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1、 基因探基因探基因探基因探针针CHEN PU YANCHEN PU YANCHEN PU YANCHEN PU YAN 基因探针基因探针 基因探针又称核酸分子杂交技术，是在基因探针又称核酸分子杂交技术，是在1968年年由华盛顿卡内基学院由华盛顿卡内基学院Cavnegie Institute of Washington的的Roy Britten及其同事发明的。及其同事发明的。 基因探针是指能与特定的靶分子序列发生特异基因探针是指能与特定的靶分子序列发生特异性相互作用的标志分子性相互作用的标志分子.也就是指一段能识别也就是指一段能识别(与目的序列或靶序列互补与目的序列或靶序列互补)特特异性碱基序列
2、异性碱基序列(基因基因)的标志同位素等标志物的单的标志同位素等标志物的单链链DNA或或RNA的分子。的分子。检测检测DNA的技术称为的技术称为.Southern blot杂交杂交.检测检测RNA的技术称为的技术称为. Northern blot杂交杂交.检测蛋白质的技术称为检测蛋白质的技术称为.Western blot杂交杂交.还有还有dot blot,原位杂交技术等原位杂交技术等.杂交类型杂交类型固相杂交固相杂交液相杂交液相杂交核酸分子杂交核酸分子杂交(固相杂交固相杂交)Northern 杂交Southern 杂交 芯片以上方法决议杂交模板核酸性质,DNA Southern 杂交. RNA
3、Northern 杂交探针与核酸杂交的方法探针与核酸杂交的方法1斑点杂交斑点杂交(dot-blot)2菌落菌落/噬菌斑：转印挑选法噬菌斑：转印挑选法3组织组织/细胞细胞(DNA或或RNA)：原位杂交：原位杂交(in situ hybridization ISH) .Southern-blot(DNA)、Northern-blot(RNA) DNA和和RNA操作根本一样，只是电泳所操作根本一样，只是电泳所用的胶有所不同用的胶有所不同(RNA易构成二级构造易构成二级构造)探探针基因的分基因的分别制制备同位素或非同位素同位素或非同位素标志志标志基因探志基因探针的的纯化化检测样品核酸制品核酸制备杂交膜
4、制交膜制备或或转印印预杂交交杂交交洗膜洗膜图图3-3 核酸探针杂交实验全过程表示图核酸探针杂交实验全过程表示图abc d e基因组基因组DNADNA限制片段限制片段硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的基同探针同源杂交的基因因DNA片段片段X光底片光底片Southern Southern 凝凝胶胶转移移杂交交技技术RNA印迹技术印迹技术Northern blotting 1979年，年，J.C.Alwine等人开展而来，是将等人开展而来，是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进展核酸杂交的其他化学修饰的活性滤纸上，进展
5、核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与萨瑟恩一种实验方法。由于这种方法与萨瑟恩DNA印印迹杂交技术非常类似迹杂交技术非常类似,所以叫做诺赛恩所以叫做诺赛恩RNA印迹印迹技术技术Northern blotting。 而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射性同位素滤膜上，然后同放射性同位素125I标志的特定标志的特定蛋白质之抗体进展反响蛋白质之抗体进展反响,这种技术叫做韦斯顿蛋这种技术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术白质杂交技术Western blotting。斑点印迹斑点印迹杂交和狭交和狭线印迹印迹杂交交 斑点印迹斑点印迹杂交交dot blotti
