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1、专题一专题一 基因工程基因工程第第1讲 DNA重重组技技术的基本工具的基本工具温故知新：核酸的类型温故知新：核酸的类型概念：细胞内携带遗传信息的物质，在生物体的概念：细胞内携带遗传信息的物质，在生物体的遗传遗传、 变异变异和和蛋白质的生物合成蛋白质的生物合成中具有极其重要的作用。中具有极其重要的作用。脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸(DNA)核糖核酸核糖核酸(RNA)基本单位：基本单位： 脱氧核糖核苷酸脱氧核糖核苷酸核糖核苷酸核糖核苷酸碱基种类：碱基种类：A、G、C、T基本单位：基本单位：碱基种类：碱基种类： A、G、C、U类类型型温故知新：核酸的空间结构温故知新：核酸的空间结构1. DNA分子是由分
2、子是由两条反向平两条反向平行行的脱氧核苷酸的脱氧核苷酸长链盘旋成旋成的的双螺旋双螺旋结构构2. DNA分子中的脱氧核糖和分子中的脱氧核糖和磷酸交替磷酸交替连接接,排列在外排列在外侧,构构成成基本骨架基本骨架;碱基排列在内碱基排列在内侧3. 两条两条链上的碱基通上的碱基通过氢键连接起来接起来,形成碱基形成碱基对,且遵循且遵循碱基互碱基互补配配对原原则。温故知新：基因温故知新：基因概念：概念：基因是有基因是有遗传效效应的的DNA片段，是生物体片段，是生物体遗传的的 结构构单位位和和功能功能单位位。作用：控制生物性状，指作用：控制生物性状，指导蛋白蛋白质的生物合成。的生物合成。温故知新：基因工程温故
3、知新：基因工程 概念：概念：基因工程又叫做基因工程又叫做基因拼接技基因拼接技术或或DNA重重组技技术。 通俗地通俗地说，就是按照人，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种的意愿，把一种生物的某种 基因提取出来，加以修基因提取出来，加以修饰改造，然后改造，然后转入到另一种生物入到另一种生物 的的细胞里，胞里，定向地改造定向地改造生物的生物的遗传性状。也称性状。也称为转基因技基因技术。原理：原理：基因重基因重组优点：点：克服了克服了远缘杂交不交不亲和的障碍和的障碍；周期短；周期短；目的性目的性强强 为什么能把一种生物的基因“嫁接”到另一种生物上并成功表达？1、大多数生物的、大多数生物的遗传物物质都是
4、都是DNA，且主要，且主要为双螺双螺旋旋结构，即构，即不同生物的不同生物的DNA分子基本分子基本结构是相同的构是相同的，都都遵循碱基互遵循碱基互补配配对原原则 。所以不同的生物。所以不同的生物DNA可可以嫁接以嫁接。 2、地球上的、地球上的所有生物共用一套所有生物共用一套遗传密密码，所以，一，所以，一种生物的基因可以在另外一种生物体内得以表达种生物的基因可以在另外一种生物体内得以表达。思考与讨论思考与讨论基因工程的应用之一：基因工程的应用之一： 生产胰岛素生产胰岛素（复习糖尿病相关知识）（复习糖尿病相关知识）人的人的细胞胞提取提取胰胰岛素基因素基因与运与运载体体DNA拼接拼接导入入上述生上述生
5、产胰胰岛素的关素的关键步步骤是什么？是什么？细菌菌(含胰含胰岛素基因素基因)生生产胰胰岛素素基因工程生产胰岛素简要过程基因工程生产胰岛素简要过程：胰胰岛素基因的素基因的获取取胰岛素基因导入受体细胞胰岛素基因导入受体细胞胰胰岛素基因素基因与运载体连接与运载体连接基因工程生产胰岛素的关键步骤：基因工程生产胰岛素的关键步骤：基因的基因的“剪刀剪刀”限制性内切限制性内切酶酶基因的基因的“针线”DNA连接接酶酶基因的运基因的运输工具工具运运载体体基因工程的操作工具基因工程的操作工具操操作作工工具具大大肠杆菌的一种杆菌的一种ECORI限制限制酶酶识别GAATTC序列，序列，并在并在G和和A之之间切开）。切
6、开）。 基因的“剪刀”限制性核酸内切酶基因工程的操作工具基因工程的操作工具基因工程的操作工具基因工程的操作工具基因的“剪刀”限制性核酸内切酶酶切位点：特定序列核苷酸的磷酸二酯键酶切位点：特定序列核苷酸的磷酸二酯键酶切位点酶切位点酶切位点酶切位点 被限制被限制酶酶切开的切开的DNA两条两条单链的切口，的切口，带有几个有几个伸出的核苷酸伸出的核苷酸，他，他们之之间正好正好互互补配配对，这样的切口的切口叫叫黏性末端黏性末端。 黏性末端：黏性末端黏性末端基因工程的操作工具基因工程的操作工具不同的限制性内切酶得到的黏性末端不同不同的限制性内切酶得到的黏性末端不同中轴线在G与C之间切割SmaI只能只能识别
