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1、 9. 拮抗细菌对烟草青枯病的温室防病及促生效果拮抗细菌对烟草青枯病的温室防病及促生效果* 王静1 2 , 赵廷昌1* , 孔凡玉2 , 何月秋3 , 张成省2, 刘建华4 , 刘伟成4 （1 中国农业科学院植物保护研究所 植物病虫害生物学国家重点实验室 北京 100094 2 中国农业科学院烟草研究所 青岛 266101 3 云南农业大学植物保护学院 昆明 650201 4 北京市农林科学研究院植物保护环境保护研究所 北京 100089） Wang Jing1,2 , Zhao Ting-chang1 , Kong Fan-yu2, He Yue-qiu3, Zhang Cheng-shen
2、g1 ,Liu Wei-cheng4, Liu Jjian-hua4 (1；The state Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, CAAS, Beijing 100094, China 2 Tobacco Research Institute of CAAS, Qing Dao 266101，China; 3. Plant Protection Collage，Yunnan Agricultural University，Kunming 65
3、0201, China 4 Institude of Plant and Environment Protection,Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences,Beijing 100089,China） 摘要 ： 摘要 ：本实验针对从福建、贵州两省烟草青枯病流行区烟株根围土样筛选得到的对青枯病有较好拮抗作用的细菌菌株，测定了其温室防效和促生作用；结果表明，在室内对青枯病菌抑制作用较强的菌株，并不都对烟草青枯病有较好防治效果；实验获得了控病效果表现较好的3株拮抗菌（AR01、AR02和AR03） ，两次重复防效实验表明三者防效均在
4、50%以上。 促生实验结果表明， 3菌株均能不同程度促进烟株的生长， 其中AR03促生作用最佳。 关键词关键词：烟草青枯病，筛选，防治效果，促生作用 Abstract: Control effect and plant growth-promoting experiment were tested on Some bacteria strains, screened from rhizospheric soil samples from Fujian and Guizhou provinces. The result indicated that not all the strains who
5、 had obvious inhibition activities based on screening experiment on Petri dish had good control effects against tobacco wilt. At the same time, three anti-bacterias(AR01|、AR02 and AR03) were selected as potential biocontrol agents, there control effects were over 50% in two repeat tests. In plant gr
6、owth-promoting experiment, three strains could promote plant growth in some extent. And AR03 was the most effective strain to promote plant growth. Keyword: Ralstonia solanacearum, screening, control effect, promote growth 烟草青枯病是由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum，简称R.S）引起的一种土传病害，该菌寄主范围广，喜高温，加之缺乏抗源，易爆发流行
7、，所以防 治非常困难。对于该病害的防治，通过改进栽培措施、使用抗病品种和杀菌剂可以起到一定的效果，但都有其局限性。 鉴于化学防治对环境的污染和生态平衡的破坏， 因此病害的生物防治越来越被重视。 在土壤中引入拮抗性微生物来防治土传病害已有70多年的研究历史了，很多报道1，2，3都认为生物防治在未来农业中具有重要地位。北京农业大学陈延熙教授研制的增产菌已在全国10多个省推广使用，主要用于防治水稻稻瘟病、小麦纹枯病和油菜菌核病等，田间增产率达10-50。魏春妹、张春明等4研制出番茄青枯病和烟草青枯病的生防制剂“青枯散”，田间试验证明该制剂对番茄青枯病、烟草青枯病有70和80的防治效果，且能增产10，
