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1、宫颈脱落细胞HPV DNA检测l流行病学和分子生物学资料表明，人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染可引起子宫颈上皮内瘤变（CIN）及子宫颈癌的发生，并且不同HPV型别的致病能力也不同；高危型HPV的持续感染是促使宫颈癌发生的最主要因素。因此，HPV感染的早期发现、准确分型和病毒定量对于子宫颈癌防治具有重要意义，将HPV感染检测作为子宫颈癌及癌前病变的常规筛查手段已逐渐在临床推广。（一）HPV的生理特性lHPV属于乳头多瘤空泡病毒科（papovaviridae）乳头瘤病毒属，是一种环状的双链DNA病毒，其核心是由约78007900个碱基对以共价键组成的含有遗传信
2、息的闭合环状双链DNA，外为72个壳粒包被，形成对称的20面体。病毒外无包膜，直径约55nm，分子量约5.4kD。lHPV有多种基因型，目前已有120余种基因型被确定，其中约30种涉及生殖道感染。不同类型的HPV感染可导致不同临床病变。根据生物学特征和致癌潜能，HPV被分为高危型（high risk）和低危型（low risk）。高危型如HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68等与癌及癌前病变相关，低危型如HPV6、11、42、l43、44等主要与轻度鳞状上皮损伤和泌尿生殖系统疣、复发性呼吸道息肉相关。lHPV具有高度宿主特异性，适于在温暖、潮湿
3、的环境生长，主要感染人体特异部位皮肤、黏膜的复层鳞状上皮。性接触为主要传染途径，病期在3个月左右传染性最强，其他途径如接触传播或母婴直接传播传染不能排除。lHPV感染率高主要取决于人群的年龄和性行为习惯。性活跃妇女的HPV感染率最高，感染高峰年龄在1828岁。然而大部分妇女的HPV感染期比较短，在23年，一般在810个月便可自然消失，大约只有10%15%的35岁以上妇女呈持续性感染。这种持续感染HPV的妇女，有更高的患子宫颈癌的风险。在妇女的一生中，可反复感染HPV，也可同时感染多种不同型别的HPV。HPV感染后通常没有明显临床症状，因此很难估计影响HPV感染的危险因素，除性行为习惯外，其他可
4、能危险因素包括口服避孕药、妊娠以及细胞介导的免疫功能损害等。（二）HPV感染与子宫颈癌及其癌前病变的关系l几乎所有流行病学资料结合实验室的数据都强有力地支持高危型HPV持续感染是子宫颈癌发生的必要条件：99.7%的子宫颈癌中都能发现高危型HPV感染，高度病变（HSIL）中约97%为阳性，低度病变（LSIL）中的阳性率亦达61.4%。实验动物和组织标本研究还表明HPVDNA检查的滴度与子宫颈癌病变的程度成正相关。HPV感染与子宫颈癌的发生有时序关系，从感染开始至发展为子宫颈癌的时间间隔1015年，符合生物学致病机制。l高危型HPV E6、E7基因编码的原癌蛋白是导致子宫颈上皮癌变的重要因子。E6
5、蛋白通过E6-AP能特异性结合p53蛋白形成复合物。促使p53蛋白快速降解，导致细胞周期失控，其效应等同于p53突变。E7蛋白和pRb有高亲和性，使E2F和pRb复合物解离，G1期进入S期所需基因如c-myc、DNA聚合酶等得以转录，使细胞周期失控而发生永生化。l来自世界范围的子宫颈癌组织标本的研究发现：在检出的所有型别中，HPV16占50%，HPV18占14%，HPV45占8%，HPV31占5%，其他型别HPV占23%。HPV16、18型感染很普遍，没有明显的地区差异。但其他HPV型别的感染存在地区差异，如HPV45型多见于非洲西部，HPV39、59型只在美洲中、南部出现，而HPV52、58