6、ng和和狭狭线印迹印迹杂交交slot blotting 是在是在Southern印迹印迹杂交的根底上开展的交的根底上开展的量种量种类式的快速式的快速检测特定核酸特定核酸DNA和和RNA分子的核酸分子的核酸杂交技交技术。由于。由于在在实验的加的加样过程中运用了特殊程中运用了特殊设计的加的加样安装，使众多待安装，使众多待测样品可以一品可以一次同步次同步转移到移到杂交交滤膜上，并有膜上，并有规律律地地陈列成点列成点阵或或线阵。这两两项技技术更更顺应与核酸与核酸样品的定量品的定量检测。检测检测重重重重组组体克隆的菌落体克隆的菌落体克隆的菌落体克隆的菌落杂杂交技交技交技交技术术菌落菌落杂交交原位杂交原位
7、杂交(in situ hybridization ISH)原位核酸分子杂交技术简称原位杂交原位核酸分子杂交技术简称原位杂交(in situ hybridization ISH)是运用知碱基顺是运用知碱基顺序并带有标志物的核酸探针与组织、细胞序并带有标志物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原那么进展中待检测的核酸按碱基配对的原那么进展特异性结合而构成杂交体，然后再运用与特异性结合而构成杂交体，然后再运用与标志物相应的检测系统，经过组织化学或标志物相应的检测系统，经过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位构免疫组织化学方法在被检测的核酸原位构成带颜色的杂交信号，在显微镜或电子显
8、成带颜色的杂交信号，在显微镜或电子显微镜下进展细胞内定位。微镜下进展细胞内定位。 一、基因探针一、基因探针1DNA酶切片段酶切片段2用用PCR 扩增出的核酸扩增出的核酸3直接用直接用RNA作探针作探针4人工合成含标志人工合成含标志1. 基因探针的类型基因探针的类型2. 基因探针的要求基因探针的要求1尽量防止高度反复序列：根据目的而定。最好用尽量防止高度反复序列：根据目的而定。最好用cDNA(要要将将polyA或或polyT去掉去掉)。2G+C含量：含量：40-60%3探针本身不能有探针本身不能有4个延续互补碱基，否那么本身构成二级构个延续互补碱基，否那么本身构成二级构造。造。4不主张几个延续一
9、样碱基不主张几个延续一样碱基5检测目的核酸时，要思索模板出现率。兼并性检测目的核酸时，要思索模板出现率。兼并性6探针比模板短：实践用长探针检测短模板的也可，不影响探针比模板短：实践用长探针检测短模板的也可，不影响结果。结果。3. 核酸探针杂交所用的固相载体核酸探针杂交所用的固相载体1芯片：种类多，用于工业消费，见各公司引见。芯片：种类多，用于工业消费，见各公司引见。2硝酸纤维膜硝酸纤维膜(NC膜膜)：吸附单链：吸附单链DNA、RNA才干强，才干强，80-100 ug/cm2；也可非特异性吸附蛋白，但吸附率比核酸低。缺陷：脆、；也可非特异性吸附蛋白，但吸附率比核酸低。缺陷：脆、易折断；不能吸附小
10、片段易折断；不能吸附小片段DNA。3尼龙膜：吸附尼龙膜：吸附DNA才干比才干比NC膜强，也可吸附小至膜强，也可吸附小至10bp的的DNA。优点：易把模板固定在膜上；可反复运用多次。优点：易把模板固定在膜上；可反复运用多次。4化学活化膜：用化学试剂把化学活化膜：用化学试剂把NC膜处置，可吸附极少量核酸。也膜处置，可吸附极少量核酸。也可用普通滤纸。可用普通滤纸。5滤纸滤纸核酸杂交常用几种膜的性核酸杂交常用几种膜的性能比较能比较硝酸纤维膜硝酸纤维膜(NC膜膜)硝酸硝酸纤维膜有两种膜有两种;0.22m孔孔经0.45m孔孔经4. 基因探针的标志物基因探针的标志物1同位素：同位素：H3、 S35、 P32