7、CCCGGG序列，并在序列，并在C和和G之之间切开。切开。SmaI限制酶的作用限制酶的作用平末端：平末端：当限制当限制酶酶从从识别序列的中心序列的中心轴线处切开切开时，切开的切开的DNA两条两条单链的切口是平整的，的切口是平整的，这样的切口的切口叫叫平末端平末端。平末端平末端平末端平末端SmaI限制酶的作用限制酶的作用G A A T T CC T T A A GEcoR中中轴线 C C C G G GG G G C C CSma黏性末端黏性末端平末端平末端平末端平末端黏性末端黏性末端 仔细观察各限制酶识仔细观察各限制酶识别的特定序列有何特别的特定序列有何特点？点？限制酶的识别序列限制酶的识别序
8、列限制酶所识别的序列的特点是：限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对呈现碱基互补对称，无论是称，无论是6 6个碱基还是个碱基还是4 4个碱基，都可以找到一个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链条中心轴线，中轴线两侧的双链DNADNA上的碱基是上的碱基是反向对称重复排列反向对称重复排列的的 ，称为，称为回文序列回文序列限制酶的识别序列限制酶的识别序列同一种内切酶要切两个切口，产生四个黏性同一种内切酶要切两个切口，产生四个黏性末端。末端。会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DN
9、A分子了。分子了。Q1：要想：要想获得某个特定性状的基因必得某个特定性状的基因必须要用要用限制限制酶酶切几个切口？可切几个切口？可产生几个黏性末端？生几个黏性末端？Q2：如果把两种来源不同的：如果把两种来源不同的DNA用同一种用同一种限制限制酶酶来切割，会怎来切割，会怎样呢？呢？思考与讨论思考与讨论G A A T T CC T T A A GG A A T T CC T T A A GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C G基因的针线DNA连接酶 DNA连接接酶酶可把黏性末端可把黏性末端之之间的的
10、缝隙隙“缝合合”起起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来来，即把梯子两边扶手的断口连接起来( (形成磷酸二形成磷酸二酯键) )，这样一个重组的，这样一个重组的DNADNA分子就形成了。分子就形成了。( (连接连接“梯子梯子”断口的断口的“扶手扶手”而非而非“梯子梯子”中间的中间的“踏板踏板”)”)基因工程的操作工具基因工程的操作工具DNA连接接酶酶与与DNA聚合聚合酶酶是一回事是一回事吗？T4 DNA连接接酶酶还可把平末端之可把平末端之间的的缝隙隙“缝合合”起起来，但效率来，但效率较低低基因工程的操作工具基因工程的操作工具A A T T A A T T G GC CA AA AT TT TA A
11、A AT TT TDNA聚聚合酶合酶DNA聚聚合酶合酶DNA聚聚合酶合酶DNA聚聚合酶合酶DNA聚聚合酶合酶基因工程的操作工具基因工程的操作工具DNA连接接酶酶DNA聚合聚合酶酶相相同同点点作用实质作用实质化学本质化学本质不不同同点点模板模板作用对象作用对象 作用作用结果果用途用途都能催化形成磷酸二酯键都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白都是蛋白质不需要不需要需要需要形成完整的重形成完整的重组DNA分子分子形成形成DNA的一的一条条链基因工程基因工程DNA复制复制只能将只能将单个核苷酸个核苷酸连接到已有的接到已有的DNA片段上，形成磷酸片段上，形成磷酸二二酯键在在两个两个DNA片段片段之之间形成磷酸
12、二形成磷酸二酯键DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶的比较聚合酶的比较质粒粒是存在于是存在于细菌菌细胞胞质中独立于染色体而自主复中独立于染色体而自主复制的制的环状双状双链DNA分子。分子。质粒、噬菌体、动植物病毒质粒、噬菌体、动植物病毒基因的运输工具运载体运载体的种类：运载体的种类：基因工程的操作工具基因工程的操作工具在宿主在宿主细胞中能保存下来并能大量复制。胞中能保存下来并能大量复制。有多个限制有多个限制酶酶切点，以便与外源基因切点，以便与外源基因连接。接。具有具有标记基因，以便基因，以便进行行筛选。 对受体受体细胞无害、易分离。胞无害、易分离。载体体DNA分子大小分子大小应适合，便于提取和操
