肿瘤相关基因与基因诊断基因治疗

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1、 第十三章第十三章 肿瘤相关基因肿瘤相关基因 肿瘤系细胞增殖与分化失常导致恶性生长现象肿瘤系细胞增殖与分化失常导致恶性生长现象细胞正常生长与增殖由两大类基因调控：细胞正常生长与增殖由两大类基因调控： 癌基因癌基因正调节信号：促进细胞生长、增殖，正调节信号：促进细胞生长、增殖， 抑制分化和凋亡。抑制分化和凋亡。 抑癌基因抑癌基因负调节信号：抑制细胞生长、增殖，负调节信号：抑制细胞生长、增殖， 促进分化和凋亡。促进分化和凋亡。两类基因中任一种或共同变化，细胞增殖分化失控而致肿两类基因中任一种或共同变化，细胞增殖分化失控而致肿瘤瘤 正常细胞正常细胞DNA损伤损伤DNA修复修复体细胞基因突变体细胞基因

2、突变原癌基原癌基因活化因活化抑癌基抑癌基因失活因失活凋亡基凋亡基因失调因失调细胞增生细胞增生细胞死亡细胞死亡肿瘤细胞肿瘤细胞DNA损伤损伤DNA修复失败修复失败增殖自主性和分化失控增殖自主性和分化失控生存的独立性生存的独立性侵袭生长和转移性侵袭生长和转移性表型不稳定性表型不稳定性异质性异质性肿瘤细胞的生物学性状：肿瘤细胞的生物学性状：一一癌基因的发现和概念癌基因的发现和概念二二（一）一）发现发现第一节第一节 癌基因与原癌基因癌基因与原癌基因 现代分子生物学的重大成就之一是发现了原癌基因（proto-oncogene）和原癌基因具有转化成致癌的癌基因（oncogene）的能力。Biship和Ha

3、rmus因为在这方面的贡献而获得1989年的诺贝尔奖。 癌基因是首先在逆转录病毒（RNA病毒）中发现的 早在本世纪初，Rockefeller研究所的Rous医生将鸡肉瘤组织匀浆后的无细胞滤液皮下注射于正常鸡，发现可以引起肿瘤，可惜当时对病毒还缺乏认识，直到五十年代才重新发现原来致瘤的因素是病毒，并以Rous医生的名字命名为罗氏肉瘤病毒（Rous Sarcoma Virus ,RSV）。1975年，Biship从RSV中分离到第一个病毒癌基因src，该基因编码分子量为60kDa的蛋白质，以pp60src表示。 V-onc的来源:RNA病毒与宿主细胞基因组整合过程二）概念二）概念1 1、癌基因、癌

4、基因( (oncogeneoncogene) )：存在生物体内当结构异常存在生物体内当结构异常或表达异常时，能导致细胞癌变的基因。或表达异常时，能导致细胞癌变的基因。2.2.病毒癌基因病毒癌基因( (v-oncogenev-oncogene):): 存在肿瘤病毒中（存在肿瘤病毒中（DNADNA或或RNARNA病毒病毒) )能使宿主细能使宿主细胞产生肿瘤或使培养细胞转化成癌细胞的动物病胞产生肿瘤或使培养细胞转化成癌细胞的动物病毒基因。毒基因。3.3.细胞癌基因细胞癌基因( (c-oncogenec-oncogene):): 存在于真核生物中（包括人类）能诱发肿瘤的基存在于真核生物中（包括人类）能

5、诱发肿瘤的基因，正常状态下为非活化形式即原癌基因。因，正常状态下为非活化形式即原癌基因。 特点：普遍存在特点：普遍存在 酵母酵母人人 进化中高度保守进化中高度保守 维持正常细胞生长、繁殖维持正常细胞生长、繁殖 激活（数量或结构改变）转变为癌基因激活（数量或结构改变）转变为癌基因4. 4. 原癌基因原癌基因( (proto-oncogene)proto-oncogene)：细胞癌基因的细胞癌基因的非激活状态。非激活状态。病毒癌基因与原癌基因是同源的，为什么有不同的生物学效应？v-onc与c-onc的比较1.从结构上看c-onc是间断的2. v-onc有LTR,有很高的转录活性3.表达的产物有差别

6、4.病毒癌基因对病毒本身无关紧要，却可使宿主细胞转化，引起肿瘤，而细胞癌基因对细胞的生长、分化和功能活动却是至关紧要的 22-1。再从逆转录病毒感染宿主细胞后的复制周期（图22-2）分析。依表达产物分依表达产物分:生长因子类生长因子类如如sis生长因子受体类生长因子受体类如如erb非受体酪氨酸蛋白激酶类非受体酪氨酸蛋白激酶类如如src丝氨酸丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类苏氨酸蛋白激酶类如如rafGTP结合蛋白类（细胞内信号传导体结合蛋白类（细胞内信号传导体）如如ras核内转录因子核内转录因子如如myc二二.癌基因的分类和功能癌基因的分类和功能Ras蛋白,小G蛋白,P21:(G蛋白87KD)鸟苷酸交换

