饲料中粗蛋白的测定ppt课件

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1、4.3 4.3 饲料中粗蛋白的测定饲料中粗蛋白的测定 蛋白质是畜禽日粮中最主要的物质之一，蛋白质是生命的物质根底。测定饲料中蛋白质的含量，对于初步评价饲料的营养价值、合理开发利用饲料蛋白资源、提高产质量量、优化饲料配方、指点经济核算及消费过程控制均具有极重要的意义。饲料中蛋白质的检测非常重要！ 7/25/2024 一、蛋白质的测定方法一、蛋白质的测定方法1 1直接法直接法 根据蛋白根据蛋白质质的物理、化学性的物理、化学性质质直接直接测测定蛋定蛋白白质质含量。含量。双双缩脲缩脲法法FolinFolin酚酚试剂试剂法法 LowryLowry法法 紫外吸收法紫外吸收法 最常最常见见的的280nm28

2、0nm 考考马马斯亮斯亮兰兰法法 BradfordBradford法法 染料染料结结合法合法7/25/2024 一、蛋白质的测定方法一、蛋白质的测定方法2 2间间接法接法 经过测经过测定定样样品中品中总总含氮量推算蛋白含氮量推算蛋白质质含量含量 根根据：每种蛋白据：每种蛋白质质的含氮量是恒定的，的含氮量是恒定的，N6.25N6.25 。凯凯氏定氮法氏定氮法 KjeldahlKjeldahl 8989小小时时杜杜马马斯熄斯熄灭灭定氮法定氮法 Dumas Combustion MethodDumas Combustion Method 90012009001200高温熄高温熄灭灭，熄，熄灭过灭过程

3、中程中产产生混合生混合气体，其中的干气体，其中的干扰扰成分被一系列适当的吸收成分被一系列适当的吸收剂剂所所吸收，混合气体中的氮氧化物被全部复原成分子吸收，混合气体中的氮氧化物被全部复原成分子氮，随后氮的含量被氮，随后氮的含量被热导检测热导检测器器检测检测。3 35 5 分分钟钟强强碱直接蒸碱直接蒸馏馏法法 样样品在品在强强碱溶液中消煮，使蛋碱溶液中消煮，使蛋白白质质中的不中的不稳稳定氮素以氨的方式定氮素以氨的方式释释放出来，在放出来，在 一定条件下，所一定条件下，所释释放的氨和放的氨和样样品中的含品中的含氮量成正比且有很好的相关性，建立氮量成正比且有很好的相关性，建立 不不稳稳定氮量与全氮量之

4、定氮量与全氮量之间间的回的回归归方程。方程。 2020分分钟钟 纳纳氏氏试剂试剂比色法比色法 7/25/2024 12:53 PM 二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量u19世纪1883建立的经典方法，结果可靠最常用的规范方法，凯氏定氮法由于具有测定总有机氮量准确度高，可测定各种不同形状样品等两大优点，因此被公以为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的规范分析方法。u但操作费时89 h改良方法：加催化剂加快分析速度、仪器改良自动、半自动凯氏定氮仪。 7/25/2024 二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量1. 1. 原理原理 各种各种饲饲料

5、的有机物料的有机物质质在复原性催化在复原性催化剂剂 如如CuSO4CuSO4，K2SO4K2SO4或或Na2SO4Na2SO4或或SeSe粉粉 的的协协助下，用助下，用浓浓硫酸硫酸进进展消化作用，使蛋白展消化作用，使蛋白质质和其它有机和其它有机态态氮氮 如氨基酸、如氨基酸、酰酰胺、核酸，在一定胺、核酸，在一定处处置下也包括置下也包括硝酸硝酸态态氨氨 都都转变转变成成NH4+NH4+并与并与H2SO4H2SO4化合成化合成 NH4NH4 2SO42SO4，而非含氮物，而非含氮物质质，那么以，那么以CO2CO2，H2OH2O，SO2SO2形状逸出。然后加碱蒸形状逸出。然后加碱蒸馏馏，使氨蒸出，用，

