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1、1第七章第七章 白细胞血型白细胞血型Blood Type of Leukocyte 2人类白细胞抗原(human leucocyte antigen,HLA)是人类最复杂的显性遗传多态性系统,是人类基因组中基因密度最高的区域.重要功能:抗原的加工、呈递，控制免疫应答，调节免疫细胞间相互作用，对异体移植物的排斥、肿瘤监视、参与大量自身免疫疾病的发生等。法医学个体识别和亲权鉴定理想的遗传标志。HLA分型技术的发展：血清学、细胞学、基因分型。第一节第一节 白细胞血型遗传概述白细胞血型遗传概述3人类白细胞膜上有三种抗原：红细胞血型抗原、白细胞本身所特有的抗原(如CD4、CD8、Leu8等)、人类白细胞
2、抗原(HLA)。与其他组织共有的，也是最强的同种抗原是HLA 。又称移植抗原、组织(相容性)抗原。主要组织相容性抗原受控于一组紧密连锁的基因群组成的复合体，称为主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)。人类的MHC称为HLA系统。一、一、MHC和和HLA的概念的概念4二、二、HLA的研究简史的研究简史1980诺贝尔生理或医学奖获得者：诺贝尔生理或医学奖获得者：Baruj Benacerraf : USA ,Harvard Medical School Jean Dausset(1916) : France, Universit de Pa
3、ris, Laboratoire Immuno-Hmatologie George D. Snell : USA, Jackson Laboratory Dausset( Dausset(1958)确立第一个白细胞抗原(Mac),即HLA-A2。现在为止已召开13次国际专题会议。567三、三、HLA-、类抗原结构与细胞分布类抗原结构与细胞分布 存在于细胞表面，异二聚体跨膜蛋白，抗原结合部均由8条反向平行的折叠链和2条反向平行的螺旋链组成，称为肽结合槽(氨基酸多态性位于槽底部)。8 基因产物为基因产物为HLA-AHLA-A、B B、C C抗原，由重链和抗原，由重链和轻链两条多肽链构成。轻链为轻链
4、两条多肽链构成。轻链为22微球蛋白微球蛋白(m,15cs)(m,15cs)。 分为分为5 5个区个区:1:1、22、33、跨膜区和胞、跨膜区和胞浆区。浆区。( (一一) )HLA-类抗原的结构类抗原的结构101112酪疏水13 基因产物为基因产物为HLA-DRHLA-DR、DQDQ、DPDP抗原，抗原，由由和和两条多肽链构成。两条多肽链构成。( (二二) )HLA-类抗原的结构类抗原的结构1415 HLA- HLA-类抗原类抗原存在于有核细胞(含血小板和网织红细胞) 表面。淋巴细胞 肾、肝脏、心脏 神经组织、成熟的滋养细胞。存在形式：(1)膜结合：有核细胞表面；(2)可溶性：存在于血清、初乳和
5、尿液等体液中。 抗原提呈细胞抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)( (三三) )HLA类抗原的细胞分布类抗原的细胞分布分布分布功能功能类类有核细有核细胞表面胞表面提呈内源性提呈内源性AgAg肽肽, ,与与CD8CD8分子分子结合结合, ,限制限制TcTc细胞的杀伤细胞的杀伤类类APC,APC,活化活化T T 细胞细胞提呈外源提呈外源AgAg肽肽, ,与与CD4CD4分子结分子结合合, ,限制限制THTH作用作用17HLA-HLA-类分子抗原结合区的三维图类分子抗原结合区的三维图18HLA- ,HLA- ,类分子抗原肽复合物的三维图类分子抗原肽复合物的三维图19
