格中有方格，每中方格中有2525个小方格；另一种是分为个小方格；另一种是分为个小方
28、格；另一种是分为个小方格；另一种是分为2525个中方个中方个中方个中方格，每中方格有格，每中方格有格，每中方格有格，每中方格有1616个小方格。两种都共有个小方格。两种都共有个小方格。两种都共有个小方格。两种都共有400400个小方格。个小方格。个小方格。个小方格。4-2 计数：计数： 数出数出5个中方格中的总菌数个中方格中的总菌数A，若菌液的稀释，若菌液的稀释倍数为倍数为B，则计算公式如下：，则计算公式如下： ( (1) 251) 25个中方格的计数板计算公式个中方格的计数板计算公式个中方格的计数板计算公式个中方格的计数板计算公式 ( (2) 162) 16个中方格的计数板计算公式个中方格的
29、计数板计算公式个中方格的计数板计算公式个中方格的计数板计算公式4-3 2. 2. 区分酵母菌死活细胞基本原理区分酵母菌死活细胞基本原理区分酵母菌死活细胞基本原理区分酵母菌死活细胞基本原理 美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型是无色。用美蓝对酵母菌的活细蓝色，还原型是无色。用美蓝对酵母菌的活细蓝色，还原型是无色。用美蓝对酵母菌的活细蓝色，还原型是无色。用美蓝对酵母菌的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞进行染色时，由于细胞的新陈
30、代谢作用，细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变成无色的还原型。因此，具有还原能氧化型变成无色的还原型。因此，具有还原能氧化型变成无色的还原型。因此，具有还原能氧化型变成无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的或淡蓝色，而死细胞力的酵母活细胞是无色的或淡蓝色，而死细胞力的酵母活细胞是无色的或淡蓝色，而死细胞力的酵母活细胞是无色的或淡蓝色，而死细胞或代谢作用的衰老细胞则呈蓝色，借此即可对或代谢作用的衰老细胞则呈蓝色
31、，借此即可对或代谢作用的衰老细胞则呈蓝色，借此即可对或代谢作用的衰老细胞则呈蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。 四四. 实验内容实验内容 1. 1. 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别 (1) (1) 在载玻片上加半滴美蓝染液，在染液上在载玻片上加半滴美蓝染液，在染液上在载玻片上加半滴美蓝染液，在染液上在载玻片上加半滴美蓝染液，在染液上滴一滴菌液。取一块盖玻片，先将一边与菌液滴一滴菌液。取一块盖玻片
32、，先将一边与菌液滴一滴菌液。取一块盖玻片，先将一边与菌液滴一滴菌液。取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下盖在菌液上。接触，然后慢慢将盖玻片放下盖在菌液上。接触，然后慢慢将盖玻片放下盖在菌液上。接触，然后慢慢将盖玻片放下盖在菌液上。 (2) (2) 将标本片放将标本片放将标本片放将标本片放3 3分钟后，先用低倍镜然后用分钟后，先用低倍镜然后用分钟后，先用低倍镜然后用分钟后，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况，并根据高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况，并根据高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况，并根据高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。颜色来区别死