6、使氨蒸出，用硼酸吸收后再以硼酸吸收后再以规规范范盐盐酸或硫酸溶液滴定。根酸或硫酸溶液滴定。根据据规规范酸耗范酸耗费费量可量可计计算出蛋白算出蛋白质质的含量。的含量。7/25/2024 二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量1. 1. 原理原理 ：使有机物脱：使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮；水后被炭化为碳、氢、氮； ：将有机物炭：将有机物炭化后的碳化为二氧化碳，硫酸那么化后的碳化为二氧化碳，硫酸那么 被复原成二被复原成二氧化硫；氧化硫； 2H2SO4 2H2SO4 C C 2SO22SO2 2H2O 2H2O CO2CO2 二氧化硫使氮复原为氨，本身那么被氧二氧化硫使氮复原为

7、氨，本身那么被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。留在酸性溶液中。 H2SO4 H2SO42NH3 2NH3 (NH4)2SO4(NH4)2SO42NH2(CH)2COOH 2NH2(CH)2COOH 13H2SO4 13H2SO4 (NH4)2SO4 (NH4)2SO4 6CO2 6CO2 12SO2 12SO2 16H2O16H2O 样样品消化品消化浓浓硫酸具有脱水性硫酸具有脱水性硫酸具有脱水性硫酸具有脱水性浓浓硫酸具有氧化性硫酸具有氧化性硫酸具有氧化性硫酸具有氧化性7/25/2024 二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量二、凯氏定氮法

8、测定粗蛋白含量1. 1. 原理原理 消化液在浓碱的作用下进展蒸馏，释放出消化液在浓碱的作用下进展蒸馏，释放出的氨态氮，用硼酸溶液吸收之并与之结合成为的氨态氮，用硼酸溶液吸收之并与之结合成为四硼酸铵。四硼酸铵。 蒸蒸蒸蒸馏馏馏馏2NaOH2NaOH (NH4)2SO4 (NH4)2SO4 2NH3 2NH3 Na2SO4 Na2SO4 2H2O2H2O2NH3 + 4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O2NH3 + 4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O7/25/2024 二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量1. 1. 原理原理 以甲基红溴甲酚绿作指示剂，用以甲基

9、红溴甲酚绿作指示剂，用HClHCl规范溶规范溶液液0.1mol/L0.1mol/L滴定，根据规范酸的耗费量，即可滴定，根据规范酸的耗费量，即可计算有机氮的含量。而后，根据不同的饲料再乘以计算有机氮的含量。而后，根据不同的饲料再乘以一定的系数通常用一定的系数通常用6.256.25系数计算，即为粗蛋白系数计算，即为粗蛋白质的含量。质的含量。 滴定滴定滴定滴定 (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3B(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3O37/25/2024 二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量凯氏定氮瓶或消化管凯氏定氮瓶或

10、消化管及蒸馏安装及蒸馏安装硫酸铜硫酸铜硫酸钾硫酸钾硫酸硫酸2%硼酸溶液硼酸溶液 40%氢氧化钠溶液0.2%甲基红0.2%溴甲酚绿0.2%甲基红及0.2%溴甲酚绿的1+5混合指示剂0.1mol/L的规范盐酸溶液(或1/2硫酸溶液) 2. 2. 主要仪器及试剂主要仪器及试剂7/25/2024 二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3. 3. 测测定步定步骤骤 第一步第一步 样样品消化品消化 称取适量称取适量样样品品0.51g0.51g 含氮量含氮量5 580mg80mg ，无无损损失失 用用滤纸滤纸包好包好 地放入枯燥地放入枯燥凯凯氏氏烧烧瓶或瓶或消化管中，参与消化管中，参与0.

11、2g0.2g硫酸硫酸铜铜 CuSO45H2OCuSO45H2O ，3g3g无水硫酸无水硫酸钾钾 或无水硫酸或无水硫酸钠钠 及及10mL10mL硫酸，硫酸，悄然悄然摇摇匀后匀后进进展消化。展消化。 样样品品CuSO45H2OCuSO45H2OK2SO4K2SO4浓浓硫酸硫酸 透明透明蓝绿蓝绿色色空白空白实验：取与：取与处置置样品一品一样量的硫酸量的硫酸铜，硫酸硫酸钾，硫酸按同一，硫酸按同一方法作方法作试剂空白空白实验。7/25/2024 二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3. 3. 测测定步定步骤骤 第一步第一步 样样品消化品消化 硫酸硫酸铜铜/ /无水硫酸无水硫酸钾钾 或