11、 最常用缺陷：不能保管最常用缺陷：不能保管2非同位素：非同位素： 地高辛：植物中提取。商品化地高辛地高辛：植物中提取。商品化地高辛标志志dCTP，即，即合成合成链时，用地高辛，用地高辛标志志dCTP。dCTP-地高辛与地高辛与酶标抗抗地高辛抗体反响，加底物地高辛抗体反响，加底物显色。色。 生物素生物素-亲和素：用和素：用酶标亲和素和素测dCTP-生物素生物素 荧光：送生物公司光：送生物公司标志志5. 探针标志方法探针标志方法1DNA的切口平移的切口平移2随机引物法随机引物法3单链DNA探探针4RNA探探针5DNA的的5或或3末端末端标志志6寡核苷酸寡核苷酸标志志7PCR标志志DNA的切口平移法
12、的切口平移法 双双链DNA分子的一条分子的一条链有切口有切口时，大，大肠杆菌杆菌DNA聚合聚合酶I可把核苷酸残基加到切口可把核苷酸残基加到切口处的的3羟基端。且由基端。且由于此于此酶具有具有5 3外切外切酶活性，它活性，它还可以从切口的可以从切口的5端端除去核苷酸。除去核苷酸。5端核苷酸的去除与端核苷酸的去除与3端核苷酸的参与同端核苷酸的参与同时进展，展，导致切口沿着致切口沿着DNA链挪挪动(切口平移切口平移)。切口平移的反响体系切口平移的反响体系探探针DNA 0.5ug10切口平移切口平移缓冲液冲液 2.5uL10dNTP无无dCTP 每种每种20nmolDNase I (10ng/mL)
13、2.5uLDNA聚合聚合酶I 2.5单位位-32P dCTP 16pmol加加dH2O 至至25uL 1416 12h 加加1uL0.5mol/L EDTA(pH8.0)终止反响止反响随机引物法随机引物法 DNA聚合聚合酶利用寡核苷酸作引物，沿利用寡核苷酸作引物，沿单链模板合成模板合成DNA。假。假设寡核苷酸的序列不均一，它寡核苷酸的序列不均一，它们就会在模板的就会在模板的许多位置上和模板多位置上和模板杂交，因此模板上的每个核苷酸交，因此模板上的每个核苷酸(能能够要除去最接近要除去最接近5端的一些核苷酸端的一些核苷酸)被拷被拷贝进产物中去的物中去的频率一率一样。运用。运用-32P dNTP 作
14、作为前体，用此法可合成比前体，用此法可合成比活度非常高的活度非常高的标志志DNA探探针。随机引物的获得：随机引物的获得：1用用DNA酶I消化小牛胸腺消化小牛胸腺DNA或或鲑精精DNA 产生大量生大量612 核苷酸的核苷酸的单链DNA。2从一些厂家从一些厂家购买用小牛胸腺用小牛胸腺DNA制制备的随机引物。的随机引物。如如Pharmacia、Boehringer、Mannheim等。等。3在自在自动DNA合成合成仪上合成一个八聚体集群，上合成一个八聚体集群，这一分一分子集群在八聚体的每一个位置上都含有一切子集群在八聚体的每一个位置上都含有一切4种碱基。种碱基。单链单链DNA探针探针 单链探针仅由特
15、定核酸序列的互补双链之一组成，与传统的双链探针相比有很大的优越性。由于不存在互补链，因此可以消除由探针的两条链重退火构成无效杂交体的能够性。当用来自某一种生物中的探针去检测另一种远缘生物中可与之交叉杂交的序列时，单链探针尤为有用。 由DNA模板体外制备单链探针有两种方法：1合成可与克隆于嗜菌粒或M13噬菌体载体上的序列互补的放射性标志DNA图3-12将克隆于特定载体上的靶序列转录成放射性标志的RNA，在此载体上带有可被噬菌体依赖于DNA的RNA聚合枚识别的启动子。将靶序列克隆于适当的将靶序列克隆于适当的M13噬菌体或噬菌噬菌体或噬菌粒载体中，分别出带有靶序列的单链粒载体中，分别出带有靶序列的单