13、作。适合，便于提取和操作。运载体的作用：运载体的作用：运载体必须具备的五个条件：运载体必须具备的五个条件：作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制基因工程的操作工具基因工程的操作工具大肠杆菌的质粒：大肠杆菌的质粒：最最常常用用的的质质粒粒是是大大肠肠杆杆菌菌的的质质粒粒，其其中中常常含含有有抗抗药药基基因因，如如抗抗四四环环素素的的标标记记基基因因。质质粒粒的的存存在在与与否否对对宿宿主主细细胞胞生生存存没没有有决决定定性性作作用用，但但复复制制只只能能在在宿宿主主细胞内完成
14、细胞内完成。基因工程的操作工具基因工程的操作工具目的基因所在片段目的基因所在片段运载体运载体PStPStDNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA运载体自连运载体自连目的基因目的基因 自连自连CTTAACTTAAG GCTTAACTTAAG GCTTAACTTAACTTAACTTAAG GG GPSt PSt 目的基因与运载体连接目的基因与运载体连接pBR322质粒结构如果外源如果外源DNADNA插入，氨卞插入，氨卞青霉素抗性青霉素抗性基因失活基因失活标记基因标记基因进行筛选进行筛选限制性内切酶限制性内切酶识别序列识别序列外源基因连接外源基因连接PStPStPStPSt自主复制自主复制通通过
15、长期的期的进化，化，细菌中含有某种限制菌中含有某种限制酶酶的的细胞，其胞，其DNA分子中不具分子中不具备这种限制种限制酶酶的的识别切割序列切割序列，或者，或者通通过甲基化甲基化酶酶将甲基将甲基转移移到所到所识别序列的碱基上，使限制序列的碱基上，使限制酶酶不能将其不能将其切开切开。这样，尽管，尽管细菌中含有某种限制菌中含有某种限制酶酶也也不会使自身的不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外被切断，并且可以防止外源源DNA的入侵。的入侵。 Q3：为什么限制什么限制酶酶不剪切不剪切细菌本身的菌本身的DNA？思考与讨论思考与讨论原核生物易受自然界外源原核生物易受自然界外源DNA的入侵的入侵，但生物在，
16、但生物在长期期的的进化化过程中形成了一套程中形成了一套完善的防御机制，以防止外完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害来病原物的侵害。限制。限制酶酶就是就是细菌的一种防御性工具，菌的一种防御性工具，当外源当外源DNA侵入侵入时，会，会利用限制利用限制酶酶将外源将外源DNA切割切割掉，以保掉，以保证自身的安全自身的安全。所以，限制。所以，限制酶酶在原核生物中在原核生物中主要起到切割外源主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保、使之失效，从而达到保护自自身的目的。身的目的。Q4：你能推：你能推测限制限制酶酶存在于原核生物中的作存在于原核生物中的作用是什么用是什么吗？思考与讨论思考与讨论不是，作为
17、基因工程使用的载体必需满足以下条件：不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：Q5：天然的：天然的DNA分子可以直接用做基因工程分子可以直接用做基因工程载体体吗？为什么？什么？思考与讨论思考与讨论在宿主在宿主细胞中能保存下来并能大量复制。胞中能保存下来并能大量复制。有多个限制有多个限制酶酶切点，以便与外源基因切点，以便与外源基因连接。接。具有具有标记基因，以便基因，以便进行行筛选。 对受体受体细胞无害、易分离。胞无害、易分离。载体体DNA分子大小分子大小应适合，便于提取和操作。适合，便于提取和操作。天然的质粒要进行人工改造后才能用于基因工程操作天然的质粒要进行人工改造后才能用于基因工程操作迄今为止，所发现的迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单连接酶都不具有连接单链链DNA的能力。具体原因尚不明确，有待研究。的能力。具体原因尚不明确，有待研究。Q6：DNA连接接酶酶有有连接接单链DNA的本的本领吗？思考与讨论思考与讨论
