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1、实验五 梅毒螺旋体抗体检测1实验目的1.掌握临床常用检测梅毒感染的方法及操作程序3.了解多种方法联合检测梅毒感染的临床意义2.熟悉两种方法的特点2梅毒螺旋体感染的常用检测方法TRUST （检测非特异抗体）TPPA(检测特异性抗体）ELISA (检测特异性抗体）现症梅毒的主要指标同时是判断治疗效果、复发的指标特异性强，准确性高，但无法判断是否为现症梅毒敏感性高，有一定的假阳性率不同方法具有各自的特点梅毒感染检测3（一） TRUST实验 实验原理实验原理凝集法凝集法- -检测非特异性抗体检测非特异性抗体+抗心类脂抗原反应卡滴加血清产生凝集现象抗原中加入了甲苯胺红染料，因甲苯胺红颗粒均匀，结果易于观
2、察4实验试剂及器材1.实验试剂 甲苯胺红溶液重悬的类脂抗原、阳性对照血清、阴性对照血清，2.实验器材 滴管、反应纸卡5操作步骤一、甲苯胺红不加热血清试验（一、甲苯胺红不加热血清试验（TRUSTTRUST） 1.试剂及待检血清室温下平衡10min 2.在样本圈内加入待检血清及阴性、阳性血清，每圈50l，尽量将血清铺匀涂满但不要超出卡圈 3.垂直向血清中心加入抗原1滴 4.旋转摇动卡片8分钟后立即观察结果 6加血清加抗原旋转摇动观察结果7结果分析甲苯胺红不加热血清试验（甲苯胺红不加热血清试验（TRUSTTRUST）阴性：呈现粉红色均匀分散的沉淀物阴性：呈现粉红色均匀分散的沉淀物阳性：出现粉红色凝集
3、块，根据凝集块大小可以分为阳性：出现粉红色凝集块，根据凝集块大小可以分为4 4个阳个阳性级别（性级别（1+1+4+4+）阴性阴性阳性阳性弱阳性弱阳性8实验注意事项稀释血清应准确及避免交叉污染及时观察实验结果抗体浓度过高可能发生前带现象而致假阴性,若TPPA或ELISA检测结果为阳性或弱阳性，需生理盐水稀释样本后重复实验。9临床意义 1.TRUST实验为梅毒螺旋体感染的血清学过筛试验，阴性不可排除感染，阳性需用特异性抗体的检测方法进行确认。2.TRUST实验对现症梅毒的诊断具有较高价值，通过连续监测抗体滴度能够动态反映病程，此法在一期、二期梅毒的阳性率较高，与ELISA或TPPA检测结果综合分析
4、能够更准确的诊断疾病。10（二） TPPA法-检测特异性抗体 明胶颗粒间接凝集实验（明胶颗粒间接凝集实验（明胶颗粒间接凝集实验（明胶颗粒间接凝集实验（TPPATPPATPPATPPA法法法法) ) ) )11实验试剂及器材1.实验试剂 血清稀释液、致敏粒子、未致敏粒子以及其相应的溶解液，阳性对照血清2.实验器材 专用滴管、反应板、微量加样器、微量加样器吸头、移液管12管号1234567稀释液(l)100252525252525待 检 血 清(l)25252525252525未 致 敏 颗 粒(l)-25-致 敏 颗 粒(l)-25252525最终稀释倍数-1:401:801:1601:3201
5、:6401 2 3 4 5未致敏颗粒致敏颗粒倍比稀释血清TPPATPPA法操作步骤法操作步骤13结果分析 TPPA间接凝集实验：1）反应图像的判定 阴性（-）： 粒子集中于孔底呈纽扣状，呈现外周边缘均匀平滑的圆圈 弱阳性（+）：粒子形成小环状，呈现外周边缘均匀平滑的圆圈 阳性（+）：粒子环明显变大，其外周边缘不均匀且杂乱地凝集在周围。 强阳性（+）：产生均匀的凝集，凝集粒子在底部整体上呈膜状延展。142）最终判定基准：未致敏粒子的反应图像应为阴性。致敏粒子（最终稀释度1:80及以上）反应图像为阳性，最终应判定为阳性。反应图像为阳性的最终稀释倍数作为抗体效价。 1:40 1:80未致敏颗粒阴性致
6、敏颗粒 阳性阳性对照最终判断：阳性待检血清15注意事项1.试剂及检测样品应充分混匀，及时更换加样吸头避免交叉污染。2.实验中不能随意移动反应板，否则容易造成假阳性。3.保证足够的反应时间、及时观察结果。4.阳性结果用另一种方法如ELISA法复查。16临床意义 梅毒螺旋体感染后2周左右患者血清中即可出现特异性IgM抗体，4周左右即可检测出特异性IgG抗体，TPPA法为检测 特异性IgG抗体的较好方法之一，其阳性可以提示曾经或现 在感染梅毒，与TRUST法的检测结果综合分析对梅毒的诊断、分期及治疗效果评价具有重要价值。17实验讨论梅毒血清学的联合应用对梅毒诊断有何意义？梅毒血清学的联合应用对梅毒诊
7、断有何意义？18实验讨论TRUST法检测非特异性抗体，是现症梅毒患者实验室诊断的重要指标，但初期或晚期梅毒病人抗体浓度较低可出现假阴性，抗体浓度过高时出现前带现象也可出现假阴性，而某些疾病如自身免疫性疾病则可出现假阳性。TRUST检测的非特异性抗体在感染1-2周即可出现，如滴度14，又具有典型的临床表现，则现症梅毒的可能性较大。需注意TRUST检测结果阳性需谨慎对待，低滴度(14)除可能为生物学造成的假阳性外，还有可能是发病初期或使用抗生素延长了阳性血清出现的潜伏期。TRUST滴度与病情活动呈正相关，并且可作为判定复发或再感染指征,对于高滴度者(18)应考虑为现症梅毒病人，并结合临床症状给予适
8、当治疗。19实验讨论ELISA检测梅毒抗体具有较高的敏感性，并可用全自动酶标仪进行批量初筛，但特异性稍差，有一定的假阳性率，采用ELISA两步法可在一定程度上提高检测结果的敏感性和可靠性。TPPA法特异性及敏感性均较高，可作为ELISA法及TRUST法筛查的确证实验。但该方法操作复杂费时。ELISA和TPPA两种方法检测的梅毒抗体均为特异性抗体，该抗体即使经治疗后也可终生阳性，因此不能作为评价治疗效果，复发或再感染的指标。20实验讨论综合应用特异性抗体和非特异性抗体两种方法检测及滴度分析不仅能够提高梅毒感染检测的敏感性和特异性，同时能够进行疗效观察，对于早期发现，早期诊断，早期治疗梅毒患者以及有效控制梅毒流行具有重要意义。21