16、链DNA通用引物通用引物利用通用引物合成与靶序列利用通用引物合成与靶序列互补的放射性标志互补的放射性标志DNA大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合聚合酶酶I Klenow片段片段3种未标志种未标志dNTP1 种种32p标志标志dNTP用切点位于靶序列远端的用切点位于靶序列远端的限制酶来消化限制酶来消化 DNA 经过凝胶电泳把标志探针与未标志的的模板分开放射性放射性标志的标志的规范参规范参照物照物未标志的未标志的模板模板DNA放射性标放射性标志的志的DNA来自来自标志志DNA 3端端的片段的片段利用单链利用单链DNA载体合成探针载体合成探针(从左到右从左到右)RNA探针探针 在来自鼠在来自鼠伤寒杆菌寒杆菌
17、SP6噬菌体或来自大噬菌体或来自大肠杆菌杆菌T7及及T3噬菌体的噬菌体的强启启动子子下游安装多克隆位点，下游安装多克隆位点，组建成建成质粒粒载体，可合成高比活度的体，可合成高比活度的单链RNA探探针。RNA探探针具有具有许多多优越性：越性：1放射性放射性标志志RNA的合效果率高。由于用于合成的合效果率高。由于用于合成RNA的模板可被的模板可被转录多次，多次，所以所以产生的生的RNA数倍于模板。数倍于模板。2rNTP的的浓度相度相对交低交低时(1-20umol/L)，噬菌体依，噬菌体依赖于于DNA的的RNA聚合聚合酶也能在体外也能在体外发扬作用，所以合成高比活度全作用，所以合成高比活度全长探探针
18、的本的本钱相相对较低。低。3仅用无用无RNA酶的的DNA酶I处置就可从置就可从RNA探探针中除去模板中除去模板DNA。而不用用。而不用用凝胶凝胶电泳泳进展展纯化。化。4由于由于RNA杂交体的交体的稳定性本身就比定性本身就比较高，所以高，所以RNA杂交反响中交反响中产生的信号生的信号普通要比一普通要比一样比活度的比活度的DNA探探针强。5RNA探探针的运用改良了分析哺乳的运用改良了分析哺乳动物基因物基因转录物的方法。可用物的方法。可用RNA酶A来来消化消化RNA RNA杂交体，而不用用交体，而不用用难以控制的以控制的S1核酸核酸酶来消化来消化DNA RNA杂合合分子。分子。多克隆位点多克隆位点S
19、P6启动子启动子T7启动子启动子将靶序列克隆于带有噬菌体启动子的质将靶序列克隆于带有噬菌体启动子的质粒中，这些启动子可被噬菌体编码的依粒中，这些启动子可被噬菌体编码的依赖于赖于 DNA的的RNA聚合酶所识别聚合酶所识别用切点位于靶序列用切点位于靶序列远端的限制端的限制酶消化消化重重组质粒粒产生平端或生平端或3凹端凹端SP6启动子启动子T7启动子启动子SP6噬菌体依赖于噬菌体依赖于DNA的的RNA聚合酶聚合酶3种未标志种未标志rNTP1种种32p标志标志rNTP用用DNA酶酶I消化以去除模板消化以去除模板DNA32p标志的标志的RNA体外转录合成体外转录合成RNA探针探针(从左到右从左到右)DN
20、A的的5或或3末端末端标志志 不同的末端不同的末端标志用不同的志用不同的酶：1大大肠杆菌杆菌DNA聚合聚合酶I的的Klenow片段：片段：3末端末端标志志2T4噬菌体多核苷酸激噬菌体多核苷酸激酶：标志志DNA 5端端3T4噬菌体噬菌体DNA聚合聚合酶：标志志DNA3端端寡核苷酸标志寡核苷酸标志T4噬菌体多核苷酸激噬菌体多核苷酸激酶酶：合成的寡核苷酸在合成：合成的寡核苷酸在合成时时其其5端短少一个端短少一个磷酸基，因此极易用磷酸基，因此极易用T4噬菌体多核苷酸激噬菌体多核苷酸激酶酶进进展磷酸化反响，从而将展磷酸化反响，从而将-32p从从-32pATP转转移至其移至其5端。端。大大肠肠杆菌杆菌DN