7、因子(GEF),正调节因子GTP酶激活蛋白(GAP),负调节因子Ras基因发生点突变后,P21蛋白的GTP活性丧失GRB2:(Grouthfactorboundprotein2)一种连接蛋白,具SH2(能与酪氨酸磷酸化的肽段结合),SH3(与富含脯氨酸的肽链结合)结构域SOS(sonofsevenless)一种鸟苷酸释放因子,具有核苷酸转移酶活性GRB2:(Grouthfactorboundprotein2)一种连接蛋白,具SH2(能与酪氨酸磷酸化的肽段结合),SH3(与富含脯氨酸的肽链结合)结构域SOS(sonofsevenless)一种鸟苷酸释放因子,具有核苷酸转移酶活性三、原癌基因的激活

8、机制三、原癌基因的激活机制*获得启动子与增强子获得启动子与增强子*原癌基因扩增：原癌基因扩增：数量或表达活性增强数量或表达活性增强*点突变：点突变：*染色体异位：原癌基因移至强启动子或增染色体异位：原癌基因移至强启动子或增强子附近强子附近C-rasH基因基因P21ras产物产物突变后突变后12GGC甘氨酸甘氨酸GTC缬氨酸缬氨酸膀胱癌的癌基因突变膀胱癌的癌基因突变点突变点突变 获得启动子与增强子获得启动子与增强子: :例如逆转录病毒MoSV感染鼠类成纤维细胞后，病毒基因组的LTR整合到细胞癌基因 c-mos邻近处，使c-mos处于LTR的强启动子和增强子作用之下而被激活，导致成纤维细胞转化为肉

9、瘤细胞，又如禽类白细胞增生病毒ALV的E成分整合到鸡细胞基因组c-myc附近。可使c-myc激活。因此在基因治疗中使用逆转录病毒载体时必需考虑细胞癌基因的插入激活问题。 原癌基因扩增原癌基因扩增:C-onc肿瘤扩增倍数c-myc早幼粒白血病细胞系HL6020肺癌细胞系5-30N-myc原发神经母细胞瘤-级及神经母细胞瘤细胞系5-1000视网膜母细胞瘤10-200小细胞肺癌50L-myc小细胞肺癌10-20c-myb急粒AML5-10结肠癌细胞系10c-erbB类表皮癌细胞系，原发胶质瘤30c-K-ras原发肺癌，结肠癌，膀胱癌，直肠癌4-20N-ras乳癌细胞系5-10癌基因癌基因染色体定位染

10、色体定位异常异常人类肿瘤人类肿瘤c-myc8q24t(8:14),t(8:22)Burkitt淋巴瘤淋巴瘤bcl-111q13t(11:14)B细胞淋巴瘤细胞淋巴瘤tcl-211q13t(11:14)T细胞淋巴瘤细胞淋巴瘤c-myb6q22-24t(6:14)卵巢癌卵巢癌染色体异位染色体异位 不同的癌基因有不同的激活方式，一种癌基因也可有几种激活方式。例如c-myc的激活就有基因扩增和基因重排两种方式，很少见c-myc的突变；而ras的激活方式则主要是突变，研究发现所有肿瘤都不止一种癌基因发生改变。细胞转化实验证明，各种癌基因之间存在协同作用,肿瘤的发生是多步骤，多因素的，不同的癌基因作用于肿

11、瘤发生的不同阶段。 结肠腺瘤性息肉（APC）基因结肠癌缺失（DCC）基因(一）一）概念：概念：一类抑制细胞过度生长、增殖，从而遏制肿瘤形成，一类抑制细胞过度生长、增殖，从而遏制肿瘤形成，当缺失或变异抑癌功能丧失导致肿瘤生成的基因当缺失或变异抑癌功能丧失导致肿瘤生成的基因。第二节第二节抑癌基因（抑癌基因（cancersuppressivegene)抑癌基因的二次突变学说抑癌基因的二次突变学说 抑癌基因概念是在研究视网膜母细胞瘤（Retinoblastoms ,RB）的遗传损害时提出来的。RB有家族性和散发性两种类型，其发病机制不同。前者有先天的隐性遗传损害，其种系基因是有缺陷的，患RB的频率可高

12、达80-90%，且往往是双侧，散发性RB，两次体细胞突变发生在同一个细胞，机率很小，患病也是单侧，Kundson早在1971年就提出RB发病的“两次击中学说”。现代分子遗传学分析手段的发展充分支持这一学说.1986年Draper统计，RB携带者发生第二原发癌的机率比一般人群要高数百倍。（二）（二）常见抑癌基因常见抑癌基因1p53基因基因1）p53基因基因17p13全长全长16-20kb含含11个外显子个外显子2）p53基因基因表达产物表达产物P53蛋白蛋白3）P53蛋白抑癌机制蛋白抑癌机制*具转录因子作用具转录因子作用,活化活化p21基因基因,产生抑制因子产生抑制因子p21蛋白蛋白,使细胞停滞

13、于使细胞停滞于G1期期*抑制解链酶活性抑制解链酶活性*与复制因子共同作用参与与复制因子共同作用参与DNA修复，起修复，起“基因卫士基因卫士”作用，如修复失败启动程序性死亡（凋亡）诱导细作用，如修复失败启动程序性死亡（凋亡）诱导细胞自杀。胞自杀。*p53基因突变后产生突变基因突变后产生突变p53蛋白，可致癌。蛋白，可致癌。2、RB基因：基因：1）、）、13q14,200kb,27个外显子个外显子2）、产物）、产物pRB105kDa3)、pRB抑癌机制抑癌机制低磷酸化的低磷酸化的pRB可阻止细胞从可阻止细胞从G1S,G2M的过渡，的过渡，抑制抑制c-fos,c-myc的表达的表达3、p16基因基因