6、 WHO对HLA的命名包括基因命名和抗原特异性命名。命名的原则有： 1以大写字母A 、 D 、 C 表示HLA 遗传区域中的座位。 2HLA 抗原特异性用数字表示。 由于历史原因， HLA - A 、 B 基因座上的抗原以发现先后秩序排列。因此HLA - A 、 B 座位上的抗原特异性编号不 重复，如A位有1、2、3、9、10，而B位有5、7、8、13等，其他座位上的抗原特异性编号从1开始。 3. 为防止与补体组分命名相混淆，HLA-C抗原特异性以Cw为字首命名。第二节第二节 HLA命名命名20 4. HLA命名以4位数字表示,前2位表示对应最相近的HLA抗原特异性,后2位表示亚型的等为基因。
7、 5. 如出现5位数字,代表“沉默取代”。(兼并密码) 6. 第6、7位数字代表相应的启动子(内含子或侧翼区)的序列多态性,如DRB4*0101102。 7. 末尾加英文字母N表示无效等位基因或不表达基因，如DRB4*0101102N。 8. 在不能区分等位基因，可允许最前面的2或4位数字表示该HLA的特异性，如A*02、DRB4*0111 宽特异性，窄特异性(亚型)第二节第二节 HLA命名命名24252627282930 2006年4月,WHO的HLA命名委员会正式命名的HLA-DRB基因位上的等位基因数为527,DRB1等位基因数为445。 3132 此区域结构特点：是免疫功能相关基因最集
8、中、最多的一个区域，128个基因中39.8%基因产物均具有免疫功能；是基因密度最高的一个区域，平均每16kb就有一个基因；是多态性最丰富的一个区域，至2006年己正式命名的等位基因数目达2000多个；是与疾病关联最为密切的一个区域。 第三节第三节 HLA的遗传的遗传 HLA基因(系统)定位于6p21.31，长3.6Mb(占人类基因组全序列长的0.12%)。是由一系列紧密连锁的基因座位所组成最具有多态性的复合遗传系统，确认了224个基因位点，128个为功能性基因。一、一、HLAHLA基因定位与基因结构基因定位与基因结构33343536224224个基因座个基因座,128,128功能基因功能基因3
9、7 1. 经典HLA 类基因区(classical class gene，HLA-a) 是指三个最早发现的功能位点，HLA-A，-B和-C。 HLA- a基因含8个外显子，多态性由外显子2和3决定。 （一）（一）HLA HLA 类基因区类基因区 HLA-类基因区长16002000kb,由4个部分组成：经典基因、非经典基因、假基因和MIC基因。他们相互交织排列在该区中。38 2.非经典HLA 类基因区(HLA-b) HLA-E，-F，-G, 因其有限的多态性及编码产物分布的局限性有别于HLA-a ，称为HLA-b 。已命名的等位基因有6个。多态性少，产物能结合抗原肽，参与NK细胞的识别。 3.假
10、基因(pseudogenes) 己经命名的假基因有HLA-L、-H、-K和-X。 4.MIC基因(MHC class chain-related，MIC) 已发现有MIC A、B、C、D、E。39 HLA类基因区(HLA-D区)长10001200kb，编码6条链和10条链。含有DR、DQ、DP、DOA、DOB和DM等6个亚区。 （二）（二）HLA HLA 类基因区域类基因区域40 1.DR亚区 DR亚区有一个DRA基因，有9个DRB基因(结构和长度在不同的单体型中有所不同,且链表达的数目也不一样)。DRBl等位基因已达445个，是D类区域中多态性最丰富的基因。 2.DQ亚区 有两对DQA和DQ
11、B 基因，正式命名的DQAl等位基因有20个，DQBl45个。 3.DP亚区 有两对DPA和DPB基因，DPAl和DPBl为功能基因。 4.DM区域 DMA基因具有多态性，已命名有4个等位基因。有6个DMB已被正式命名。 5.TAP和LMP区域 TAP基因也具多态性。5个TAPl等位基因和4个TAP2等位基因已被命名。41424344( (三三) HLA ) HLA 类基因区类基因区 类基因区域位于HLA类区域与类区域之间亦称中央区。类区域已被认为是人类基因组中基因密度最大的区域，平均每l5kb就有一个基因。 主要有：补体基因C2、B因子和C4; 21-羟化酶基因；热休克蛋白基因；TNF、LT