12、无水硫酸或无水硫酸钠钠 的作用？的作用？ 大家想想！大家想想！ 1 1 K2SO4K2SO4或或Na2SO4Na2SO4的作用：提高溶液的沸点而加快的作用：提高溶液的沸点而加快有机物的分解；有机物的分解；K2SO4+H2SO4=2KHSO4 K2SO4+H2SO4=2KHSO4 2KHSO4=K2SO4+H2O+SO3 2KHSO4=K2SO4+H2O+SO3 但硫酸但硫酸钾钾参与量不能太大，否那么消化体参与量不能太大，否那么消化体系温度系温度过过高，又会引起已生成的高，又会引起已生成的铵盐发铵盐发生生热热分解分解而呵斥而呵斥损损失。失。7/25/2024 二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量二、凯氏

13、定氮法测定粗蛋白含量3. 3. 测测定步定步骤骤 第一步第一步 样样品消化品消化 硫酸硫酸铜铜/ /无水硫酸无水硫酸钾钾 或无水硫酸或无水硫酸钠钠 的作用？的作用？ 大家想想！大家想想！ 2 2 CuSO4CuSO4的作用的作用 催化催化剂剂，加速氧化分解；，加速氧化分解； 2CuSO4=CuSO4+SO2+O2 2CuSO4=CuSO4+SO2+O2 C+2CuSO4=Cu2SO4+SO2+O2C+2CuSO4=Cu2SO4+SO2+O2 Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+2H2O+SO2 Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+2H2O+SO2 此反响不断此反响不断进进展，待有机

14、物被消化完后，不展，待有机物被消化完后，不再有硫酸再有硫酸亚铜亚铜 褐色褐色 生成，溶液呈生成，溶液呈现现清澈的清澈的蓝绿蓝绿色。色。 可以指示消化可以指示消化终终点的到达；点的到达； 下一步蒸下一步蒸馏时馏时作作为为碱性反响碱性反响 参与碱量参与碱量 的的指示指示剂剂。7/25/2024 二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3. 3. 测测定步定步骤骤 第一步第一步 样样品消化品消化本卷本卷须须知：知：总总氮氮测测定定时时，消化至关重，消化至关重要。要。 消化在通消化在通风风橱中橱中进进展展 假假设设无通无通风风橱橱. 。 在消化开在消化开场时场时，应应控制火力控制火力

15、应应从从低温开低温开场场分分阶阶段升温至段升温至360360410 410 ，坚坚持持缓缓慢沸慢沸腾腾，防止，防止试样溅试样溅于瓶于瓶壁，壁，难难于消化使氨于消化使氨损损失。失。实验实验中要保中要保证证硫酸足量，否那么硫酸足量，否那么过过多的硫酸多的硫酸钾钾构成硫酸构成硫酸氢钾氢钾，而减弱，而减弱了硫酸的消化作用。了硫酸的消化作用。7/25/2024 二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3. 3. 测定步骤测定步骤 第二步第二步 氨的蒸馏氨的蒸馏 样品分解液定容样品分解液定容 试样消煮液令却，小心加试样消煮液令却，小心加20ml20ml水，移人水，移人100ml100ml容

16、量瓶中，冷却后，并用少量水洗定氮瓶，洗液容量瓶中，冷却后，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容置瓶中，再加水至刻度，作为试样分解液并入容置瓶中，再加水至刻度，作为试样分解液备用。备用。7/25/2024 二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3. 3. 测测定步定步骤骤 第二步第二步 氨的蒸氨的蒸馏馏 蒸蒸馏馏 蒸汽蒸汽发发生器的生器的预备预备：装好定氮装量，于水蒸气装好定氮装量，于水蒸气发发生瓶内装蒸生瓶内装蒸馏馏水至水至约约2 23 3处处，加甲基，加甲基红红指示液数滴指示液数滴及硫酸数滴，以及硫酸数滴，以坚坚持水呈持水呈酸性酸性 水水为为橙橙红红色，否那么色，否那么补补加硫酸

17、，大家想想加硫酸，大家想想为为什什么？么？ 。参与数粒玻璃珠以。参与数粒玻璃珠以防暴沸，用防暴沸，用调压调压器控制，器控制，加加热热煮沸水蒸气煮沸水蒸气发发生瓶内生瓶内的水。的水。防止水中氨态防止水中氨态氮的逸失而影氮的逸失而影响测定值。响测定值。7/25/2024 二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3. 3. 测测定步定步骤骤 第二步第二步 氨的蒸氨的蒸馏馏 蒸蒸馏馏 硼酸溶液的硼酸溶液的预备预备：向接向接纳纳瓶内参与瓶内参与20mL2%20mL2%硼酸及硼酸及2 2滴滴混合指示混合指示剂剂并使冷并使冷凝管下端插入液面凝管下端插入液面下。下。 7/25/2024 二、凯