21、A聚合聚合酶酶I Klenow片段：用大片段：用大肠肠杆菌杆菌DNA聚合聚合酶酶I Klenow片段合成与合成寡核苷酸互片段合成与合成寡核苷酸互补补的的 DNA链链，可得到高比活度的探，可得到高比活度的探针针。用一短引物与寡核苷酸模板。用一短引物与寡核苷酸模板结结合，后者的序列互合，后者的序列互补补于所用的放射于所用的放射性性标标志探志探针针。该该引物随后在大引物随后在大肠肠杆菌杆菌DNA聚合聚合酶酶I Klenow片段的作用片段的作用下延伸，从而使下延伸，从而使-32pdNTP在模板指点下在模板指点下发发生生掺掺入。入。标志基因探针的纯化标志基因探针的纯化1乙醇沉淀法乙醇沉淀法2CPB沉淀法
22、：回收用磷酸盐缓冲液从羟基磷石灰层沉淀法：回收用磷酸盐缓冲液从羟基磷石灰层析柱洗脱下来的析柱洗脱下来的DNA3 放射性标志探针的纯化放射性标志探针的纯化:19%PAGE电泳、电泳、Bio-Gel P-60柱或柱或Sep-Pak柱层析柱层析1探针浓度探针浓度同位素同位素标志的探志的探针：5-100ug/mL非同位素非同位素标志的探志的探针：25-1000ug/mL原位原位杂交：交：0.5-5.0ug/mL注：注：2 随机多聚体随机多聚体硫酸葡聚糖：硫酸葡聚糖：5-10%PEG6000-8000聚丙稀酸聚丙稀酸钠盐：2-4% 转印虹吸印迹法 电转移法 DNA片段大小影响转移速度. 预杂交预杂交用用
23、DNA酶酶I消化并变性的小牛胸腺消化并变性的小牛胸腺DNA或鲑精或鲑精DNA封封锁膜锁膜. 杂交液杂交液 5XSSC 20mmol/L鳞酸缓冲液 (pH7.0) 5XDenholdt氏液 10% 硫酸葡聚糖 100g/ml变性小牛胸腺DNA或鲑精DNA . 50% 甲酰胺洗涤液 2XSSC, 0.5%SDS 5min.2XSSC, 0.1 % X SDS 15 min.(室温).0.1XSSC, 0.1 % X SDS 37 C 30min至1h. 0.1XSSC, 0.1 % X SDS 65 C洗涤30min至1h.( 水浴)显影(放射性,非放射性)n原位杂交原位杂交n原位杂交原位杂交19
24、69年美国耶鲁大学年美国耶鲁大学Gall和和Pardue首先创建的，他们用爪蟾核首先创建的，他们用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。定该基因定位于卵母细胞的核仁中。 原位杂交技术的根本方法：原位杂交技术的根本方法：(一一),杂交前探针种类选择。杂交前探针种类选择。(二二),杂交前探针标志方法选择。杂交前探针标志方法选择。(三三),探针的纯化。探针的纯化。(四四),杂交前预备杂交前预备,包括固定、取材、玻片和组织包括固定、取材、玻片和组织的处置，加强核酸探针的穿透性、减低背景染色的处置，加强核酸探针的穿透性、减低背景染色等。等。
25、(五五),组织的前处置。组织的前处置。(六六),预杂交。预杂交。(七七),原位杂交。原位杂交。(八八),杂交后处置杂交后处置(漂洗漂洗)。 (九九),杂交后显色。杂交后显色。原位杂交固定原位杂交固定目的是为了坚持细胞形状构造，最大限制目的是为了坚持细胞形状构造，最大限制地保管细胞内的地保管细胞内的DNA或或RNA的程度；使探的程度；使探针易于进入细胞或组织。针易于进入细胞或组织。DNA是比较稳定是比较稳定的，的，mRNA是相对稳定的但易为酶合成和是相对稳定的但易为酶合成和降解。降解。RNA更易被酶降解，应思索到取材更易被酶降解，应思索到取材至进入固定剂或冰冻这段时间对至进入固定剂或冰冻这段时间