14、9p21,30kb,3个外显子个外显子P16都是都是CDK4和和CDK6蛋白激酶抑蛋白激酶抑制因子，参与细胞增殖周期调控制因子，参与细胞增殖周期调控第十四章第十四章 基因诊断和基因治疗基因诊断和基因治疗第一节第一节 基因诊断基本概念和流程基因诊断基本概念和流程 传统对疾病的诊断主要是以疾病的表型改变为依据，如患者的症状、血尿各项指标的变化，或物理检查的异常结果，然而表型的改变在许多情况下不是特异的，而且是在疾病发生的一定时间后才出现，因此常不能及时作出明确的诊断 表型的改变是由基因异常造成的表型的改变是由基因异常造成的表型的改变是由基因异常造成的 传统对疾病的诊断主要是以疾病的表型改变为依据，

15、如患者的症状、血尿各项指标的变化，或物理检查的异常结果，然而表型的改变在许多情况下不是特异的，而且是在疾病发生的一定时间后才出现，因此常不能及时作出明确的诊断( (一）概念一）概念基因诊断：应用分子生物学技术基因诊断：应用分子生物学技术, ,从从DNA/RNADNA/RNA水平检测分析致病基因水平检测分析致病基因的存在的存在, ,变异和表达状态从而对疾变异和表达状态从而对疾病作出诊断的技术病作出诊断的技术基因的改变是引起疾病的根本原因。 DNA诊断RNA诊断 基因诊断是病因的诊断，既特异又灵敏，可以揭示尚未出现症状时与疾病相关的基因状态，从而可以对表型正常的携带者及某种疾病的易感者作出诊断和预

16、测，特别对确定有遗传疾病家族史的个体或产前的胎儿是否携带致病基因的检测具有指导意义 样品抽提样品抽提PCR扩增分子杂交杂交信号检测DNARNAcDNA（二）基因诊断的基本流程（二）基因诊断的基本流程第二节第二节基因诊断的基本技术基因诊断的基本技术一、核酸分子杂交一、核酸分子杂交1、原位杂交、原位杂交细胞细胞/组织固定组织固定杂交杂交冲洗冲洗杂交信号检测杂交信号检测分析结果分析结果2、斑点杂交、斑点杂交3、Southern印迹（印迹（Southernblot)杂交杂交4、Northern印迹（印迹（Northernblot)杂交杂交总总RNA/mRNA变性电泳分离变性电泳分离转移转移杂交杂交放射

17、自显影放射自显影/化学显色化学显色二、二、PCR技术技术基本原理基本原理DNA复制复制 三个步骤三个步骤变性变性(denaturation) 退火退火(annealing) 延伸延伸(extension) PCR的原理的原理PCR的扩增产物的扩增产物cycle12345n长片段长片段246810短片段短片段002822长短长短21222324252n标准的标准的PCR反应体系反应体系10X扩增缓冲液：扩增缓冲液：10ul模板模板DNA:0.12ug引物：引物：各各0.21umol/L4种种dNTP:各各200umol/LMg2+:1.5mmol/LTaqDNA聚合酶：聚合酶：2.5U总体积：总

18、体积：100ul循环条件循环条件变性温度和时间变性温度和时间:9096,3060s退火温度和时间退火温度和时间:4060,3060sTm=4(G+C)+2(A+T)延伸温度和时间延伸温度和时间7075(72)1kb,1min;34kb,34min;10kb,15min循环次数循环次数:2535三、三、RFLP分析分析1、点多态性、点多态性2、序列多态性、序列多态性基因芯片基因芯片(Gene chip, DNA chip),又称又称为为DNA微阵列微阵列(DNA Microarray)，是指是指固定在载体上的高密度固定在载体上的高密度DNA微点阵。具微点阵。具体地说就是将大量寡核苷酸或体地说就是

19、将大量寡核苷酸或cDNA有序有序地、高密度地排列在玻璃、硅等固相载地、高密度地排列在玻璃、硅等固相载体上体上,然后与标记的样品分子进行杂交，然后与标记的样品分子进行杂交，通过检测探针分子的杂交信号强度，从通过检测探针分子的杂交信号强度，从而获得样品分子相关的序列信息。而获得样品分子相关的序列信息。四、四、基因芯片基因芯片 基因芯片或微阵列是近年发展起来的分子生物学研究工具。在 1 平方厘米的芯片上可以同时分析几百至数万个基因，具有高通量、快速获取有关生物学信息的特点。目前基因芯片主要用于科研，要从实验室研究推向临床应用还有一系列问题需要解决。如提高特异性、简化操作、降低成本等。 第三节第三节基

20、因诊断的应用基因诊断的应用一、遗传性疾病的诊断一、遗传性疾病的诊断二、二、感染性疾病基因诊断感染性疾病基因诊断三、基因诊断在法医学中的应用三、基因诊断在法医学中的应用镰状细胞贫血的基因诊断镰状细胞贫血的基因诊断一、遗传性疾病的诊断一、遗传性疾病的诊断 血红蛋白血红蛋白血红蛋白血红蛋白(hemoglobin, (hemoglobin, HbHb) )镰刀形红细胞贫血（sicklecellanemia）镰状细胞贫血的基因诊断镰状细胞贫血的基因诊断ProGluGluCCTGAGGAGHbAProValGluCCTGTGGAGHbSMstIIMstIIMstIICCTNAGG1.1kb0.2kbMst