12、A和LTB基因：肿瘤坏死因子 (tumor necrosis factor，TNF),淋巴细胞毒 (lymphotoxin，LT)A和B基因。4546二、二、HLAHLA的遗传特点的遗传特点 1.1.显性遗传高度多态性显性遗传高度多态性 (polymorphism)(polymorphism) HLA复合体是由一系列紧密连锁的基因群所组成，每一个基因又由于其DNA序列的差异存在许多变异体称为等位基因，如A位点等位基因有325个，B有592个，DRBl有445个(2006)。人类HLA每个基因座上有众多等位基因,故多数个体是HLA杂合子。 如某个体HLA-A座位检测出A1和A2，该个体表现为HL
13、A-A1,A2。如用血清学检出一个抗原，如A1,有3种可能：纯合子；抗血清不完全，露检；存在至今未发现的抗原。称存在一个空白抗原，记作HLA-A1,-。不能断定一定是纯合子。47 两条染色体同一位点上的等位基因所编码的产物均可表达在同一细胞表面称为共显性。正是由于HLA系统的这种多基因性 (polygenism)和多态性使其成为目前多态性最丰富的一个系统，使每一个体都带有自己独特的一套生物学身份证。 每一个个体在任何一个基因位点上可拥有最多两个不同的等位基因，而且绝大多数个体在其两条染色体同一基因位点上的等位基因均不相同，称为该位点的杂合子。 48 2.单体(倍/元)型遗传 当亲代遗传信息传给
14、子代时，HLA单体型(haplotype)作为一个单位传下去。 鉴定时除单卵双生外，从亲属中选择供体最有效。子代得到父源和母源各一条HLA单体型，因此亲子间必为HLA半相同，而同胞之间可能有三种情况：1/4机会HLA完全相同 ；1/4完全不相同；有1/2为半相同（即一条单体型相同）。49 a b c d50 a b c d51 a b c d52 a b c d5354 a b ca d e55A1A2B5B7B5B7Cw1Cw2Cw1Cw2DR1DR3DR1DR3DQ2DQ3DP1DP2DQ2DQ3DP1DP25658 如白人中常见的Al-B8-DR3-DQ2单倍型。其中Al基因频率为0.1
15、2，B8基因频率为0.17，预期Al-B8单倍型应为0.120.17=0.02，但实际为0.09。 HLA系统的一个重要特点等位基因之间存在明显的连锁不平衡。 连锁的基因不是随机组合在一起，而是某些基因总是较多地在一起出现，而另一些又较少地在一起出现。这种单倍型基因非随机分布的现象称连锁不平衡(linkage disequilibrium) 。 3.3.连锁不平衡连锁不平衡59 不同人群HLA抗原分布有很大差异性,可能提供某些有关人类迁移和混杂的信息。对法医数据分析而言,HLA单体型频率是计算法医所需概率的依据。 三、三、HLAHLA群体分布群体分布 1. 1.不同人群不同人群HLAHLA抗原
16、分布有很大差异性抗原分布有很大差异性 我国北纬30度以北与以南人群的HLA单体型频率比较。6061 第四节第四节 HLA分型分型 血清学分型技术是利用抗HLA 标准血清检测未知淋巴细胞或B 。微量淋巴细胞毒试验主要用于检测HLA -A 、 B 、 C 、 DR 和DQ 基因座的抗原。 一、一、血清学分型血清学分型 HLA分型方法包括血清学、细胞学和基因分型等方法3类，由于血清学、细胞学HLA 分型方法存在方法繁杂、抗血清来源困难及质量不易控制等缺点，现已基本被HLA 基因分型方法取代。 。62 （一）HLA-类抗原的检测 HLA-A、B、C抗原型别鉴定均借助微量淋巴细胞毒试验(microlym