26、对RNA保管保管所带来的影响，因组织中所带来的影响，因组织中mRNA的降解是的降解是很快的。很快的。 固定剂固定剂最常用多聚甲醛固定组织。醋酸酒精的混合液和Bouins固定剂也能获得较称心的效果。mRNA的定位将组织固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中12 h，在冷冻前浸入15%蔗糖溶液中，置4冰箱过夜，次日切片或保管在液氮中待恒冷箱切片机或振荡切片机切片。组织也可在取材后直接置入液氮冷冻，切片后才将其浸入4%多聚甲醛约10 min，空气枯燥后保管在- 7 0。 如冰箱温度恒定，在-70切片可保管数月之久不会影响杂交结果。 在病理学活在病理学活检取材取材时多用福多用福尔马林固定和石林固定和石蜡包埋。
27、蜡包埋。 其它固定其它固定剂如运用多聚甲如运用多聚甲醛蒸汽固蒸汽固定枯燥后的冷定枯燥后的冷冻切片也可切片也可获称心效果。各种称心效果。各种固定固定剂均有各自的均有各自的优缺陷，如沉淀性缺陷，如沉淀性(Precipitating)固定固定剂：酒精：酒精/醋酸混合液、醋酸混合液、Bouins液、液、Carnoys液等能液等能为添加核酸探添加核酸探针的穿透性提供最正确条件的穿透性提供最正确条件,但它但它们不能最大不能最大限制地保管限制地保管RNA,而且而且对组织构造有构造有损伤。戊二戊二醛较好地保管好地保管RNA和和组织形状构造形状构造,但由但由于和蛋白于和蛋白质产生广泛的交生广泛的交联,从而大大地
28、影响从而大大地影响了核酸探了核酸探针的穿透性。的穿透性。 杂交杂交杂交是将交是将杂交液滴于切片交液滴于切片组织上，加盖硅化的盖上，加盖硅化的盖玻片，或采用无菌的蜡膜替代硅化的盖玻片玻片，或采用无菌的蜡膜替代硅化的盖玻片 ,加加盖片防止孵育盖片防止孵育过程中程中杂交液的蒸交液的蒸发。在盖玻片周。在盖玻片周围加液体石蜡封固或加橡皮泥封固。加液体石蜡封固或加橡皮泥封固。玻片玻片进展展杂交的交的载玻片放在盛有少量玻片放在盛有少量5SSC或或2SSC(standard saline citrate,SSC)溶液的湿溶液的湿盒中盒中进展孵育。展孵育。 杂交后漂洗杂交后漂洗杂交后处置包括系列不同浓度，不同温
29、度杂交后处置包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。普通遵照的共同原那么的盐溶液的漂洗。普通遵照的共同原那么是盐溶液浓度由高到低而温度由低到高漂是盐溶液浓度由高到低而温度由低到高漂洗。洗。 显示显示显示又可称为检测系统显示又可称为检测系统(Detection system)。根据核酸探针标志物的种类分别。根据核酸探针标志物的种类分别进展放射进展放射自显影或利用酶检测系统进展不同显色处自显影或利用酶检测系统进展不同显色处置。置。非特异性染色非特异性染色能够会来自探针、组织内源性酶、组织细非特异性染色能够会来自探针、组织内源性酶、组织细胞、显色系统等胞、显色系统等;探针特异性不高以及组织细胞内某
30、些探针特异性不高以及组织细胞内某些成分与显示系统中的抗体成分非特异结合也可呵斥非特成分与显示系统中的抗体成分非特异结合也可呵斥非特异性染色。组织细胞内源性酶是原位杂交中非特异性着异性染色。组织细胞内源性酶是原位杂交中非特异性着色的重要缘由色的重要缘由,目前最常用的酶是过氧化物酶和碱性磷目前最常用的酶是过氧化物酶和碱性磷酸酶酸酶,这两种酶都广泛存在于组织细胞中这两种酶都广泛存在于组织细胞中,因此用这些酶因此用这些酶时应有消除内源性酶的相应步骤。如过氧化物酶用时应有消除内源性酶的相应步骤。如过氧化物酶用3% H2O2处置处置510 min;10%冰醋酸处置组切片冰醋酸处置组切片10 min,或在底