18、氏定氮法测定粗蛋白含量二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3. 3. 测测定步定步骤骤 第二步第二步 氨的蒸氨的蒸馏馏 蒸蒸馏馏 开开场场蒸蒸馏馏：汲取：汲取10.0mL10.0mL样样品消化稀品消化稀释释液注入液注入凯凯氏定氮氏定氮仪仪的反响室中，用的反响室中，用10mL10mL蒸蒸馏馏水冲洗水冲洗进样进样入口，再加入口，再加10mL40%10mL40%氢氢氧化氧化钠钠溶液入反响室溶液入反响室 动动作要作要快，以防氨逸出快，以防氨逸出 ，塞好入口玻璃塞，塞好入口玻璃塞，在入口在入口处处加水密封，防止漏气。翻开水加水密封，防止漏气。翻开水蒸汽蒸汽发发生器与反响室之生器与反响室之间间的的夹夹子，蒸汽子，

19、蒸汽通入反响室使氨气被蒸通入反响室使氨气被蒸发发出来，并出来，并经过经过冷凝管而冷凝管而进进入接入接纳纳瓶内，以第一滴瓶内，以第一滴馏馏液液滴下开滴下开场计时场计时，蒸，蒸馏馏5min5min，使冷凝管分，使冷凝管分开吸收液面，在蒸开吸收液面，在蒸馏馏1min1min，用水冲洗冷，用水冲洗冷凝管末端，洗液流入接凝管末端，洗液流入接纳纳瓶中，取下接瓶中，取下接纳纳瓶。瓶。 最后封最后封锁电锁电源，源，绝绝不能先封不能先封锁电锁电源，源，否那么吸收液将否那么吸收液将发发生倒吸！生倒吸！ 7/25/2024 二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3. 3. 测定步骤测定步骤 第二步

20、第二步 氨的蒸馏氨的蒸馏本卷须知：本卷须知：凯氏定氮蒸馏过程中，要求整套安装呈密闭形状，蒸馏前凯氏定氮蒸馏过程中，要求整套安装呈密闭形状，蒸馏前应检查定氮仪各导管间的衔接处能否密闭，以免产生应检查定氮仪各导管间的衔接处能否密闭，以免产生泄露；泄露；测定样品前应清洗蒸馏安装，即用蒸馏水空蒸一次或数次；测定样品前应清洗蒸馏安装，即用蒸馏水空蒸一次或数次；蒸馏后立刻清洗蒸馏器。蒸馏终了后，移取热源，夹紧蒸蒸馏后立刻清洗蒸馏器。蒸馏终了后，移取热源，夹紧蒸汽发生器和搜集器间的橡皮管，此时由于搜集器温度汽发生器和搜集器间的橡皮管，此时由于搜集器温度忽然下降，即可将反响室残液吸至搜集器。忽然下降，即可将反

21、响室残液吸至搜集器。蒸馏时，火力稳定，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏中途不得蒸馏时，火力稳定，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏中途不得停火断汽，否那么发生倒吸。加碱要足量反响室液停火断汽，否那么发生倒吸。加碱要足量反响室液体呈深蓝色或褐色并且碱液不能污染冷凝管及接纳体呈深蓝色或褐色并且碱液不能污染冷凝管及接纳瓶。瓶。7/25/2024 二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3. 3. 测定步骤测定步骤 第三步第三步 滴定滴定用微量酸式滴定管，以用微量酸式滴定管，以0.10.1或或0.02mol/L0.02mol/L盐酸盐酸规范溶液进展滴定，规范溶液进展滴定，溶液由蓝绿色变为灰溶液由蓝绿色变

22、为灰红色为终点。红色为终点。空白实验：同时取空白实验：同时取10.0mL10.0mL空白消化稀释液同上空白消化稀释液同上操作，以校正药品不操作，以校正药品不纯所发生的误差。纯所发生的误差。 7/25/2024 二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量4 4结结果果计计算算CPCP样样品中蛋白品中蛋白质质的含量的含量 % % ；V1V1样样品耗品耗费盐费盐酸酸规规范液的体范液的体积积 mLmL ；V2V2空白空白实验实验耗耗费盐费盐酸酸规规范液的体范液的体积积 mLmL ；CC盐盐酸酸规规范溶液范溶液经过标经过标定后的摩定后的摩尔尔浓浓度度 mol/Lmol/L ；0.0140.