21、IIMstII1.3kb567HbA:2053bp点突变,发生在限制性内切酶位点上Southern blot Southern blot 检测镰状细胞贫血检测镰状细胞贫血制备血液DNAMstII消化琼脂糖电泳转移至硝酸纤维素膜与标记的珠蛋白DNA杂交放射自显影 PCRPCR扩增检测扩增检测PCR扩增珠蛋白基因MstII消化琼脂糖电泳EB染色Southernblot检测镰状细胞贫血检测镰状细胞贫血1.31.10.2kbSSASFAA294191103bpSSAAAS PCRPCR扩增检测结果扩增检测结果二、感染性疾病基因诊断二、感染性疾病基因诊断 感染性疾病由病原微生物引起，致病的病原微生物主要

22、有病毒、细菌、衣原体、支原体和螺旋体等。这些病原体的传统检测方法通常采用形态学检查，体外培养和免疫学试验。但对某些难以培养的病原体，抗原抗体检测不能判断体内病原体 DNA 或 RNA的 复制情况，或存在检测灵敏度低等问题。自聚合酶链反应（ PCR ）技术问世以来，基因诊断技术作为病原体检测的新方法得到突飞猛进的发展 实时荧光定量实时荧光定量 PCR PCR （ Real Time Real Time FlourescenceFlourescence quantitative PCR, FQPCR quantitative PCR, FQPCR ） 病原体基因诊断的主要技术方法 聚合酶链反应（

23、PCR ）技术虽已被广泛应用于核酸分析，但普通 PCR还存在一些不足： （ 1 ）只有定性结果，无法给出临床需要的定量结果； （ 2 ）由于采用电泳检测，易引起 PCR 产物的交叉污染，增加了假阳性结果的可能性； （ 3 ）采用的染色剂溴乙锭是致癌物，可能危害操作人员及污染环境。 实时荧光定量实时荧光定量 PCRPCR在常规在常规 PCR PCR 基础上，添加了一条标基础上，添加了一条标记记 2 2 个荧光基团的荧光双标记探针。一个标记在探针的个荧光基团的荧光双标记探针。一个标记在探针的 5 5 端，称为端，称为荧光报告基团荧光报告基团（ R R ）；另一个标记在探针的）；另一个标记在探针的

24、3 3 端，称为端，称为荧光抑制基团荧光抑制基团（ 淬灭基团淬灭基团 Q Q ）。探针的）。探针的 3 3 羟基（羟基（ -OH -OH ）已被去除或封闭，不具有延伸能力。在）已被去除或封闭，不具有延伸能力。在探针分子完整的情况下，探针分子完整的情况下， R R 发出的荧光被发出的荧光被 Q Q 淬灭吸收。淬灭吸收。此时检测不到荧光信号。当特异性此时检测不到荧光信号。当特异性 PCR PCR 扩增发生时，探针扩增发生时，探针会在会在 PCR PCR 过程中被过程中被 TaqTaq 酶的酶的 5-35-3外切酶外切酶 活性作用活性作用切断，释放出切断，释放出R R基团基团, Q, Q的抑制作用消

25、失，从而引起报告基的抑制作用消失，从而引起报告基团荧光信号的产生团荧光信号的产生, ,荧光监测系统可接收到荧光信号，即每荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条扩增一条DNADNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与的累积与PCRPCR产物形成完全同步产物形成完全同步 。荧光信号伴随。荧光信号伴随 PCR PCR 产物产物的增长而增长目前用于临床检测的病原体基因诊断试剂绝的增长而增长目前用于临床检测的病原体基因诊断试剂绝大部分是此类。大部分是此类。 目前病原体基因诊断在临床上最大的用途是目前病原体基因诊断在临床上最大的用途是1.1.检测难于

26、培养的病原体检测难于培养的病原体2.2.在治疗中在治疗中检测检测病毒载量以评价疗效病毒载量以评价疗效3.3.治疗治疗过程中检测耐药基因突变过程中检测耐药基因突变4.4.用于血液筛查用于血液筛查5.5.用基因分型方法进行病原体种群分类。用基因分型方法进行病原体种群分类。 已通过国家药品食品监督管理局（ SFDA ）审批的基因诊断试剂 序号序号 试剂盒名称试剂盒名称 1 1 乙型肝炎病毒（乙型肝炎病毒（HBVHBV）核酸扩增（）核酸扩增（PCRPCR）荧光检测试剂盒）荧光检测试剂盒 2 2 乙肝病毒核酸荧光定量检测及乙肝病毒核酸荧光定量检测及YMDDYMDD变异检测试剂盒变异检测试剂盒 3 3丙肝

27、病毒（丙肝病毒（HCVHCV）核酸扩增（）核酸扩增（PCRPCR）荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒 4 4 结核分支杆菌（结核分支杆菌（TBTB）核酸扩增（）核酸扩增（PCRPCR）荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒 5 5沙眼衣原体（沙眼衣原体（CTCT）核酸扩增（）核酸扩增（PCRPCR）荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒 6 6 沙眼衣原体和淋球菌（沙眼衣原体和淋球菌（CT&NGCT&NG）核酸扩增（）核酸扩增（PCRPCR）荧光检测试）荧光检测试 剂盒剂盒 7 7 人乳头瘤病毒（人乳头瘤病毒（HIVHIV）核算扩增（）核算扩增（PCRPCR）荧光检测试剂盒）荧光检测试剂盒 8 8 人类免疫缺陷病毒（人