31、物显色液中参与或在底物显色液中参与1 mmol/L左旋咪唑可防止左旋咪唑可防止内源性碱性磷酸酶的染色。内源性碱性磷酸酶的染色。NBT/BCIP显示碱性磷酸酶显示碱性磷酸酶时假设在光照下显色也会加强非特异性染色。必需根据时假设在光照下显色也会加强非特异性染色。必需根据检测系统不同的标志酶作不同的内源酶处置。检测系统不同的标志酶作不同的内源酶处置。常用的对照实验常用的对照实验1将将cDNA或或cRNA探针进展预杂交探针进展预杂交(吸收实验吸收实验)。2与非特异性与非特异性(载体载体)序列和不相关探针杂交序列和不相关探针杂交(置换实验置换实验)。3将切片运用将切片运用RNA酶或酶或DNA酶进展预处置
32、后杂交。运用酶进展预处置后杂交。运用同义同义RNA探针探针(Sense probe)进展杂交。进展杂交。4以不加核酸探针杂交液进展杂交以不加核酸探针杂交液进展杂交(空白实验空白实验)。5组织对照用知确定为阳性或阴性组织进展杂交对照。组织对照用知确定为阳性或阴性组织进展杂交对照。6运用未标志探针做杂交进展对照。运用未标志探针做杂交进展对照。通常用地高辛通常用地高辛(Dig),生物素生物素,荧光素荧光素,同位素同位素,等标志探等标志探针针;(一一) 、地高辛、地高辛(Dig)标志标志DNA探针在石蜡切片检测病探针在石蜡切片检测病毒毒DNA的方法。的方法。(二二) 、生物素标志、生物素标志DNA探针
33、在石蜡切片上检测目的探针在石蜡切片上检测目的DNA的方法。的方法。(三三)、cRNA探针检测组织切片中的探针检测组织切片中的RNA原位杂交。原位杂交。(四四)、用寡核苷酸探针检测组织切片中的、用寡核苷酸探针检测组织切片中的RNA原位杂原位杂交。交。 (五五)、用、用cDNA探针检测体外培育细胞中的探针检测体外培育细胞中的RNA原位原位杂交。杂交。(六六) 、 RNA原位杂交与免疫组化双重检测技术。原位杂交与免疫组化双重检测技术。 (七七) 、多重、多重RNA原位杂交技术。原位杂交技术。(双重原位杂交是在双重原位杂交是在同一标本或同一细胞内同时检测两种或两种以上的靶同一标本或同一细胞内同时检测两
34、种或两种以上的靶核酸序列的技术。核酸序列的技术。) (八八) 、原位杂交的、原位杂交的PCR增敏法。增敏法。 n引物原位标志技术引物原位标志技术(Primed in situ (Primed in situ Labeling, PRINS)Labeling, PRINS)n 针对染色体的特异性-卫星DNA 序列设计和合成引物。n 利用未标志的寡核苷酸引物与变性后的染色体DNA特异结合, 然后用荧光素标志的脱氧核苷酸(dUTP)与未标志的脱氧核苷酸一同在DNA聚合酶的作用下进展延伸反响,标志了的dUTP将以碱基配对的方式掺入到新合成的DNA单链中, 最后用相应的荧光抗体与标志物结合以显示检测结果
35、。 原位杂交技术运用原位杂交技术已运用于根底研讨如基因组图原位杂交技术已运用于根底研讨如基因组图(Gene mapping),转基因检测转基因检测,基因表达定位基因表达定位(localization of gene expression),核核DNA和和RNA的的mRNA的陈列和运输的陈列和运输(arrangement and transport of mNA),复制复制(replication)和细胞的和细胞的分类分类(Sorting of cells)。临床研讨运用在细胞遗。临床研讨运用在细胞遗传学传学(Cytogenetics),产前诊断产前诊断(Prenatal diagnosis),