23、014每毫升每毫升盐盐酸酸规规范液范液 1 mol/L1 mol/L 相当于氮的相当于氮的克数；克数；mm样质样质量量量量 g g ；6.256.25氮氮换换算算为为蛋白蛋白质质的系数的系数 换换算系数算系数 。 大大家想想家想想6.256.25是如何是如何计计算出来的？算出来的？ 7/25/2024 二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量5. 5. 方法的评价方法的评价凯氏法的优点是适用范围广，可用凯氏法的优点是适用范围广，可用于动植物的各种组织，器官、于动植物的各种组织，器官、各种饲料等成组复杂样品的测各种饲料等成组复杂样品的测定，只需细心操作都能得到较定，只需细心操作都

24、能得到较准确的结果，至今仍被作为规准确的结果，至今仍被作为规范检验方法。但此法灵敏度低，范检验方法。但此法灵敏度低，适用于适用于0.2-1.0mg 0.2-1.0mg 氮，操作比氮，操作比较复杂，所需时间长。较复杂，所需时间长。 用凯氏定氮法经过测总氮量来确定用凯氏定氮法经过测总氮量来确定蛋白质含量，包含了核酸、生蛋白质含量，包含了核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉、以及物碱、含氮类脂、卟啉、以及含氮色素等非蛋白质含氮化合含氮色素等非蛋白质含氮化合物，所以这样的测定结果称为物，所以这样的测定结果称为粗蛋白。粗蛋白。 事件事件7/25/2024 二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量

25、5. 5. 方法的评价方法的评价不同的蛋白质其氨基酸组成及比例方式不同，故各种不同的蛋白质其氨基酸组成及比例方式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同约在不同的蛋白质其含氮量也不同约在14.714.719.519.5，平均为，平均为1616，因此不同蛋白质系数也不一，因此不同蛋白质系数也不一样。样。 oTyr酪氨酸：分子量酪氨酸：分子量181.9，含氮量，含氮量7.69；oAla丙氨酸：分子量丙氨酸：分子量89.1，含氮量，含氮量15.7；oLys赖氨酸：分子量赖氨酸：分子量146.9，含氮量，含氮量9.06。7/25/2024 三、蛋白质含量测定的其它方法直接三、蛋白质含量测定的其它方法直接

26、法法一双一双缩脲法法Biuret法法1原理原理 双双缩脲是两个分子是两个分子脲经180左右加左右加热，放出一，放出一个分子氨后得到的个分子氨后得到的产物。物。NH2-CO-NH2 + NH2-CO-NH2 NH2-CO-NH-CO-NH2 + NH3 在在强碱性溶液中，双碱性溶液中，双缩脲与与CuSO4构成紫色构成紫色络合物，称合物，称为双双缩脲反响。反响。 凡具有两个凡具有两个酰胺基或两个直接胺基或两个直接衔接的接的肽键，这类化合物都有双化合物都有双缩脲反响。蛋白反响。蛋白质及多及多肽含有两个含有两个以上的以上的肽键CONH，与双，与双缩脲的构造的构造类似，也能与似，也能与Cu2+构成紫构成

27、紫红色色络合物，其最大光吸收合物，其最大光吸收在在540nm处。其。其颜色深浅与蛋白色深浅与蛋白质浓度成正比，而度成正比，而与蛋白与蛋白质的分子量及氨基酸的的分子量及氨基酸的组成无关。故可用来成无关。故可用来测定蛋白定蛋白质含量。含量。 7/25/2024 三、蛋白质含量测定的其它方法直接法三、蛋白质含量测定的其它方法直接法一双一双缩脲法法Biuret法法1原理原理 在一定条件下，未知在一定条件下，未知样品的溶液与品的溶液与规范蛋白范蛋白质溶溶液同液同时反响，并于反响，并于540560nm下比色，可以下比色，可以经过规范蛋白范蛋白质的的规范曲范曲线求求出未知的蛋白出未知的蛋白质浓度，度，规范蛋