17、phocytotoxicity test)或称补体依赖的细胞毒试验(complement dependent cytotoxicity test),NHI技术。原理为取已知HLA抗血清加入待测外周血淋巴细胞，作用后加入补体，充分作用后加入染料，在倒置显微镜下判断结果，着染的细胞为死亡细胞，表示待检淋巴细胞表面具有已知抗血清所针对的抗原。标准抗血清取自多次经产妇或计划免疫志愿者。 （二）HLA-DR、DQ抗原检测 该两类抗原分型方法同HLA-类抗原，但所用抗血清须经过血小板吸收以去除针对类抗原的抗体。另外，待测细胞须是经纯化的B细胞。63微量淋巴毒试验微量淋巴毒试验商品商品HLAHLA分型板分型
18、板外周血外周血分离淋巴细胞、计数分离淋巴细胞、计数抗血清板抗血清板补体补体染料染料固定固定结果判断结果判断64 血清学分型存在诸多缺点： 标准分型抗体亲和力较弱、效价较低、易产生交叉反应； 缺少某些单价抗血清； 某些病理过程可能导致外周血淋巴细胞表面抗原性质发生改变干扰抗原-抗体反应； 国内供HLA-I类抗原分型的血清板来源困难、质量欠佳。上述因素均严重影响了HLA分型结果的可靠性及该技术的推广应用。 血清学分型是一项古老的技术，虽然近年来已建立许多新的分型技术，但血清学方法目前仍是HLA分型的基础。 65淋巴细胞培养试验主要检测HLA -D 和DP 基因座的抗原；HLA-Dw特异性与HLA-
19、DP特异性可分别通过纯合分型细胞（homozygote typing cell,HTC）及预致敏淋巴细胞试验（primed lymphocyte test,PLT）检测。二种方法的基本原理均是判断淋巴细胞在识别非已HLA抗原决定簇后发生的增殖反应。由于分型细胞来源困难以及操作手续繁琐，细胞学分型技术下正逐渐淘汰。 二、二、细胞学分型细胞学分型 66由抗原深入到基因水平。由抗原深入到基因水平。1991(111991(11届国际专题会议届国际专题会议) )讨论了讨论了HLA-HLA-类类DNADNA分型，分型，1996HLA-1996HLA-类类DNADNA分型。分型。HLAHLA分型方法都是针对
20、核苷酸序列差异设计的。分型方法都是针对核苷酸序列差异设计的。基于核酸序列识别的方法主要有：PCR-RFLP, PCR-SSO, PCR-SSP，PCR-SBT和序列测定。DNA分析可检测HLA所有等位基因。HLA分型方法包括顺序特异性引物多聚酶链反应(PCR-SSP)和寡核苷酸探针杂交(PCR-SSO)，但由于HLA复杂的多态性，不同等位基因含有许多相同序列，仅少数等位基因具有特异序列。对于杂合子个体，这些分型方法难以确定特定的模序属于哪一个等位基因。 三、三、DNADNA分型分型 67(一一)PCR-RFLP分型方法分型方法 PCR-RFLP技术：利用组间特异性引物先扩增目的DNA片段，扩增
21、产物再用多种限制酶消化、电泳分离获得DNA多态性。 先找到HLA某一基因座与HLA其他基因座不同的序列，但该序列是该基因座所有等位基因共有的，用于设计组间特异性引物。然后用限制酶切割扩增产物并计算酶切片段长度。选择用最少的酶切点，获得识别最多基因型的方案。68(二二)PCR-SSO分型方法分型方法PCR-SSO,也称PCR-ASO(allele specific oligonuceotide)。用人工合成的HLA型别特异的寡核苷酸序列作为探针，与待检细胞经PCR扩增的HLA基因片段杂交，从而确定HLA型别，PCR技术可将HLA复合体上指定基因片段特异性地扩增56个数量级；专门设计的SSO(序列