28、类免疫缺陷病毒（HIV1HIV1）核酸扩增（）核酸扩增（PCRPCR）荧光定量检测）荧光定量检测试剂盒试剂盒 9 9 新型冠状病毒（新型冠状病毒（SARSSARS）核酸扩增（）核酸扩增（PCRPCR）荧光检测试剂盒）荧光检测试剂盒 10 10 神经管畸形基因检测（神经管畸形基因检测（PCRRFLPPCRRFLP）试剂盒）试剂盒 11 11 地中海贫血基因检测试剂盒（基因芯片法地中海贫血基因检测试剂盒（基因芯片法) ) 拉米夫定治疗慢性乙肝疗效显著，但长期使用拉拉米夫定治疗慢性乙肝疗效显著，但长期使用拉米夫定会出现耐药现象。使用一年、二年、三年、四米夫定会出现耐药现象。使用一年、二年、三年、四年

29、的耐药比率为年的耐药比率为 15-32% 15-32% 、 38% 38% 、 49% 49% 、 66% 66% 。因。因此，服药前期及服药期间监测此，服药前期及服药期间监测 YMDD YMDD 的变化及的变化及 HBV HBV DNA DNA 含量就显得十分重要。拉米夫定耐药的主要原因含量就显得十分重要。拉米夫定耐药的主要原因是病毒多聚酶基因的是病毒多聚酶基因的 YMDD YMDD （酪氨酸蛋氨酸天冬（酪氨酸蛋氨酸天冬氨酸天冬氨酸）区域发生突变，即由氨酸天冬氨酸）区域发生突变，即由 YMDD YMDD 突变为突变为 YIDD YIDD 或或 YVDD YVDD ，从而产生耐药。蛋氨酸突变为

30、异亮氨，从而产生耐药。蛋氨酸突变为异亮氨酸酸 或或 缬缬 氨酸氨酸，从而降低了拉米夫定的亲和力，从而降低了拉米夫定的亲和力，减弱拉米夫定对突变病毒复制的抑制能力减弱拉米夫定对突变病毒复制的抑制能力 病原体基因诊断的发展趋势病原体基因诊断的发展趋势 1 1 、提高自动化程度。从标本预处理、核酸提、提高自动化程度。从标本预处理、核酸提取到基因扩增和产物检测都有望实现自动化，取到基因扩增和产物检测都有望实现自动化，可将人为误差降到最小，提高检测的精确度，可将人为误差降到最小，提高检测的精确度，提高工作效率。提高工作效率。 2 2 、测定方法和工作程序的标准化。通过标准、测定方法和工作程序的标准化。通

31、过标准化改善实验室测定准确度，从而提高不同实验化改善实验室测定准确度，从而提高不同实验室间结果的可比性。室间结果的可比性。 3 3 、在严密设计的临床应用研究基础上，确定、在严密设计的临床应用研究基础上，确定每一个基因诊断项目适用的范围，避免滥用造每一个基因诊断项目适用的范围，避免滥用造成的困扰和不必要的费用。成的困扰和不必要的费用。 4 4 、开发更加快捷廉价的检测方法、开发更加快捷廉价的检测方法三三. .基因诊断在法医学中的应用基因诊断在法医学中的应用DNA指纹技术：指纹技术：遗传基础是遗传基础是DNA的多态性的多态性个体特征标志的序列个体特征标志的序列建立于建立于1985年年Humang

32、enome:3.3billionbpwith40000genes1.1%:exons;(Codingregion)24%introns,75%intergenicNoncodingGenome:1.Codingregion(编码区编码区)：5%2.inhumangenome(1.5%).3.Noncoding(非编码非编码)DNA:introns(内含子内含子),tandemlyrepeated(串连重复串连重复)sequences(e.g.satelliteDNA)orinterspersedrepeats分散重复分散重复(e.g.Aluelement).可变串联重复序列（可变串联重复序列（

33、variablenumberoftantemrepeatVNTR)5 ATAAACTATAAACTATAAACT 33 TATTTGATATTTGATATTTGA 5n（核心序列）Satellitescomprisemorethan40%ofthegenomeDNA指纹技术的原理：指纹技术的原理：P457An application of An application of repeated DNA sequences repeated DNA sequences found in mammalian found in mammalian genomesgenomesHighly variab

34、le Highly variable between individualsbetween individualsNo two people are the No two people are the same, except identical same, except identical twinstwins1 1 高度的特异性高度的特异性 2 2 稳定的遗传性：稳定的遗传性： DNA DNA 是人的遗传物质，是人的遗传物质，其特征是由父母遗传的。分析发现，其特征是由父母遗传的。分析发现， DNA DNA 指指纹图谱中几乎每一条带纹都能在其双亲之一的纹图谱中几乎每一条带纹都能在其双亲之一的