28、白溶液可以用范蛋白溶液可以用结晶的晶的牛或人血牛或人血洁白蛋白、白蛋白、卵清蛋白或酪蛋白粉末配卵清蛋白或酪蛋白粉末配制。制。7/25/2024 三、蛋白质含量测定的其它方法直接法三、蛋白质含量测定的其它方法直接法一双缩脲法一双缩脲法Biuret法法2方法评价方法评价该法的优点是样品不需消化处置，结果为饲料中该法的优点是样品不需消化处置，结果为饲料中蛋白质的真实含量，操作简单，具有快速、准蛋白质的真实含量，操作简单，具有快速、准确等优点。但二肽含量不能测定想想为什么确等优点。但二肽含量不能测定想想为什么？。？。该法灵敏度低，测定蛋白质的浓度范围适于该法灵敏度低，测定蛋白质的浓度范围适于110mg

29、 /mL。双缩脲法常用于蛋白质的快速测。双缩脲法常用于蛋白质的快速测定，但并不需求非常准确的蛋白质测定。定，但并不需求非常准确的蛋白质测定。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液缓冲液和某些氨基酸等。除和某些氨基酸等。除-CO-NH-有此反响外，有此反响外，-CONH2-，-CH2-，NH2-，-CS-CS-NH2，等，等基团亦有此反响。基团亦有此反响。 7/25/2024 三、蛋白质含量测定的其它方法直接法三、蛋白质含量测定的其它方法直接法二二Folin-酚酚试剂法法(Lowry法法)1原理原理 此法的此法的显色原理与双色原理与双缩脲方法一方法一样

30、，只是参与，只是参与了第二种了第二种试剂，即，即Folin酚酚试剂，以添加，以添加显色量，色量，从而提高了从而提高了检测蛋白蛋白质的灵敏度。的灵敏度。 这两种两种显色反响色反响产生深生深兰色，色，缘由是：在碱性由是：在碱性条件下，蛋白条件下，蛋白质中的中的肽键与与铜结合生成复合物。合生成复合物。Folin酚酚试剂中的磷中的磷钼酸酸盐磷磷钨酸酸盐被蛋白被蛋白质中的酪氨酸或色氨酸残基复原，中的酪氨酸或色氨酸残基复原，产生深生深兰色色钼兰和和钨兰的混合物。在一定的条件下，的混合物。在一定的条件下，兰色深色深度与蛋白的量成正比。度与蛋白的量成正比。 7/25/2024 三、蛋白质含量测定的其它方法直接

31、法三、蛋白质含量测定的其它方法直接法二二Folin-酚酚试剂法法(Lowry法法)2方法方法评价价本法的本法的优点是操作点是操作简便、灵敏度高便、灵敏度高, 定量范定量范围为5100g蛋白蛋白质，较双双缩脲法灵敏法灵敏100倍。倍。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。定。其缺乏之其缺乏之处是此反响受多种要素干是此反响受多种要素干扰。Folin试剂显色反响由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，色反响由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此因此样品中假品中假设含有酚含有酚类、柠檬酸和檬酸和巯基化合基化合物均有干物均有干扰作用。作用。不同蛋白不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同

32、而使因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色色强度稍有不同，度稍有不同，显色的深浅往往随不同的蛋白色的深浅往往随不同的蛋白质而而变化。因此本化。因此本测定法通常只适用于定法通常只适用于测定蛋定蛋白白质的相的相对浓度相度相对于于规范蛋白范蛋白质。Folin酚酚试剂的配制的配制较为困困难如今已可以如今已可以订购。7/25/2024 三、蛋白质含量测定的其它方法直接法三、蛋白质含量测定的其它方法直接法三紫外吸收法三紫外吸收法1原理原理 蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。

33、吸收顶峰在光的性质。吸收顶峰在280nm处，其吸光度即处，其吸光度即光密度值与蛋白质含量成正比。光密度值与蛋白质含量成正比。 此外，蛋白质溶液在此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进展蛋白吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进展蛋白质含量的测定。质含量的测定。7/25/2024 三、蛋白质含量测定的其它方法直接法三、蛋白质含量测定的其它方法直接法三紫外吸收法三紫外吸收法2方法评价方法评价紫外吸收法简便、灵敏、快速，不耗费样品，测紫外吸收法简便、灵敏、快速，

