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1、实验十二实验十二 水中水中细菌细菌总数与大肠菌群的测定总数与大肠菌群的测定一一 实验目的实验目的n1、掌握细菌总数的测定方法、掌握细菌总数的测定方法n2、掌握大肠杆菌的鉴定和计数、掌握大肠杆菌的鉴定和计数方法方法n3、巩固无菌操作技术、巩固无菌操作技术 1.1.细菌总数测定细菌总数测定原理原理 用营养琼脂倾注平板，测定被检物在单用营养琼脂倾注平板，测定被检物在单位重量或体积（位重量或体积（g g或或mlml）内所含有的活细菌）内所含有的活细菌数量，以判明被检物被细菌污染的程度。数量，以判明被检物被细菌污染的程度。二二 实验原理实验原理2 大肠杆菌鉴定原理大肠杆菌鉴定原理n大肠菌群：一群能发酵乳
2、糖、产酸产气、需大肠菌群：一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否染肠道致病菌的可能。有否染肠道致病菌的可能。n 样品中大肠菌群系以样品中大肠菌群系以100mL100mL（g g）检样内大肠）检样内大肠菌群最大可能数（菌群最大可能数（MPN)MPN)表示。表示。 细细 菌菌 学学 检检 验验 程程 序序 样品样品 细菌总数细菌总数 大肠菌群大肠菌群 水样稀释或不稀释水样稀释或不
3、稀释 水样稀释或不稀释水样稀释或不稀释 第一步第一步- 初步发酵试验初步发酵试验 倾注平板培养倾注平板培养 （乳糖发酵）（乳糖发酵） 37 24小时小时 37 24小时小时 菌落计数菌落计数 第二步第二步- 平板分离培养平板分离培养（取平均数报告）（取平均数报告） （转种鉴别培养基）（转种鉴别培养基） 37 24小时小时 革兰染色镜检革兰染色镜检 第三步第三步- 乳糖复发酵试验乳糖复发酵试验 报告结果报告结果 三、实验器材三、实验器材 1 1、恒温培养箱（、恒温培养箱（361 361 ）、恒温水浴锅）、恒温水浴锅（461 461 ） 、天平、灭菌培养皿、试、天平、灭菌培养皿、试管。管。 2 2
4、、培养基及试剂：、培养基及试剂：n 乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂平板乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂平板（EMBEMB）、牛肉膏蛋白胨培养基）、牛肉膏蛋白胨培养基1.以以1ml无菌吸管吸取样品无菌吸管吸取样品1ml加入加入9ml 无菌生理盐水，无菌生理盐水， 使样品（自来水、饮用水、饮料等）成使样品（自来水、饮用水、饮料等）成 1：10 、1：100 、1：1000 等几个稀释度；样品（下水道水、等几个稀释度；样品（下水道水、牛奶）稀释度要适当高。牛奶）稀释度要适当高。 2.分别在无菌平皿内加入分别在无菌平皿内加入1：100、1：10、原样的样、原样的样品各品各1ml，每个稀释度均做一个平板。每个
5、稀释度均做一个平板。注意注意 ：先加浓度低的样品，再加浓度高的样品：先加浓度低的样品，再加浓度高的样品3.将冷却将冷却45的营养琼脂倾注于平皿中，摇匀，置的营养琼脂倾注于平皿中，摇匀，置37 培养培养24小时。小时。 四、实验步骤四、实验步骤-细菌总数测定细菌总数测定平皿分平皿分4部分点数（见图）部分点数（见图）求同一求同一稀释度的平均菌落数稀释度的平均菌落数 如：如： A1数数 + A2数数 + A3 3 4、菌落计数：、菌落计数： 1）平板菌落数的选择）平板菌落数的选择 2）稀释度的选择）稀释度的选择 3）菌落数的报告）菌落数的报告 菌落数菌落数100 按实有数报告按实有数报告 菌落数菌落
6、数100 采用两位有效数，后面采用两位有效数，后面数值数值 四舍五入（也可用四舍五入（也可用10的指数表示）的指数表示） 无法计数无法计数 无法计数报告无法计数报告 （ 注明水样的稀释倍注明水样的稀释倍数）数） 5. 菌落计数的报告：菌落计数的报告： 稀释度的选择：稀释度的选择： 1. 1. 应选择平均菌落数在应选择平均菌落数在30-30030-300之间的稀释度，乘之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之以稀释倍数报告之 2 2. . 若有两个稀释度其生长之菌落数均在若有两个稀释度其生长之菌落数均在30-30030-300，则应视二者之比如何来决定，若其比值小于则应视二者之比如何来决定，若其比值小于
7、2 2，应报，应报告平均数。告平均数。 若其比值大于若其比值大于2 2则报告其中较小的数字。则报告其中较小的数字。 3 3. . 若所有平均菌落数均大于若所有平均菌落数均大于300300，则应按稀释度最，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 4. 4. 若所有稀释度的平均菌落数均小于若所有稀释度的平均菌落数均小于3030，则应按，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 5 5. . 若所有稀释度的平均菌落数均不在若所有稀释度的平均菌落数均不在30-30030-300之间，之间，其中一其中一 部分大
8、于部分大于300300或小于或小于3030时，则以最接近时，则以最接近3030或或300300的平均菌的平均菌 落数乘以稀释倍数报告之。落数乘以稀释倍数报告之。 6 6. . 若所有稀释度的菌落数均不可计数，则以最高若所有稀释度的菌落数均不可计数，则以最高稀释倍数无法计数稀释倍数无法计数 报告之。报告之。稀释度选择及细菌总数报告方法稀释度选择及细菌总数报告方法 稀释液及菌落数稀释液及菌落数 10-1 10-2 10-3 1 1,365 164 20 16，400 16，000或或1.6104 2 2,760 295 46 1.6 37，750 38，000或或3.8 104 3 2,890 2
9、71 60 2.2 27，100 27，000或或2.7104 4 不可计不可计 4，650 513 513，000 510，000或或5.1 105 5 27 11 5 270 270或或2.7 102 6 不可计不可计 305 12 30，500 31，000或或3.1 104 7 不可计不可计 不可计不可计 不可计不可计 10-3无法计数无法计数 稀释稀释 倍数倍数 平均平均 菌落菌落数数例例 次次两稀释度两稀释度 菌落数之比菌落数之比细菌总数细菌总数(个个/g或个或个/ml) 报告方式报告方式(个个/g或个或个/ml)菌落计数的报告菌落计数的报告: 菌落数菌落数 报告结果报告结果1、
