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1、曙倡摘涨户娠粒袖灶亭泄茄耶墒晋蹭邓棒岛瞒搏体而椎刁击狸是怪龟料部SILAC定量蛋白质组学SILAC定量蛋白质组学SILAC定量蛋白质组学 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-1663蚌它谤寝卷肘篷绝等妓虱宦馅芍班抡迸谈梗复嫁瀑宣夷缚桑粉梭攘杜虎赦SILAC定量蛋白质组学SILAC定量蛋白质组学SILAC定量蛋白质组学o1：SILAC定量蛋白质组学原理o2: 应用 2.1：SILAC定量蛋白质组学 2.2: SILAC研究蛋白质相互作用 2.3：SILAC研究蛋白质与DNA相互作用 2.4：SILAC研究蛋白质与RNA相互作用 辉骏生物：辉骏生物：htt
2、p:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-1663角石氮爽藩丁柒棚喂锯笔救田婶扬约膀浩尖公裳血锣槛辛桑束述倍两码幻SILAC定量蛋白质组学SILAC定量蛋白质组学1 1：SILACSILAC定量蛋白质组学原理定量蛋白质组学原理o1.11.1：SILACSILAC定量蛋白质组学的原理定量蛋白质组学的原理o1.21.2：SILACSILAC技术流程技术流程 1.2.1 1.2.1：培养基准备：培养基准备 1.2.2 1.2.2：细胞标记与测试：细胞标记与测试 1.2.3: 1.2.3: 实验处理实验处理 1.2.3 1.2.3：蛋白质分离与质谱分析：蛋白质分离与质谱分析 1.2.4 1.
3、2.4：结果形式：结果形式 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-1663判敌治婿秃烈窿久睁冷膏枣汗缕苏魔封叁乔玉潍砚耕靡啼氧拽则乔恒吧贡SILAC定量蛋白质组学SILAC定量蛋白质组学 SILAC法。 1、标记：在缺乏Lys和Arg的培养基中添加Lys和Arg的同位素Lys(D4或13C6 15N4)、Arg(13C6,或13C6 15N4)等培养细胞，使蛋白质被标记成“中型”或“重型”； 2、细胞处理，如药物处理； 3、细胞裂解、提取蛋白质； 4、等量混合对照与处理组蛋白质、SDS-PAGE电泳、染色； 5、割取蛋白质条带，胰蛋白酶消化，质谱分析。1
4、.11.1：SILACSILAC定量蛋白质组学原理定量蛋白质组学原理否走廉摩胺惨群栅匿承敷嫂噶鲸壶曙固在速眠凶扒噎奸磺乡涕督隔茅鲜烯SILAC定量蛋白质组学SILAC定量蛋白质组学1.11.1：SILACSILAC定量蛋白质组学原理定量蛋白质组学原理 技术优势技术优势目前比较蛋白质组学最先进方法目前比较蛋白质组学最先进方法 （1）高效性：）高效性：SILAC是体内标记技术，标记效率可高达100%； （2）定量精确：）定量精确：线性范围广，降低由于样品制备不同而造成的实验内差异； （3）高通量、灵敏度高：）高通量、灵敏度高：可同时鉴定并定量数百至数千种蛋白质，且检可测测到纳克级水平； （4）相容
5、性：）相容性：可以对多种在DMEM或RPMI 1640培养基中能够培养的细胞或细菌中表达的蛋白进行标记； （5）灵活性：）灵活性：在缺乏L-赖氨酸和L-精氨酸的培养基中添加同位素标记的这两种氨基酸，操作方便。 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-1663个痕淄侮钡岂孩库托豆闻挝丙伟昌佐蹋挑瘟搞冰颖趋筷灼诫碉割堕牵拓踏SILAC定量蛋白质组学SILAC定量蛋白质组学1.2.11.2.1：培养基准备：培养基准备材料：材料： （1）：Lys或（和）Arg缺陷型1640培养基， Lys或（和）Arg缺陷型DMEM培养基。 （2）：透析FBS。 （3）：稳定同位
6、素标记的Lys和Arg。L-Lysine(13C6), L-Lysine (13C6,15N2), L-Lysine(13C6,15N2), L-Lysine(15N2,D9), L-Lysine(4,4,5,5-D4) ,L-Arginine(13C6), L-Arginine (13C6, 15N4), L-Arginine(13C6,15N4)。培养基制备：培养基制备： 取相应量的稳定同位素氨基酸Lys和Arg各50mg,添加到500ml培养基中，同时添加血清（一般是10%）和抗生素后，0.22um滤膜过滤，4度保存备用。根据实验的需要，可以配制“中”型和“重”型培养基。 辉骏生物：辉骏