8、表现具有发芽势高和壮苗的作用。目前，该项目已投入产业化生产前期准备阶段。我国可利用的生防微生物资源很丰富， 但现状是仅利用了其中较少的一部分， 尤其是对植物病害即有拮抗作用又有促进植物生长的微生物研究与开发不足。 种种实例表明，拮抗细菌种类多，繁殖速度快，广泛分布于植物根围，可与植物建立密切的关系， 其中一些细菌还能促进植物生长。 因此， 根围拮抗细菌防治土传病害有很大潜力。我们 2004、2005 年在福建、贵州两省青枯病流行区采集的烟田根际土样中筛选到一批拮抗细菌4，本研究对其进行了温室防病促生效果的测定，结果报道如下。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 供试拮抗细菌菌株及来源 供
9、试细菌：AR01，AR02，AR03，AR04，1-9，1-11，分离自福建、贵州两省青枯病流行区采集的烟草根际土样。测试菌为青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum,以下简称 R.S）菌株， 由广东省农科院植物保护研究所提供， 经 TZC 培养和柯赫氏法则证明为烟草青枯病病原菌。 1.1.2 供试烟草 心叶烟：感病品种，实验室保存。 1.2 根际拮抗细菌温室盆栽控病实验 温室盆栽进行。实验用土为灭菌营养土。 1.2. 1初测 将供试拮抗细菌菌株分批进行盆栽测试。每次试验设空白对照CK1（仅接清水）和发病对照CK2（仅接青枯病菌）；每处理设三次重复，每重复5-6株烟苗。具体实
10、验过程如下： 灭菌土培育烟苗至5-6叶期， 将幼苗取出， 于待测生防菌悬液 （108cfuml） 中浸根30min，移栽至苗钵；对照CK1浸根于清水中。1d后，将预先繁殖的青枯菌R.S配制成1106cfuml的菌悬液，接种方法为灌根，接种量为5ml/株，其他按照温室常规管理。接种病原菌日为起点日，出现病株即开始调查，以后每隔5d调查一次，共调查3次。分别调查发病情况，计算病指和防效。 1.2.2复测 将初测实验中效果较好的4株拮抗菌株进行复测。样本量略扩大，每重复10株，共三次重复。具体实验过程如下： （1） 幼苗浸根： 取5-6片真叶烟苗于盆钵中拔出， 浸根于预先配制好的供试生防菌菌悬液 （
11、浓度为1108cfu/ml）中，30-40min后取出并移栽于装有灭菌土的花盆中。 （2）再次灌菌：缓苗后，每隔5d于根际接种拮抗菌菌悬液，具体方法如下： 用枪头在烟株根际土壤呈正方形钻穴， （深约3cm） ，每株共4个。将菌悬液注入穴中，1ml/穴，另取1ml淋于茎基部，充分保护烟株根际。如上述方法重复接种两次。对照接入等量清水。 （3）接种发病：1d后，将繁殖的R.S配制成5107cfuml的菌悬液，接种方法同上，接种部位相同，接种量共为5ml/株；CK1接等量清水。完成后，将烟株用适量清水保湿，以利发病。 （4）观察记录：见病株后，每日观察记录发病株数。植株可见明显青枯病症状，即为发病株
12、。以接种病原菌日为起点日，共观察 25-30d。分级标准按全国烟草行业烟草病害调查分级标准 Yc/T39-1996 进行。 病情指数和防治效果按烟草病害药效试验方法 Yc/T40-1996计算。 1.3根际拮抗细菌对烟草苗期生长的作用测定 实验采用营养钵种植方式，分别于无菌土和自然土中进行。 1.3.1幼苗浸根 将大田壤土:农家肥:蛭石按照7:2:1比例配制基质，分别将灭菌和自然土（不灭菌）填装于育苗钵中。小心挖出5-6片真叶的烟苗，轻轻抖落附着于根部的土壤，并将其浸泡于预选配制好的R.S菌悬液（浓度约为108cfu/ml）中， 30-40min后取出，分别移栽于装有灭菌土和自然土的苗钵中。每
13、处理12株，三次重复，随机排列，温室保湿培养。 1.3.2 促生结果调查 待烟苗长至 30d 后，随机选取 10 株烟苗，小心将苗整株挖出，洗去根部泥土，测量其株高、整株鲜重、根鲜重等指标。然后 180烘干至恒重，测整株干重及根干重。对各处理的促生效果采用邓肯氏新复极差法进行方差分析。 2 结果与分析 2.1 温室盆栽实验 整个实验过程中 CK1均未发病，实验数据可用。 2.1.1 初测 经不同批次的盆栽实验初测，获得了 4 株控病作用较好的生防菌株(GK12-2-2、GK12-2-1、BT8-26 和 X12),防治效果分别为：60.1%、54.9% 、52.6%和 45%，均能使处理发病率
14、明显低于 CK2 组。 2.1.2 复测 将初测结果选出 4 个菌株（将 GK12-2-1、GK12-2-2、BT8-26 和 X12 菌株重新编号，分别命名为 AR01、AR02、AR03 和 AR04）进行重复测试，同时方法有所改进，目的是让拮抗菌株能够充分保护烟株根际。由于实验时间近秋季，黑夜和白昼温差大，温度较不利于发病，测试烟株发病缓慢； 其中 AR01、 AR02 和 AR03 仍然表现稳定良好的防病效果， 分别为 99.4%、99.4%和 99.1%（见表.1、图.1） ，且能有效的推迟发病时间。 另外，由于复测实验的时间的温度较初测低，发病缓慢，可能是造成两次测试的防效差别大的