22、特异的寡核苷酸sequence specific oligonucleotide)探针又能探测出等位基因间12个核苷酸的差异。最终均需用标记的特性探针与扩增产物进行杂交，再分析结果。697071对照对照对照对照73PCR-ASO7576将各种不同的探针固定于同一张膜上，再将PCR产物标记，以PCR产物（待检测基因DNA）反过来与探针杂交。这样一次杂交即可完成多个等位基因分析。此方法具有灵敏度、特异性强、需样本量少等优点，但不同探针的杂交条件的须严格统一（如温度，离子强度）, 易出现误差;不能检测新等位基因，试剂盒需不断升级; 对某些杂合子分辨率也不好;。很多HLA基因型含有相同的多态性，而仅仅
23、由于排列方式不同，因此分辨率不及SSP和SBT。此方法适宜大量和高纯度样本，杂交条带将作为书面原始记录长期保存（三种效果比较）。77 （三）PCR-SSP技术 PCR-SSP方法 设计出一整套等位基因组特异性引物(sequence specific primer,SSP)，借助PCR技术获得HLA型别特异的扩增产物，可通过电泳直接分析带型决定HLA型别，从而大大简化了实验步骤。 优点是简单易行, 分辨率可从低到高, 成本低 。缺点是不易自动化;不能检测新的等位基因，试剂盒需不断升级。 此方法适宜零散和纯度低样本，重复实验时要重提DNA和必须使用紫外凝胶成象仪保留原始资料，增加实验成本（三种效果
24、比较）。 PCR-SSP和PCR-SSO均需大量试剂（引物）,且不能识别非经典的HLA基因和假基因。针对HLA外显子和内含子序列精心设计引物可避免这些问题。78此外，目前已建立的HLA基因分型技术还包括PCR单链构像多态性分析（PCR-single strand conformational polymorphism，PCR-SSCP）和PCR 异源二聚体电泳多态即PCR指纹图（PCR fingerprinting）分析。DNA分型技术的应用，使HLA型别分析达到了更精细的水平，并因此发现了更多的HLA多态性。HLA的DNA分型技术现已成为血清学方法的竞争者，并可能在不久的将来完全取而代之。P
25、CR-SSCPGAAGAGTGTTATCTCCACvsingle strand conformation polymorphism83四、测序分型方法 近年来，测序新技术发展层出不穷，纷纷运用到HLA分型中。如MSNE(multiplex single nucleaotide extention),应用链中止法原理，根据等位基因SNP位点设计特异性引物和生物素荧光标记的ddNTP进行分型，有重复性好，可分辨杂合子等优点，已应用到A位点的分型中。 又如pyrosequencing 法分型，分辨率好，可分辨杂合子，自动化程度也高。DNA芯片技术，作为一项检测SNP的成熟技术，也已应用到HLA 分型
26、中。84 HA(异源二聚体电泳多态性，Heteroduplex Analysis)是另一种基于序列分子构型的分型方法，根据异源二聚体未配对区域的长度和分布而显示出电泳条带不同。但与单链DNA相比，异源二聚体电泳条带过于复杂，难以分析。 新发展的RSCA（Reference Strand Mediated Conformation Analysis）技术根据HA的原理，设计了位点特异性荧光标记的参照DNA片段，与样本DNA分子的正反链形成异源二聚体.带有荧光标记的电泳条带易于分析，能够克服HA的不足。 针对微量基因组模板的情况，现已开发出基于滚环复制的全基因组扩增技术，可以将1ng的模板扩大至100ng，足以应付PCR-RFLP、PCR-SBT等分型技术的要求。 相信随着分子生物学技术的发展，未来HLA分型技术会向着更便捷，准确的方向前进。 86 1.解释下列名词：单倍(元/体)型 连锁不平衡 2. 何为HLA，简述HLA命名的主要原则。 3. 概述HLA的遗传特征。 4. 比较HLA血清学分型和DNA分型方法的优缺点。思考与练习思考与练习87Thanks for your watching and listening!