35、图谱中找到，这种带纹符合经典的孟德尔遗传图谱中找到，这种带纹符合经典的孟德尔遗传规律，即双方的特征平均传递规律，即双方的特征平均传递 50 50 给子代。给子代。 3 3 体细胞稳定性：即同一个人的不同组织如体细胞稳定性：即同一个人的不同组织如血液、血液、 肌肉、毛发、精液等产生的肌肉、毛发、精液等产生的 DNA DNA 指纹指纹图形完全一致。图形完全一致。 DNA 指纹的特点 第四节第四节基因治疗的策略和基本程序基因治疗的策略和基本程序基因治疗：将外源基因导入靶细胞并有效表达，基因治疗：将外源基因导入靶细胞并有效表达，从而达到治疗疾病的目的。从而达到治疗疾病的目的。程序：选择治疗（目的）基因

36、程序：选择治疗（目的）基因选择基因治疗的靶细胞选择基因治疗的靶细胞将治疗基因转移到体内将治疗基因转移到体内一、策略：致病基因的原位置换策略：致病基因的原位置换基因的异位替代基因的异位替代直接抑制有害基因的表达直接抑制有害基因的表达一、选择治疗（目的）基因一、选择治疗（目的）基因1.1.能改变肿瘤细胞的恶性表型的基因能改变肿瘤细胞的恶性表型的基因 肿瘤细胞主要有癌基因的突变、扩增、过度表达，对此可采用反义核酸或核酶；抑癌基因的突变、失活等，可采用野生型的正常基因作为治疗基因，用正常基因剔除或替换缺陷基因。能提高肿瘤细胞的免疫原性的基因 向肿瘤细胞转导参与细胞免疫的细胞因子（如IL-2、GM-CS

37、F）基因，共刺激分子B7基因等，以增强宿主的抗癌免疫反应，可统称为免疫基因治疗。肿瘤药物增敏基因肿瘤药物增敏基因 肿瘤药物敏感基因治疗是将编码某一敏感性因子的基因转入肿瘤细胞，使肿瘤细胞对某种原本无毒或低毒的药物产生特异的敏感性而死亡。这一表达敏感性因子的基因也被称为自杀基因.常用的自杀基因有单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSK-TK）基因 ,该基因能将无细胞毒性的原药丙氧鸟苷（GCV）磷酸化，对细胞产生毒性作用 二、选择基因治疗的靶细胞二、选择基因治疗的靶细胞1、发病的器官及位置、发病的器官及位置2、容易取出和植入、容易取出和植入3、容易在体外培养、容易在体外培养4、容易被转导、容易被转导5、寿命较

38、长、寿命较长免疫细胞 外周血淋巴细胞是恶性肿瘤、获得性及遗传性免疫系统紊乱性徉病的基因治疗的主要靶细胞。主要以T淋巴细胞为主成纤维细胞 成纤维细胞位于全身并具有较强的自我更新能力。优点有：易于获得；容易体外培养和扩增；分裂中的成纤维细胞易与逆转录病毒一起稳定转导，并能较稳定的表达外源目的基因；携带外源基因后能稳定地回植体内并进行表达；回植的成纤维细胞容易取出，等。主要缺点是在体内由于细胞凋亡而引起的基因表达失活。 骨骼肌细胞 易于获得及在体个可大量扩增，可用于治疗累及肌肉的遗传病及一旦插入分泌性基因可使基因产物直接分泌进入血液等。 血管平滑肌细胞 血管平滑肌细胞易于获得、培养和移植，故是基因治

39、疗常用的靶细胞。造血干细胞 造血干细胞是基因治疗遗传病、自身免疫性疾病及癌症常用的靶细胞。在肿瘤基因治疗中，造血干细胞是耐药基因、细胞因子基因等较理想的受体细胞。 1 1、非病毒导入法、非病毒导入法： 直接注射法、电穿孔法、脂质体法、直接注射法、电穿孔法、脂质体法、 阳离子多聚体阳离子多聚体2 2、病毒载体导入法、病毒载体导入法三、基因转移系统三、基因转移系统1). 1). 反转录病毒载体反转录病毒载体2). 2). 腺病毒载体腺病毒载体3). 3). 腺相关病毒载体腺相关病毒载体4)4)单纯疱疹病毒（单纯疱疹病毒（HSVHSV）反转录病毒载体反转录病毒载体 逆转录病毒载体系统共由两部分组成：

40、包装细胞系和缺陷病毒本身 优点: 逆转录病毒载体作为应用最为广泛的一种病毒载体, 技术相对较为成熟, 其携带的外源基因能够整合到细胞基因组中从而稳定表达, 同时, 由于逆转录病毒携带有抗性基因可用于进一步筛选阳性细胞, 以提高细胞阳性率。缺点:RV只能整合增殖态细胞,容纳基因较小,插入诱变,受体依赖性等LTRLTRFHFHG.MJMJJKJJJgappolenvgappolenvLTRLTR治疗基因治疗基因LTRLTR治疗基因治疗基因重组重组包装细胞包装细胞和细胞染色体整合和细胞染色体整合转染转染包装细胞中表达的包装细胞中表达的蛋白包装病毒载体蛋白包装病毒载体靶细胞靶细胞回输体内回输体内治疗作