34、不耗费样品，测定后仍能回收运用。低浓度的盐，例如生化制定后仍能回收运用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的备中常用的(NH4)2SO4等和大多数缓冲液不干等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速延续扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速延续检测，由于此时只需测定蛋白质浓度的变化，检测，由于此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。而不需知道其绝对值。此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用规范曲线法测定蛋白质含量时，扰物质多，在用规范曲线法测定蛋白质含量时，对那些与规范蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差对那些与规范蛋白质中

35、酪氨酸和色氨酸含量差别大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用别大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与规范蛋白质氨基酸组成类似的蛋白质。测定与规范蛋白质氨基酸组成类似的蛋白质。7/25/2024 三、蛋白质含量测定的其它方法直接法三、蛋白质含量测定的其它方法直接法三紫外吸收法三紫外吸收法2方法评价方法评价假设样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光假设样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以经过查校正表，再进展计算的方法，加以适当经过查校正表，再进展计算的方法，加以适当的校正。但是由于不同的蛋白质和核酸的紫外的校正

36、。但是由于不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不一样的，虽然经过校正，测定的结果吸收是不一样的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。还是存在一定的误差。此外，进展紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收此外，进展紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收顶峰常因顶峰常因pH的改动而有变化，因此要留意溶液的改动而有变化，因此要留意溶液的的pH值，测定样品时的值，测定样品时的ph要与测定规范曲线要与测定规范曲线的的pH相一致。相一致。因因Lowry反响的显色随时间不断加深，因此各项操反响的显色随时间不断加深，因此各项操作必需准确控制时间。作必需准确控制时间。7/25/2024 三、蛋白质含量测定的其它方法直接法三

37、、蛋白质含量测定的其它方法直接法四考马斯亮蓝染色法四考马斯亮蓝染色法1原理原理 考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250Coomassie brilliant blue G-250测定蛋白质含量属于染料结合测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离形状下在游离形状下呈红色，最大光吸收在呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定

38、。蛋白质与考马斯亮蓝量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在结合在2min左右的时间内到达平衡，完成反响非左右的时间内到达平衡，完成反响非常迅速；其结合物在室温下常迅速；其结合物在室温下1h内坚持稳定。内坚持稳定。 7/25/2024 三、蛋白质含量测定的其它方法直接法三、蛋白质含量测定的其它方法直接法u经研讨以为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸特别是精氨酸和芳香族氨基酸残基相结合。u该法是1976年Bradford建立，因此又叫Bradford法。 PROTEIN+Amax = 595nmBLUEAcidCoomassie G-250Protein - DyeComplexO CH2CH

39、3NHCCH3CH3NCH2SO3-CH3CH2NCH2CH2CH3SO3Na+四考马斯亮蓝染色法四考马斯亮蓝染色法1原理原理7/25/2024 三、蛋白质含量测定的其它方法直接法三、蛋白质含量测定的其它方法直接法试剂配制简单，干扰物质少，反响非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定浓度范围为01 000g/mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。操作简便快捷，完成一个样品的测定，只需求5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只需2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内坚持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因此完全不用像Lowry法那样费时和严厉地

40、控制时间。四考马斯亮蓝染色法四考马斯亮蓝染色法2方法评价方法评价7/25/2024 三、蛋白质含量测定的其它方法直接法三、蛋白质含量测定的其它方法直接法四考四考马斯亮斯亮蓝染色法染色法2方法方法评价价有些阳离子，如有些阳离子，如K+、Na+、Mg2+、(NH4)2SO4、乙醇等物乙醇等物质不干不干扰测定，但大量的去定，但大量的去污剂如如TritonX-100、SDS等等严重干重干扰测定。定。由于各种蛋白由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此量不同，因此bradford法用于不同蛋白法用于不同蛋白质测定定时有有较大的偏向，在制造大的偏向，在制造规范曲范曲线时通常通常选用用球蛋白球蛋白为规范蛋白范蛋白质，以减少，以减少这方面的偏方面的偏向。向。 7/25/2024相关事件相关事件三鹿毒奶粉事件三鹿毒奶粉事件2021美国美国宠物物饲料事件：料事件：“宠物毒粮物毒粮 2007罪魁罪魁祸首：三聚首：三聚氰胺胺C3N6H6 ，“蛋白精蛋白精1.1.纯白色单斜棱晶体，无味纯白色单斜棱晶体，无味 ，微溶于水和热乙醇，微溶于水和热乙醇 。2.2.含氮量含氮量66.666.6。前往前往 7/25/2024