15、主要原因。 表 1 不同菌株对烟草青枯病的防治效果 Table 1 Control efficacy of different strains to Ralstonia.solanacearum 5d 17d 29d 菌 株 Strains 接种后发 病时间(d) Time of dieased appearance after inoculation 病指 Disease index 防效 （%） Control effect 病指 Disease index 防效 （%） Control effect 病指 Disease index 防效 （%） Control effect AR01
16、11 0 100 0.01 99.9a 0.02 99.4a AR02 10 0 100 0.01 99.9a 0.02 99.4a AR03 9 0 100 0.01 99.9a 0.03 99.1a AR04 7 0 100 21.6 28.0b 22.8 33.3b CK1 - - - - - - - CK2 5 0.25 - 30.0 - 34.2 - 注：由于实验时间温度偏低，温差大，发病缓慢，调查时间间隔长。 图 1 AR01、AR02 和 AR03 对烟草青枯病的温室防效测定 左为 AR01 处理 中间为 AR02 处理 右为 AR03 处理 Fig. 1 Control eff
17、icacy of strains AR01、AR02 and AR03 in the green house 我们同时对这三株具有生防潜力的菌株于温室进行了先接种后保护的防效试验， 即先接种病原菌后再接种拮抗菌，效果不理想，处理与对照发病程度相当，由此得出一定要使生防菌先占领根部有利的生态位点迅速定殖或结合抑菌作用来降低青枯病菌的群体数量， 从而延缓发病时间，减轻青枯病的发病程度。 另外，实验还对初测中表现负防效的菌株 1-9、1-11 进行重复测定，结果显示各处理仍然较对照 CK2发病严重, 二个处理的发病率比 CK2高 20%以上。 2.3不同拮抗菌株对烟草苗期生长的影响 促生实验结果表明
18、，接种生防菌于灭菌土种植的烟草时，三菌株都能促进烟 草生长，整株鲜重和干重增长显著，且叶色浓绿，叶片肥厚且大。经AR01处理后的烟苗其整株鲜重和干重比对照分别增长24.3%和32.6%，而根干重增长89.0%；AR02促生作用也较好，整株鲜重和干重比对照增加36.6%和52.9%，根干重增加67.1%， 其中，AR03处理后的整株干重和根干重比对照分别增长121.8%和176.7%（详见表2、图2） ，与对照差异显著；促生作用最佳。 表2 AR01、AR02和AR03菌株对灭菌土中烟草的促生作用测定结果* Table 2 Tobacco promoting growth of strains
19、AR01、AR02 and AR03 in sterilized soil 处理 平 均 增长率 平 均 增长率 整 株 增长率 根干重增长率 （%） Treatment 株 高 （cm） Average height （%） Increased rate 鲜 重 (g) Average fresh weight （%） increasedrate 干 重 (g) Dry weight（%） Increasedrate (g) Dry weight of rootincreased rate AR01 8.6b 8.86 9.98c 24.3 0.634bc32.6 0.138b89.0 AR
20、02 9.05a 14.6 10.97b 36.6 0.731b52.9 0.122bc67.1 AR03 8.48b 7.34 11.85a 47.6 1.060a121.8 0.202a176.7 CK 7.9c - 8.03d - 0.478d- 0.073d- *同栏中不同字母表示有显著差异（新复极差测验P0.05） ；下同。 图2 AR01、AR02和AR03对灭菌土中烟草的促生作用测定结果 图示从左到右依次为AR01、AR02和AR03处理 Fig. 2 Tobacco-promoting growth of AR01、AR02 and AR03 in un-sterilized
21、soil 而对于非灭菌土中的烟草， 用生防菌处理后其长势不一， AR01和AR02处理后的整株鲜重和平均株高均比对照增高，增长率分别为11.6%和14.2%、4.84%和8.64%（详见表3） ，差异显著；而根干重和整株干重比对照低，分别低5.5%和22.4%、3.16%和3.03%；影响了烟草的生长；而AR03仍表现良好的促生作用，测定的各指标均比对照高，平均株高、整株鲜重、整株干重和根干重的增长率分别是24.7%、28.4%、17.2%和14.4%（详见表3、图3）,与对照差异显著。综合以上试验结果，AR03的促生作用最好。 表3 AR01、AR02和AR03菌株对非灭菌土中烟草的促生作用
22、测定结果 Table 3 Tobacco-promoting growth of strains AR01、AR02 and AR03 in un-sterilized soil 处理 Treatment 平 均 株 高 （cm） Average height 增长率 （%） Increased rate 平 均 鲜 重 (g) Average fresh weight 增长率 （%） Increased rate 整 株 干 重 (g) Dry weight增长率 （%） Increased rate 根干重 (g) Dry weight of root增长率 （%） Increased r