41、用治疗作用假病毒颗粒假病毒颗粒反转录病毒载体基因结构图反转录病毒载体基因结构图腺病毒载体腺病毒载体腺病毒(Adenoviridae,Ad)的形态是特征性的二十面体病毒壳体其病毒壳体含有三种主要的蛋白：六邻体（II），五邻体基底（III）和纤突（IV），还有多种其他的辅助蛋白VI，VIII，IX，IIIa和Iva2 ,腺病毒基因组是一个线性的双链DNA 优点优点: :易于培养和纯化易于培养和纯化, ,基因组较大基因组较大( (平均平均36kb),36kb),适合于容纳大片段外源基因适合于容纳大片段外源基因, ,载体容易构建和操作载体容易构建和操作宿主范围广，感染性强，能感染分化后的非分裂期细胞宿

42、主范围广，感染性强，能感染分化后的非分裂期细胞其基因不整合到宿主细胞中，无插入突变激活癌基因的危险，其基因不整合到宿主细胞中，无插入突变激活癌基因的危险，外源基因能游离地表达外源基因能游离地表达, ,仅瞬间表达仅瞬间表达, ,安全性高安全性高。 缺点缺点: :表达外源基因时间短，表达外源基因时间短，免疫原性强免疫原性强, ,可引发机体内强烈的炎症反应和免疫可引发机体内强烈的炎症反应和免疫反应反应, ,限制了腺病毒载体的实际应用和发展限制了腺病毒载体的实际应用和发展几乎可感染所有细胞几乎可感染所有细胞, ,缺乏特异性缺乏特异性腺病毒的一般特性腺病毒的一般特性家族性高胆固醇血症（familialh

43、ypercholesterolaemia,FH）是由肝细胞低密度脂蛋白（lowdensitylipoprotein,LDL）受体缺乏导致而成，与高胆固醇和早期冠状动脉疾病有关。最初在细胞培养中证实了Ad载体介导的LDL受体基因转移，注射过载体的小鼠血浆中胆固醇水平明显减少。据LDL受体的免疫荧光和-半乳糖苷酶染色等实验检测，大约90%的肝细胞表达了Ad转移的基因。将该载体注入一种叫新西兰白兔（NZW）中，发现NZW兔血清中胆固醇明显减少。 腺病毒介导的低密度脂蛋白受体基因转移腺病毒介导的低密度脂蛋白受体基因转移腺病毒介导的1抗胰蛋白酶基因转移 腺病毒介导的囊性纤维变性转导调节因子（CFTR）基

44、因转移腺病毒介导的杜氏肌肉营养不良症（DMD）基因转移腺病毒介导的因子基因转移(血友病B ) 腺病毒介导的因子基因转移(血友病A ) 腺相关病毒载体腺相关病毒载体优点优点：AAVAAV并不引起任何疾病，并不引起任何疾病，病毒本身只有两个基因，即复制基因病毒本身只有两个基因，即复制基因reprep和编码衣壳蛋白和编码衣壳蛋白的基因的基因capcap，后者易于消除并可降低细胞毒性，后者易于消除并可降低细胞毒性T-T-淋巴细胞淋巴细胞反应的危险性；反应的危险性；病毒病毒DNADNA能够稳定有效地整合人细胞基因组，如果没有辅能够稳定有效地整合人细胞基因组，如果没有辅助病毒如腺病毒、助病毒如腺病毒、疱疹

45、疱疹病毒或水痘病毒等共感染，野生病毒或水痘病毒等共感染，野生型型AAVAAV就潜伏在就潜伏在1919号染色体上的特定部位，直到辅助因子号染色体上的特定部位，直到辅助因子出现才复制；出现才复制；有宽广的宿主范围，可感染分裂期及静止期的细胞有宽广的宿主范围，可感染分裂期及静止期的细胞, ,在动物模型中表达可持续半年以上在动物模型中表达可持续半年以上 缺点:病毒小，最大插入痛列仅4.5kb，复制基因rep缺失的AAV与野生型AAV相比，载体整合效率较低、位点特异性较差 单纯疱疹病毒（HSV） HSV是嗜神经性病毒，该载体可用于脑肿瘤基因治疗。其优点是容量大（4045kb），能感染有丝分裂后细胞，能永

46、久维持潜伏状态等。缺点是可能引起潜伏感染等。四、基因敲出技术（四、基因敲出技术（gene knockout)gene knockout) 是指通过基因同源重组的过程定向的在是指通过基因同源重组的过程定向的在活细胞中从基因组上移出特定基因的过程，活细胞中从基因组上移出特定基因的过程，从而建立基因剔除细胞和基因剔除生物从而建立基因剔除细胞和基因剔除生物1、打靶载体的构建、打靶载体的构建2、将打靶载体导入细胞（小鼠胚胎干细胞，、将打靶载体导入细胞（小鼠胚胎干细胞，ES)3、对转染细胞进行筛选、对转染细胞进行筛选4、将阳性细胞导入假孕小鼠子宫中、将阳性细胞导入假孕小鼠子宫中5、杂交育种，获得基因剔除的

47、纯合子小鼠杂交育种，获得基因剔除的纯合子小鼠步骤：步骤：打靶载体的构建打靶载体的构建五、基因治疗的临床应用五、基因治疗的临床应用恶性肿瘤恶性肿瘤1 1、导入抑癌基因、导入抑癌基因2 2、封闭癌基因的过度表达、封闭癌基因的过度表达反义反义RNARNA: :RNARNA干涉干涉（RNAiRNAi):):是指由短的双链是指由短的双链RNARNA诱导的同源诱导的同源RNARNA降解的过程降解的过程反义反义RNA(antisenseRNA(antisense RNA): RNA):是指与mRNA互补的RNA分子,通常由15-20个核苷酸组成。这种反义RNA能与mRNA分子特异性地互补结合，从而 抑制该m