33、活细胞。颜色来区别死活细胞。颜色来区别死活细胞。 2. 酵母菌液的计数酵母菌液的计数 ( (1) 1) 镜检计数室镜检计数室镜检计数室镜检计数室 对计数板进行镜检。若有污物，对计数板进行镜检。若有污物，则用自来水冲洗，用电吹风吹干后则用自来水冲洗，用电吹风吹干后 才能才能 进行计数。进行计数。 (2) (2) 加样品加样品加样品加样品 在血球计数板上盖上盖玻片在血球计数板上盖上盖玻片, , 用滴管用滴管将摇匀的酵母菌液由盖玻片边的小槽滴一小滴将摇匀的酵母菌液由盖玻片边的小槽滴一小滴, ,菌液菌液会自动进入计数室，静置会自动进入计数室，静置5 5分钟。分钟。 (3) (3) 计数计数计数计数 将
34、血球计数板置于载物台上，先用低将血球计数板置于载物台上，先用低倍镜找到计数室的位置，再换高倍镜计数。每计数倍镜找到计数室的位置，再换高倍镜计数。每计数室计室计5 5个中格（四角和中间）。计数原则：计上不计个中格（四角和中间）。计数原则：计上不计下，计左不计右。芽体占母细胞一半时算一个。下，计左不计右。芽体占母细胞一半时算一个。 (4) (4) 清洗血球计数板清洗血球计数板清洗血球计数板清洗血球计数板 计数后将血球计数板用自计数后将血球计数板用自来水冲洗干净，勿用硬物刷，吹干后镜检。若不干来水冲洗干净，勿用硬物刷，吹干后镜检。若不干净，则必须重复洗涤干净为止。净，则必须重复洗涤干净为止。4-4
35、五五. 结果记录结果记录1. 2. 2.酵母菌死活细胞的比例？酵母菌死活细胞的比例？ 六六. 思考题思考题 用此法计数的结果是活菌体还是死、活菌用此法计数的结果是活菌体还是死、活菌用此法计数的结果是活菌体还是死、活菌用此法计数的结果是活菌体还是死、活菌体的总和？体的总和？体的总和？体的总和？4-5实验五活性污泥不同微生物种群实验五活性污泥不同微生物种群的分离培养与鉴别的分离培养与鉴别 一一. 目的目的 1掌握配制培养基和制备无菌水的方法。掌握配制培养基和制备无菌水的方法。 2. 学会玻璃器皿的干热灭菌和培养基高压蒸汽学会玻璃器皿的干热灭菌和培养基高压蒸汽灭菌技术。灭菌技术。 3. 学习倒平板的
36、方法和两种分离微生物的基本学习倒平板的方法和两种分离微生物的基本操作技术。操作技术。 4. 学习微生物纯种分离、培养及菌落的观察。学习微生物纯种分离、培养及菌落的观察。5-1 二二. 实验器材实验器材 1.培养皿、试管、吸管、锥形瓶等。培养皿、试管、吸管、锥形瓶等。 2.牛皮纸等包扎材料。牛皮纸等包扎材料。 3. 10% HCl、10% NaOH、精密、精密pH试纸。试纸。 4. 牛肉膏、蛋白胨、牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂。、琼脂。 5. 高压蒸汽灭菌锅等。高压蒸汽灭菌锅等。 6. 活性污泥。活性污泥。 7接种环、酒精灯、恒温箱接种环、酒精灯、恒温箱(培养箱培养箱)等。等。 8结晶紫染液。
37、结晶紫染液。 9. 显微镜、载玻片显微镜、载玻片 三三. 实验内容实验内容 （一）培养基的制备及灭菌（一）培养基的制备及灭菌（一）培养基的制备及灭菌（一）培养基的制备及灭菌1. 1. 玻璃器皿的包扎与灭菌玻璃器皿的包扎与灭菌玻璃器皿的包扎与灭菌玻璃器皿的包扎与灭菌 （1 1） 六套培养皿一组六套培养皿一组六套培养皿一组六套培养皿一组, , 用报纸包装。用报纸包装。用报纸包装。用报纸包装。 （2 2） 取四支吸量管，在其吸端塞少许棉花后用取四支吸量管，在其吸端塞少许棉花后用取四支吸量管，在其吸端塞少许棉花后用取四支吸量管，在其吸端塞少许棉花后用长报纸条包扎。长报纸条包扎。长报纸条包扎。长报纸条包
38、扎。 （3 3） 干热灭菌干热灭菌干热灭菌干热灭菌: :上述玻璃器皿在上述玻璃器皿在上述玻璃器皿在上述玻璃器皿在160160 C C烘箱内烘箱内烘箱内烘箱内2 2小小小小时。时。时。时。 2. 2.无菌水的制备无菌水的制备无菌水的制备无菌水的制备 在在在在3 3支试管中各装入支试管中各装入支试管中各装入支试管中各装入9ml9ml自来水，塞上硅胶塞自来水，塞上硅胶塞自来水，塞上硅胶塞自来水，塞上硅胶塞, , 同下同下同下同下述培养基一起用高压蒸汽灭菌。述培养基一起用高压蒸汽灭菌。述培养基一起用高压蒸汽灭菌。述培养基一起用高压蒸汽灭菌。 5-23. 培养基的制备培养基的制备 称量：称量：称量：称量