23、ate AR01 9.04b 11.6 10.85b 14.2 0.653bc-5.5 0.097b-22.4 AR02 8.80c 8.64 9.96c 4.84 0.532c-3.03 0.121ab-3.16 AR03 10.10a 24.7 12.20a 28.4 0.810a17.2 0.143a14.4 CK 8.10c - 9.50c - 0.691b- 0.125ab- 图3 AR03对非灭菌土中烟草的促生作用测定 Fig. 3 Tobacco-promoting growth of AR03 in un-sterilized soils 3 结论与讨论 利用微生物之间的拮抗作
24、用防治植物病害国内外已有较多研究5， 通过温室防效和促生试验结果表明， 烟草根围存在着大量抑制青枯病病菌的生防细菌， 不但对烟草青枯病有着较好的防治效果，且能在一定程度上促进烟草植株的生长。 3.1 平板抑菌和盆栽试验相结合筛选生防菌 David7认为离体条件下细菌抑制病原菌的能力与其在活体上抑制此病原菌所致病害的能力不相关， 甚至在平板上能产生很大抑菌圈的菌株于活体实验时却无生防效果， 有的甚至加重病情，即在室内对青枯病菌抑制作用较强的菌株，并不都对烟草青枯病有较好防效。我们在实验中同样筛选到这样的菌株， 如 1-9 和 1-11； 在室内对青枯病菌抑制作用较强 （抑菌带宽为 5.5mm 和
25、 6mm） ，活体实验时烟株发病率却均比对照高 20%以上。另一方面，在平板上产生抑菌圈较小的拮抗菌株重新引入根围后，防效显著，与我们筛选到的 AR01、AR02 和AR03 三株拮抗菌对烟草青枯病防效实验结果相符，这可能与筛选的生防菌株在根际的定殖力有密切关系。郭坚华8通过抑菌圈-定殖力双重测定来筛选生防细菌，对植物的青枯病进行生物防治，取得了一定的成功。 筛选高效的生防菌是开展生物防治基础的工作，利用传统的室内平板扩散法筛选拮抗菌，虽然方便快捷且直观，但在筛选过程中必定会丢失一些具有良好生防潜力的菌株，同时也存在筛选到的生防菌株并不具有生防效果的风险。 所以要多种途径结合筛选， 且筛选条件
26、接近自然环境发病条件，这样才能得到田间适应性强的优良菌株。 3.2 防病和促生相结合筛选生防菌 在植物病害生防中，将防病作用与促生作用相结合，两者可以相互促进，可能起到更理想的效果。现在人们研究的根际细菌多指在生防中具拮抗作用或促生作用的有益根际细菌（PGPR）9。PGPR除了能够提供营养之外，还能诱导植株抗病性和分泌生长素刺激植物生长等作用，许多研究已经证明根围有益细菌能够直接或间接的促进植物生长10，11。 从本研究的促生作用测定的结果可以看出， 同样用生防菌处理的烟株在灭菌土和非灭菌土中的长势有明显差异， 即在灭菌土条件下测定的各项指标的增长率高于非灭菌土条件， 可能是因为灭菌土中微生物
27、种群单一， 接种后， 生防菌能迅速占领有利生态位点并适应根围微生态环境，有效利用根系营养和根分泌物，得到大量繁殖进而发挥其有益作用。AR01和AR02处理后在自然土中栽植的烟草， 整株干重和根干重均低于对照， 即不能促进烟草植株的干物质积累；另外，可能是菌株施入非灭菌土中，其更加复杂的根围微生态环境以及各种抑制因素在一定程度上限制了生防菌的繁衍， 没有成为优势种， 从而未能充分发挥其有益作用。 AR03菌株在非灭菌土条件下同样有明显的促生作用，是该菌株的优良特性。 本实验只对根围细菌对烟草生长的影响做了一些初步的测定， 对于这些根围细菌是否可以分泌植物激素或诱导寄主产生植物激素等相关促生作用机
28、制以及促生与抗病存在着何种关系，有待进一步研究。 参考文献 参考文献 1. Cook, K.J. and Baker K.F., The nature and practice of biological control of plant pathogens. APS press USA. , 1984 2. Chet I, Innovative Approaches to plant Disease control.1987 New York:Wiley,372pp 3. Jatala P., Biological control of plant-parasitic nematodes,
29、Ann. Rev. Phytopathol, 198624:453-479 4. 王静 赵廷昌 孔凡玉等. 烟草青枯病拮抗细菌的初步筛选，2005， 农业生物灾害预防与控制成卓敏主编，中国农业科学技术出版社，p936-937。 5. 魏春妹， 张春明， 陶树玉等 番茄青枯病生防制剂的研制与应用J. 上海农业学报， 2000， 16 （增刊） ：6972 6. John M. Whipps. Microbial interactions and biocontol in the rhizosphereJ. Journal of Experimental Botany, 2003, (56): 4
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