48、RNA的加工与翻译.两种机制两种机制: : 1.反义寡聚核苷酸可以激活RNaseH，该酶可以切割DNARNA杂合分子中的RNA链，导致靶mRNA降解2.反义寡聚核苷酸可以通过空间位阻效应阻止核糖体结合来抑制靶mRNA的翻译靶RNA上的结合位点必须是暴露的反义试剂必须被保护起来免遭核酸酶攻击必须保证反义试剂能够被细胞摄取并在胞内正确定位 需克服技术问题需克服技术问题: : RNARNA干涉（干涉（ RNA interferenceRNA interference RNAiRNAi):): 是一种由短双链是一种由短双链RNA(21-23b)RNA(21-23b)诱发的基诱发的基因沉默（因沉默（ge

49、ne silencinggene silencing）。在此过程中，）。在此过程中，与双链与双链RNARNA有同源序列的信使有同源序列的信使RNARNA（mRNAmRNA）被）被降解，从而抑制了该基因的表达降解，从而抑制了该基因的表达 2001，2002连续两年被美国Science杂志评选为年度10大突破技术 2个步骤：（1）长双链RNA被细胞源性的双链RNA特异的核酸酶(Dicer)切成21-23个碱基对的短双链RNA，称为小干扰性RNA（small interfering RNA）（2）小干扰性RNA与细胞源性的某些酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced

50、silencing complex,RISC），该复合体可识别与小干扰性RNA有同源序列的mRNA，并在特异的位点将该mRNA切断 (附图附图) RNA干扰（RNA interference）是一种由双链RNA诱发的基因沉默（gene silencing）。在此过程中，与双链RNA 长度为长度为2121个碱基、个碱基、33末端有末端有2 2个碱基突个碱基突出的小干扰性出的小干扰性RNARNA活性较高。小干扰性活性较高。小干扰性RNARNA诱诱发的基因抑制具有高度的序列特异性。在小发的基因抑制具有高度的序列特异性。在小干扰性干扰性RNARNA上一个错配的碱基对即可使其失上一个错配的碱基对即可使其

51、失去原有的抑制基因表达的活性。这一特性在去原有的抑制基因表达的活性。这一特性在将将RNARNA干扰技术用于治疗人类疾病时极为重干扰技术用于治疗人类疾病时极为重要，为减少或避免抑制不相关基因奠定了基要，为减少或避免抑制不相关基因奠定了基础。础。 目前RNA干扰技术主要应用于探查基因功能和探索治疗肿瘤或感染性疾病的可能性.初步的实验结果提示RNA干扰技术可用于治疗有异常基因的人肿瘤。用RNA干扰技术可以阻碍K-RAS蛋白的表达从而抑制肿瘤发生，或杀死有bcr/ab1的人白血病细胞系。通过RNA干扰抑制某些内源性基因的表达能促进白血病细胞系的细胞凋亡或增加其对化疗药物的反应性。 将RNA干扰技术用于

52、临床治疗人类疾病还有许多研究工作要做，如何将小干扰性RNA或能在细胞内生成小干扰性RNA样转录物的质粒DNA或病毒载体安全、有效地导入靶组织或靶细胞就是一个必须解决的问题。RNA干扰技术用于治疗人类疾病的安全性仍是个未知数。 心脑心脑血管疾病血管疾病家族性高胆固醇血症家族性高胆固醇血症LDL-R单基因遗传病单基因遗传病血友病，凝血因子血友病，凝血因子VIII,IX缺乏缺乏900多个基因治疗方案，治疗病例多个基因治疗方案，治疗病例8000多多六.问题及展望 基因治疗无疑是近30年来生命科学发展的一种结果。从理论上讲，若能将与疾病发生有关的基因进行矫正或修复，应是一种有效的根治方法，可惜目前还不能

53、达到此目的，这应是今后研究的一个重要方向. 在这当中，其中最具有挑战性的问题是运送治疗基因的载体系统，2000年时，宾州大学有病人在基因治疗中死亡，2002年在法国又发生先天免疫不全症bubble boys基因治疗临床试验发生白血病的副作用。这两件失败的案例，皆被归因于病毒载体的不安全性.理想载体应具备下列条件：安全无毒害；不引起免疫反应；高浓度或高滴度；能高效转移外源基因 ,持续有效表达外源基因；可靶向特定组织细胞；可调控；容纳外源基因可大可小；可供体内注射（包括全身性静脉注射）；便于规模生产供临床应用，可惜目前所应用的载体尚没有一个能符合上述全部的条件。这是今后努力研究的方向。 从理论上来说基因治疗是治疗癌症的最好办法，但由于其是新生事物，有些问题仍在探索之中，例如如何将病毒给到肿瘤的局部肿块部位，产生高浓度病毒攻击肿瘤细胞？每次要注入多少剂量的病毒？隔多长时间注入一次？如何解决体内产生抗体，把病毒包起来，使其无法发生作用等问题。在目前的技术手段下，癌症治疗仍要以手术、放疗、化疗三大手段为主，基因治疗只能作为补充。