39、：牛肉膏牛肉膏牛肉膏牛肉膏 蛋白胨蛋白胨蛋白胨蛋白胨 NaCl NaCl 琼脂琼脂琼脂琼脂 自来水自来水自来水自来水 0.75g 1.5g 0.75g 3g 150ml 0.75g 1.5g 0.75g 3g 150ml 溶化：溶化：溶化：溶化：用烧杯在电炉上将上述各物依次溶解，注意补充水用烧杯在电炉上将上述各物依次溶解，注意补充水用烧杯在电炉上将上述各物依次溶解，注意补充水用烧杯在电炉上将上述各物依次溶解，注意补充水。 调调调调pHpH值：值：值：值： 溶液稍冷后用溶液稍冷后用溶液稍冷后用溶液稍冷后用pHpH试纸、试纸、试纸、试纸、10% NaOH10% NaOH或或或或10%HCl10%H
40、Cl 调整溶液调整溶液调整溶液调整溶液 的的的的 pH pH在在在在7.67.6左右左右左右左右。 分装：分装：分装：分装：试管试管试管试管4 4支各装其高度支各装其高度支各装其高度支各装其高度1/51/5的溶液，其余溶液装锥形瓶。的溶液，其余溶液装锥形瓶。的溶液，其余溶液装锥形瓶。的溶液，其余溶液装锥形瓶。 加塞包扎加塞包扎加塞包扎加塞包扎 ：锥形瓶加棉塞并用牛皮纸包扎。锥形瓶加棉塞并用牛皮纸包扎。锥形瓶加棉塞并用牛皮纸包扎。锥形瓶加棉塞并用牛皮纸包扎。 湿热灭菌湿热灭菌湿热灭菌湿热灭菌 ： （高压蒸汽灭菌）（高压蒸汽灭菌）（高压蒸汽灭菌）（高压蒸汽灭菌）1.05kg/cm1.05kg/cm
41、2 2(103kPa)(103kPa)、 121121灭菌灭菌灭菌灭菌 20min20min。 搁置斜面：搁置斜面：搁置斜面：搁置斜面： 试管培养基冷至试管培养基冷至试管培养基冷至试管培养基冷至5050时斜搁使斜面长度不时斜搁使斜面长度不时斜搁使斜面长度不时斜搁使斜面长度不 超过试管一半超过试管一半超过试管一半超过试管一半。5-3（二）微生物的分离、培养及形态观察（二）微生物的分离、培养及形态观察1. 平板划线分离法平板划线分离法 (1) (1) 倒平板倒平板倒平板倒平板: : 将融化并冷至将融化并冷至将融化并冷至将融化并冷至5050的细菌培养基倒约的细菌培养基倒约的细菌培养基倒约的细菌培养基
42、倒约1520ml1520ml于无菌培养皿中，立即放在桌上轻轻转动使之于无菌培养皿中，立即放在桌上轻轻转动使之于无菌培养皿中，立即放在桌上轻轻转动使之于无菌培养皿中，立即放在桌上轻轻转动使之均匀。冷后成平板。（均匀。冷后成平板。（均匀。冷后成平板。（均匀。冷后成平板。（3 3个）个）个）个） (2) (2) 划线：划线：划线：划线：在火焰旁，左手拿平板，右手拿接种环，取在火焰旁，左手拿平板，右手拿接种环，取在火焰旁，左手拿平板，右手拿接种环，取在火焰旁，左手拿平板，右手拿接种环，取一环菌液（原污水）在平板上划线。常用的方法有如下一环菌液（原污水）在平板上划线。常用的方法有如下一环菌液（原污水）在
43、平板上划线。常用的方法有如下一环菌液（原污水）在平板上划线。常用的方法有如下三种：三种：三种：三种： 划线完毕后划线完毕后划线完毕后划线完毕后盖上皿盖，倒置盖上皿盖，倒置盖上皿盖，倒置盖上皿盖，倒置于于于于3737恒温箱中恒温箱中恒温箱中恒温箱中培养培养培养培养4848小时后观小时后观小时后观小时后观察结果。察结果。察结果。察结果。6-1 2. 2.稀释平板分离法稀释平板分离法稀释平板分离法稀释平板分离法 ( (1) 1) 取样取样取样取样 (2) (2) 稀释水样稀释水样稀释水样稀释水样 以无菌操作按十倍稀释法用无菌吸量管以无菌操作按十倍稀释法用无菌吸量管以无菌操作按十倍稀释法用无菌吸量管以