6、在中国及东亚妇女中检出率较高。HPV的型别还与子宫颈癌的病理类型相关：子宫颈鳞癌中HPV16感染率约为56%，而子宫颈腺癌中HPV18感染率约为56%。（三）HPV监测方法l大部分HPV感染无临床症状或为亚临床感染，不能作为一个普通的临床疾病或通过常规筛查计划或性传播疾病调查得以发现，只能通过HPV检测得知。由于HPV不能在体外细胞培养，故不能有简便的血清学检测进行HPV诊断和分型。临床上用于检测HPV的方法包括细胞学方法、免疫组化、原位杂交、斑点杂交、核酸印迹和PCR等。l1.传统检测方法 主要通过形态学和免疫学方法对HPV进行检测。前者包括巴氏涂片细胞病理学检测、电镜技术（直接观察病毒颗粒
7、）、宫颈荧光检查等；后者包括免疫组化法通过抗HPVL1蛋白抗体与外壳蛋白反应检测HPV，采用放射免疫沉淀法测定CIN组织和血清中的HPV16抗体水平、用血清免疫吸附试验（ELISA）检测血清中的HPVE6、E7特异性抗体蛋白等。 传统方法的特异度和灵敏度均不够理想，存在较高的假阳性率和假阴性率，且不便于对HPV进行分型，目前应用较少。l2.PCR检测HPV DNA 此类方法可检测核酸杂交阳性标本中的HPV DNA片段，灵敏度高。包括常规PCR、实时荧光定量PCR（FQ-PCR）、PCR-ELISA检测及PCR结合反向点杂交技术检测等。不仅可以对HPV阳性感染进行确诊，还可以进行HPV的分型。操
8、作简单，标本来源不受限制。其缺陷在于它的灵敏度高，易因样品的交叉污染而导致假阳性结果。 新型集成技术应用PCR的高灵敏性、导流杂交技术的高特异的特性，并通过多重定性的检测提高了检测的准确性。该方法提供HPV16型、18型和其他12型共14种高危HPV型别（HPV31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66和68）汇总的结果，该方法将HPV16型、18型这两种最高危型别单列，将有助于初筛过程中分层分析和进一步筛查及处理。l3.杂交捕获HPV DNA分析 此类方法有较好的特异度和敏感度，可以进行HPV DNA分型，各种核酸杂交检测方法有一定的优缺点。 （1）核酸印迹原位杂交：适
9、用于HPV分型和HPV DNA分子量鉴定，虽然灵敏度高，但因操作复杂，需要新鲜组织标本，不便在临床大规模使用。 （2）斑点印迹：其敏感度和特异度均低于核酸印迹原位杂交法，虽然经济实用，但实验过程存在有放射性污染，是环保不能轻视的问题。 （3）原位杂交：通过非放射性探针对石蜡组织进行检测，能作定位检测，假阳性率低，但灵敏度不高，大大降低了临床使用价值。 （4）杂交捕获法：是目前临床使用的一种检测HPV DNA的非放射性技术。基本原理是应用高效的液相RNA-DNA杂交方法捕获样品中的HPV DNA。采用碱性磷酸酶标记抗RNA：DNA抗体-化学发光信号显示系统。第二代杂交捕获法（HC-2）可同时检测
10、13种高危型HPV（16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68），研究显示HPV DNA捕获法检测的灵敏度和特异度分别为95%和85%，目前广泛应用于子宫颈癌的筛查和复查。l4.病理组织学检查 结合原位杂交技术应用组织或细胞在病理切片上和分子探针进行HPV DNA杂交，既可观察组织学形态变化，也可对HPV进行分型检测，是较理想的病理学检测的研究方法。目前国内商缺乏稳定的探针，且操作较复杂，不适于大规模筛查。 目前美国FDA已批准三种HPV DNA检测方法：Hybrid Capture2（CH-2）（USA，2003）；Cervista HPV HR（USA，2
11、009）；Cobas HPV（USA，2011）。（四）HPV检测的临床价值l高危型HPV感染的检测对于预防和早期发现子宫颈癌及其癌前病变有非常重要的意义。HPV检测在子宫颈癌筛查中的临床价值主要有以下几方面：l1.与细胞学检查联合或单独使用进行子宫颈癌的初筛，有效减少细胞学的假阴性结果。适用于大面积普查，初筛聚焦高风险人群。2012年3月NCCN公布了新版的，指南中指出高危型HPV检测已经作为子宫颈癌的初筛（如与细胞学检查联合成联合筛查）及异常细胞学结果处理的组成部分。 宫颈细胞学筛查，尤其是传统的宫颈巴氏涂片检查，存在相当比例的假阴性结果。高危型HPV检测对宫颈上皮病变的阴性预测值达99.