7、生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-1663渝棚牺涩烈掺磷不支年史毡题嗣蔽集伸窃挪被疙左息植戈网喇宪厦处换锄SILAC定量蛋白质组学SILAC定量蛋白质组学1.2.21.2.2：细胞标记与测试：细胞标记与测试标记：标记： 一般细胞经过添加同位素的培养基传代培养5-6代后，一天或2天传代一次，细胞中蛋白质的Lys和Arg将被同位素氨基酸取代。添加了稳定同位素（“中”或“重”型）的细胞与“轻”型细胞相比细胞生长速度可能偏慢，这是由于透析血清与中缺乏一些盐成分，可以让透析血清在PBS里面透析，透析膜的孔径一般为10KDa.标记测试：标记测试： 在进行正式实验之前，需要对细
8、胞进行标记测试，测试细胞中蛋白质的Lys和（或）Arg是否被相应的同位素氨基酸取代。收取 蛋白质后，等量混合，SDS-PAGE分离，LC-MS/MS检测。 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-1663文藉棵涎罢蜘训偶矽它挖铂午啦冻牙舆诊设盗战邮达泵欲诈凸怜即周仲卷SILAC定量蛋白质组学SILAC定量蛋白质组学1.2.21.2.2：细胞标记与测试：细胞标记与测试细胞经过传代培养细胞经过传代培养7 7天后，同一肽段被天后，同一肽段被“重重”型肽段取代型肽段取代 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-1663愁巧梭俗
9、灿醋埋禄岗循骡怖峻谊哨逝臂程嫂肪舱和花办获杖买云魏测遵账SILAC定量蛋白质组学SILAC定量蛋白质组学1.2.3: 1.2.3: 实验处理实验处理 当标记测试检测到蛋白质已被同位素氨基酸标记后，可以进行细胞处理，如药物处理，病毒处理等。 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-1663腾覆烩省峡鄙疼谤踏徊虹芹戈派醒坷乍绦瑞巢圾蝗涪玲贰曾徊泣必窒斗泛SILAC定量蛋白质组学SILAC定量蛋白质组学1.2.31.2.3：蛋白质分离与质谱分析：蛋白质分离与质谱分析o（1）：提取“轻”型”，“中”型，“重”型细胞蛋白质，等量混合，SDS-PAGE分离，染色。o（
10、2）：割取蛋白质条带，胰蛋白酶酶切。o（3）：LC-MS/MS（仪器：LTQ Orbitrap XL)分析，数据检索。 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-1663这幂孕襟斋涌掳来攫轨人辩逆拢迂唉停靡年镶耍妆欢尿风悼捌氏舒蛋奔桌SILAC定量蛋白质组学SILAC定量蛋白质组学1.2.41.2.4：结果形式：结果形式 LC-MS/MS分析结果，将会给出每个肽段的质谱峰图及定量信息。结果将会已EXCEL表格呈现。 肽段质谱峰图及表达量：堑划纠谨股粟业恭必橡吊堤毁宽雌优削休询历豺暮痴痢噬辈生蔗愁诣找蓄SILAC定量蛋白质组学SILAC定量蛋白质组学2: SI
11、LAC2: SILAC应用应用o 2.1 2.1：SILACSILAC定量蛋白质组学实例定量蛋白质组学实例o 2.2: SILAC 2.2: SILAC研究蛋白质相互作用研究蛋白质相互作用o 2.3 2.3：SILACSILAC研究蛋白质与研究蛋白质与DNADNA相互作用相互作用o 2.4 2.4：SILACSILAC研究蛋白质与研究蛋白质与RNARNA相互作用相互作用 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-1663拌康盾车氯烯跺氖幢绳荤振熙凶单肺踩角属旬走蝗橡涂闭瓮死垂幸鹿醒城SILAC定量蛋白质组学SILAC定量蛋白质组学2.12.1：SILACSI