44、无菌操作按十倍稀释法用无菌吸量管和无菌水将和无菌水将和无菌水将和无菌水将1010-3-3倍的水样稀释至倍的水样稀释至倍的水样稀释至倍的水样稀释至1010-4-4、1010-5-5、1010-6-6倍。倍。倍。倍。 (3) (3) 平板制作平板制作平板制作平板制作 将三套无菌培养皿编号，将上述三种浓将三套无菌培养皿编号，将上述三种浓将三套无菌培养皿编号，将上述三种浓将三套无菌培养皿编号，将上述三种浓度的水样各吸度的水样各吸度的水样各吸度的水样各吸0.5ml 0.5ml 于相应的培养皿中。加热融化培养基，于相应的培养皿中。加热融化培养基，于相应的培养皿中。加热融化培养基，于相应的培养皿中。加热融化
45、培养基，待其冷至约待其冷至约待其冷至约待其冷至约4545时以无菌操作倾注时以无菌操作倾注时以无菌操作倾注时以无菌操作倾注1015ml 1015ml 入培入培入培入培 养皿中，养皿中，养皿中，养皿中，马上将培养皿平马上将培养皿平马上将培养皿平马上将培养皿平 放桌上放桌上放桌上放桌上 轻轻转轻轻转轻轻转轻轻转 动使之混合均匀，动使之混合均匀，动使之混合均匀，动使之混合均匀， 冷却后冷却后冷却后冷却后 成平板。成平板。成平板。成平板。 倒置，于倒置，于倒置，于倒置，于 37 37培培培培 养养养养4848小时后观察小时后观察小时后观察小时后观察 结果。结果。结果。结果。 10-1 10-2 10-3
46、 10-4 10-5 10-66-23菌落形态特征的观察菌落形态特征的观察 观察平板上菌落的形态、结构、大小、菌落高度、颜色、观察平板上菌落的形态、结构、大小、菌落高度、颜色、观察平板上菌落的形态、结构、大小、菌落高度、颜色、观察平板上菌落的形态、结构、大小、菌落高度、颜色、透明度、气味及粘滞性等。透明度、气味及粘滞性等。透明度、气味及粘滞性等。透明度、气味及粘滞性等。 4 4微生物个体形态观察微生物个体形态观察微生物个体形态观察微生物个体形态观察 在观察了已培养好的各种微生物菌落形态以后，用结在观察了已培养好的各种微生物菌落形态以后，用结在观察了已培养好的各种微生物菌落形态以后，用结在观察了
47、已培养好的各种微生物菌落形态以后，用结晶紫单染色，进行显微镜的观察。并绘制形态图。晶紫单染色，进行显微镜的观察。并绘制形态图。晶紫单染色，进行显微镜的观察。并绘制形态图。晶紫单染色，进行显微镜的观察。并绘制形态图。 5. 5. 斜面接种技术斜面接种技术斜面接种技术斜面接种技术 在培养好的平板上选定一个在培养好的平板上选定一个在培养好的平板上选定一个在培养好的平板上选定一个 典典典典型的细菌菌落。将接种环在火焰上型的细菌菌落。将接种环在火焰上型的细菌菌落。将接种环在火焰上型的细菌菌落。将接种环在火焰上灼烧灭菌。以无菌操作法轻轻挑取灼烧灭菌。以无菌操作法轻轻挑取灼烧灭菌。以无菌操作法轻轻挑取灼烧灭
48、菌。以无菌操作法轻轻挑取少许菌种，迅速将接种环伸进斜面少许菌种，迅速将接种环伸进斜面少许菌种，迅速将接种环伸进斜面少许菌种，迅速将接种环伸进斜面试管中，在培养基上由底部向顶部试管中，在培养基上由底部向顶部试管中，在培养基上由底部向顶部试管中，在培养基上由底部向顶部轻轻划线。试管塞好棉塞，在轻轻划线。试管塞好棉塞，在轻轻划线。试管塞好棉塞，在轻轻划线。试管塞好棉塞，在3737培养培养培养培养4848小时后观察。小时后观察。小时后观察。小时后观察。6-4三三. 思考题：思考题：1. 1. 为什么干热灭菌比湿热灭菌所需要的温度高、为什么干热灭菌比湿热灭菌所需要的温度高、为什么干热灭菌比湿热灭菌所需要
49、的温度高、为什么干热灭菌比湿热灭菌所需要的温度高、时间长？时间长？时间长？时间长？2. 2. 培养基配好后，为什么必须立即灭菌？培养基配好后，为什么必须立即灭菌？培养基配好后，为什么必须立即灭菌？培养基配好后，为什么必须立即灭菌？ 3. . 分离活性污泥为什么要稀释水样分离活性污泥为什么要稀释水样分离活性污泥为什么要稀释水样分离活性污泥为什么要稀释水样? ? 你考虑怎样你考虑怎样你考虑怎样你考虑怎样来进行生物膜法中生物膜的纯种分离和培养来进行生物膜法中生物膜的纯种分离和培养来进行生物膜法中生物膜的纯种分离和培养来进行生物膜法中生物膜的纯种分离和培养? ?结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！37