12、7%，可减低或消除由于细胞学筛查假阴性所造成的漏诊。研究显示将细胞学和HPV DNA检测联合使用可达到极高的灵敏度和几乎100%的阴性预测值，细胞学和HPV DNA均阴性者，发病风险较低，可适当延长其筛查间隔时间，降低检测费用。l2003年卫生部疾病控制司委托中国癌症研究基金会组织专家制定的子宫颈癌筛查及早诊治指南建议，有3年以上性行为或21岁以上有性行为的妇女应每年1次细胞学检查，连续两次细胞学正常可改至3年后复查；连续2次HPV检测和细胞学正常可延至58年后复查。 2.可根据HPV感染基因型预测受检者患宫颈癌的风险。HPV型别与宫颈病变的级别存在一定的关系，各型别对宫颈上皮的致病力亦不相同
13、。如HPV16或18阳性患者其ASCUS或LISL转变为CINIII的概率远高于其他HPV型别阳性或未检出HPV者；而细胞学阴性而高危型HPV阳性者，一般不作处理，但发病风险高，对这类人群要坚持定期随访。 3.对未明确诊断意义的不典型鳞状上皮细胞或腺上皮细胞（atypical cells of undetermind significance，ASCUS），应用HPV检测可进行有效的分流。HPV DNA检测可应用于检测临床上可疑涂片，将CIN从细胞学结果为未明确诊断意义的非典型鳞状上皮细胞/腺上皮细胞中有效检出。在这些患者当中，仅高危型HPV检测阳性者需进一步进行阴道镜及活检，对HPV DNA
14、检测阴性患者进行密切随访，从而减少阴道镜使用频率，避免因过度诊断和治疗给患者及医生造成负担。l4.对宫颈高度病变手术治疗后的患者，HPV检测可作为其疗效判断和随访检测的手段，预测其病变恶化或术后复发的风险。各级CIN保守治疗方法的总有效率为90%95%，治疗失败包括残存病灶、复发甚至进展至癌，切缘情况并不能成为治疗失败的可靠预测指标。研究表明宫颈锥切术后应用HPV DNA检测可预测残余CIN，并有很高的灵敏度和阴性预测值。手术后612个月检测HPV阴性，提示病灶切除干净，可最大限度减少病人的焦虑情绪。若术后HPV检测阳性，提示有残余病灶及有复发的可能，需严密随访。（五）HPV检测的推荐筛查策略
15、l由于HPV感染在年轻妇女非常普遍，但大多数为一过性感染，所以对年轻妇女特别是青春期女孩不推荐HPV检测作为初筛。根据WHO的推荐，3065岁之间的妇女均应进行高危型HPV筛查，高危人群起始年龄应相应提高。高危妇女人群定义：HIV感染、器官移植、长期应用皮质激素的妇女。虽然30岁以下妇女患子宫颈癌的危险性较低，但考虑到高危人群起始年龄应相应提前，因此，具有高危因素和己烯雌酚暴露史或细胞学结果ASCUS的年轻妇女应进行HPV DNA检测，同时建议HPV DNA初筛检测应从2530岁开始。细胞学和高危型HPV DNA检测均为阴性者，表明其发病风险很低，可将筛查间隔延长至35年。细胞学阴性而高危型H
16、PV DNA阳性者发病风险增高，可1年后复查细胞学和高危型HPV DNA检测，若HPV16/HPV18 DNA检测阳性，即使细胞学阴性也应该进一步性阴道镜检查，若为阴性，则1年后复查。近年来，国内外学者发现检测宫颈脱落细胞中人端粒酶RNA基因、P16ink4等标志物有助于细胞学阴性而高危型HPV DNA阳性者的分流。l在医疗不发达地区，妇女至少应在性活跃及生育年龄期进行1或2次HPV检测，且检测结果阳性的妇女进一步行细胞学检查。而在医疗发达地区，HPV检测联合细胞学检查的筛查策略则更为推荐。 美国肿瘤学会/阴道镜和子宫颈病理学学会/临床病理学学会（American Cancer Society
17、/American Society for Colposcopy and Cervical Pathology/American Society for Clinical Pathology，ACS/ACCSP/ASCP ）和欧洲生殖道感染和肿瘤研究组织（European Research Organization on Genital Infection and Neoplasia，EUROGIN）分别提出的子宫颈癌及癌前病变筛查指南供参考。详见下图：30岁成年女性高危型HPV DNA检测的随访l筛查发现 HPV DNA检查的随访 处理 （细胞学阴性） HPV DNA阳性和细胞学/巴氏涂片阴
18、性HPV16或16/18基因型特异性检测或12个月后复查两项筛查宫颈细胞学/巴氏涂片和HPV DNA检查HPV16或16/18DNA特异性检测阴性HPV16或16/18DNA特异性检测阳性12个月后复查两项检查：宫颈细胞学/巴氏涂片 和HPV DNA阴道镜两项检查均阴性或HPV DNA检查阴性且细胞学/巴氏涂片检查为ASCUSHPV DNA检查阴性且细胞学巴氏涂片检查为ASCUSHPV DNA检查阳性且细胞学/巴氏涂片检查为阳性/阴性按照指南常规筛查方案 按照相 应细胞 异常结 果的处 理方法阴道镜 30岁女性高危型HPV DNA检测的随访筛查指南 (ACS/ASCCP/ASCP，2012）l 2564岁妇女高危型HPV检测阴性阳性5年后复检细胞学正常或可疑轻度异常612个月行HPV或细胞学检查阴道镜HPV或细胞学检查阴性HPV阳性或细胞学轻度异常 HPV阴性或细胞学可疑l细胞学轻度异常 35年后复检l612个月行HPV或细胞学检查 阴道镜l2564岁女性高危型HPV DNA检测的随访筛查指南（EUROGIN，2010）