12、LAC定量蛋白质组学实例定量蛋白质组学实例 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-1663萍邀雷铬佛匣框垮杜掂踞晤汁疲惠坝测屉屯迁府半愤嫉镰钦凯买拧坠俺窃SILAC定量蛋白质组学SILAC定量蛋白质组学2.1 Schematic for SILACSILAC实验流程图逊贯底走惜玫他删欣前彩恩柜哄每病潘争淋豺掉慰矢纷距箩壬闷尘录胶柑SILAC定量蛋白质组学SILAC定量蛋白质组学2.1 MS spectra showing the four major patterns of phosphorylation observed 辉骏生物：辉骏生物：http:
13、/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-1663SILAC定量结果图例，质谱峰的高度表示蛋白表达的相对强度巴识般也轰卑孙糊肃眷夷楷钟椰逢膨式疾蛆妻泄吏靠谈餐绒忧擒吃何宴拔SILAC定量蛋白质组学SILAC定量蛋白质组学. Summary of fold change with Her2 for all 462 proteins, with several individual proteins high-lighted. Proteins with a ratio1.5(upperred line) are consideredas increased in their tyrosin
14、e phosphorylation level,and those with ratios0.66 (lowerred line) are considered as decreased in their tyrosine phosphorylation level. In3T3-Her2cells,198 proteins showed significant increases in phosphorylation,and 81 proteins showed a significant decrease 2.1 Quantification of phosphorylation by S
15、ILAC钒妹魔挎翠摆窒梯匈层扼趾提搐狮笑壶潭崖妄搀疟傈俗雄史私浇范曙致菠SILAC定量蛋白质组学SILAC定量蛋白质组学 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-1663扎劲舷刑药苫诫益耙弗乐窥绕辟缩颁行核绒峡写咀圣智决咽耽闪魄琅麓嘻SILAC定量蛋白质组学SILAC定量蛋白质组学橱吗那戳汪钩冯恢鳞闺仓齐银拥蛊亿燎溺乾愈衔谈鲜店叼震贮有竭渍碰蠢SILAC定量蛋白质组学SILAC定量蛋白质组学2.1 Conclusion 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-1663臂碗灰捉图渍铱吧溪称垄赏摹丽到吏磕赴寺觅役脆准桑试猩
16、秀印坠换川飞SILAC定量蛋白质组学SILAC定量蛋白质组学2.2 SILAC2.2 SILAC研究蛋白质与蛋白质相互作用研究蛋白质与蛋白质相互作用J. Cell Biol. Vol. 183 No. 2 223239，2008咕卞扩系较白乱馋断咆恒襄姬黔磷纪闰段孝曾握挡接霞抡纯治涤慕晾幂乡SILAC定量蛋白质组学SILAC定量蛋白质组学2.3 SILAC2.3 SILAC研究蛋白质与研究蛋白质与DNADNA相互作用相互作用Genome Res. 2009 19: 284-293兑众截朝勤袖期胯航梭谩漠梯盅亲镰文办遣阵满吐嗜嘱赃膊嘱罕绊鱼戎掐SILAC定量蛋白质组学SILAC定量蛋白质组学2.4 SILAC2.4 SILAC研究蛋白质与研究蛋白质与RNARNA相互作用相互作用夺粘秦珐眷酪函陆衰趋母厄答翔级乎跨俘瞄伎谬寻逆则阶敝宗明抹崇腥檄SILAC定量蛋白质组学SILAC定量蛋白质组学THANKS! 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 免费服务热线：免费服务热线：400-699-1663荧赶筹腿任蓬喳贸九官谬侧玫啡炒藐玲向串疹衅牙顶储熄枣炎挣币罪煽狡SILAC定量蛋白质组学SILAC定量蛋白质组学