36、肿瘤和传染性疾病的诊断肿瘤和传染性疾病的诊断,生物学剂生物学剂量测定量测定(biological dosimetry)和病毒学的病原和病毒学的病原学诊断等。学诊断等。 分子灯塔分子灯塔是一个用是一个用荧光光标志的核酸探志的核酸探针.也叫分子信也叫分子信标,它是近几年它是近几年兴起的利用核酸起的利用核酸杂交技交技术对核酸分子核酸分子进展展检测的新技的新技术。这一技一技术是由是由纽约市公共安康研市公共安康研讨协会于会于1996年初次建立的。因其在与核酸分子互年初次建立的。因其在与核酸分子互补结合之后合之后荧光素便能开光素便能开场发光光,故称故称为“分子灯塔。分子灯塔。这一技一技术的建立的建立为研研
37、讨核酸核酸分子的分子的组成、含量及成、含量及对过程中程中进展展实时监控提供了快速、特异、方便的新方控提供了快速、特异、方便的新方法。分子灯塔作法。分子灯塔作为一种核酸探一种核酸探针,不但适用不但适用于体外核酸分析于体外核酸分析,而且适用于活体分析而且适用于活体分析;不不仅广泛运用于核酸分子的研广泛运用于核酸分子的研讨,还是一种极是一种极好的研好的研讨蛋白蛋白质等能与核酸等能与核酸发生相互作用生相互作用的物的物质的工具。的工具。 灯塔是一个用灯塔是一个用荧光光标志的志的,具有具有“发夹样构造构造的的单链寡聚核苷酸序列寡聚核苷酸序列,普通含普通含2030个核苷个核苷酸酸,由两部分由两部分组成成,即
38、即环状部分和茎部。如状部分和茎部。如图1所所示示1:环状部分状部分为单链核苷酸核苷酸,是分子灯塔的基是分子灯塔的基因因识别部位部位,它能与靶基因一段或它能与靶基因一段或,在聚合在聚合酶的存在下特异的互的存在下特异的互补结合。合。茎部是一段由茎部是一段由412对碱基碱基(大多含有大多含有5对碱基碱基)互互补构成的构成的发夹构造。在茎部的末端构造。在茎部的末端,即即5端和端和3端端经过衔接臂分接臂分别与与荧光素和淬光素和淬灭物物质结合。合。荧光素和淬光素和淬灭物物质可根据研可根据研讨目的的不同自行目的的不同自行设计。 分子灯塔在未与靶序列结合以前分子灯塔在未与靶序列结合以前,以环茎构造的方式存以环
39、茎构造的方式存在在,其茎部的双链互补构造使末端的荧光基团和淬灭基其茎部的双链互补构造使末端的荧光基团和淬灭基团紧紧地靠在一同团紧紧地靠在一同,二者间间隔二者间间隔710。荧光基团。荧光基团EDANS在在336的激光下会激发出波长为的激光下会激发出波长为490的蓝色荧光的蓝色荧光,但由于淬灭基团但由于淬灭基团DABCYL与它靠得很近与它靠得很近,因此发生了荧光共振能量转移因此发生了荧光共振能量转移(fluorescence resonanceenergytransfer,FRET),这样一来这样一来,荧光基荧光基团发出的荧光就被淬灭基团吸收并以热的方式分发掉团发出的荧光就被淬灭基团吸收并以热的方
40、式分发掉,因此此时检测不到荧光信号。当有靶序列存在时因此此时检测不到荧光信号。当有靶序列存在时,分子分子灯塔的环状部分的核苷酸序列可以与靶序列特异性地灯塔的环状部分的核苷酸序列可以与靶序列特异性地结合结合,所构成的杂交分子比分子灯塔的茎部双链构造更所构成的杂交分子比分子灯塔的茎部双链构造更稳定稳定,于是杂交分子的刚性使茎部的双链分子分别于是杂交分子的刚性使茎部的双链分子分别,也也就使得荧光基团和淬灭基团分开就使得荧光基团和淬灭基团分开,此时此时,荧光分子发出荧光分子发出的荧光就不能被淬灭分子吸收的荧光就不能被淬灭分子吸收,这样在室温下就可经过这样在室温下就可经过荧光仪或适宜配置的显微镜察看到荧光。荧光仪或适宜配置的显微镜察看到荧光。