10、30300 之间之间 平均菌落数平均菌落数 X 稀释稀释倍数倍数 2、 求比值求比值 2 取较小稀取较小稀释倍数释倍数 在在30300之间之间 300 最高稀释度平均菌落数最高稀释度平均菌落数 X 最高稀释最高稀释倍数倍数 4、 300 30 6、 无法计数无法计数 报告无法计数报告无法计数 取最接近的取最接近的 X 稀释倍数稀释倍数 (若有两个稀释度若有两个稀释度)五、大肠菌群的检测五、大肠菌群的检测 检品检品 胆盐乳糖发酵管胆盐乳糖发酵管 伊红美兰平板伊红美兰平板 大肠杆菌菌落纯培养大肠杆菌菌落纯培养 乳糖复发酵管（乳糖复发酵管（-） 乳糖复发酵管（乳糖复发酵管（） n1、检样稀释、检样稀
11、释n以无菌操作将检样以无菌操作将检样1mL1mL放于含有放于含有9mL9mL灭菌生理盐水或灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内，经充分振摇或研磨做成其他稀释液的灭菌玻璃瓶内，经充分振摇或研磨做成1 1：1010的均匀稀释液。的均匀稀释液。n用用1ml1ml灭菌吸管吸取灭菌吸管吸取1 1：1010稀释液稀释液1mL1mL，注入含有，注入含有9mL9mL生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，做生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，做成成1 1：100100的稀释液。的稀释液。n另取另取1ml1ml灭菌吸管，按上述操作依次作灭菌吸管，按上述操作依次作1010倍递增稀倍递增稀释液。释液。
12、n根据食品卫生要求或对检验样品污染情况估计，选根据食品卫生要求或对检验样品污染情况估计，选择三个稀释度，每个稀释度，接种择三个稀释度，每个稀释度，接种3 3管，每支试管接管，每支试管接种种1ml1ml。n2. 乳糖发酵试验乳糖发酵试验n 将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管；以上者，用双料乳糖胆盐发酵管；1mL1mL及及1mL1mL以以下者，用单料乳糖发酵管。每一个稀释度接种下者，用单料乳糖发酵管。每一个稀释度接种3 3管，管，置置363611温箱内，培养温箱内，培养24h2h24h2h，如所有乳糖，如所有
13、乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产生者，则按下列程续进行。如有产生者，则按下列程续进行。3.3.分离培养分离培养n 将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置363611温箱内，培养温箱内，培养18h24h18h24h，然后取出，观察菌落，然后取出，观察菌落形态并做革兰氏染色和证实试验。形态并做革兰氏染色和证实试验。4.4.证实试验证实试验n在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1212个进行革兰个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置氏染色，同时接种
14、乳糖发酵管，置363611的温箱内培的温箱内培养养24h2h24h2h，观察产气情况。，观察产气情况。n凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌，即报告凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌，即报告为大肠菌群阳性。为大肠菌群阳性。5.5.报告报告n根据证实为大肠菌群阳性的管数，查根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPNMPN检索表，报告每检索表，报告每100mL100mL（g g）食品中大肠菌群的）食品中大肠菌群的MPNMPN 值。表1 大肠菌群最可能数（MPN）检索表 阳性管数 MPN 100mL(g） 95%可信限 1mL(g)3 0.1mL(g) 3 0.01mL(g) 3 下限 上限
15、0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 2 3 30 30 60 90 5 90 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 2 3 30 60 90 120 5 130 0 0 0 0 2 2 2 2 0 1 2 3 60 90 120 160 0 0 0 0 3 3 3 3 0 1 2 3 90 130 160 190 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 2 3 40 70 110 150 5 10 200 210 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 2 3 70 110 150 190 10 30 230 360 1 1 1 1 2 2 2 2 0 1 2 3 110 150 200
16、 240 30 360 1 1 1 1 3 3 3 3 0 1 2 3 160 200 240 290 2 2 2 200000123901402002601030360370 2 2 2 2111101231502002703403070440890 2 2 2 22222012321028035042040100470150022223333012329036044053033330000012323039064095040701501200130038003333111101234307501200160070140300210023003800333322220123930150021
17、0029001503003503800440047003333333301232400460011000240003607101500130002400048000大肠菌群测定大肠菌群测定 挑选菌落特征：黑紫色、有光泽或无光泽菌落；挑选菌落特征：黑紫色、有光泽或无光泽菌落； 红色、粉红色菌落。红色、粉红色菌落。抑制剂：胆盐、煌绿、十二烷基硫酸钠。抑制剂：胆盐、煌绿、十二烷基硫酸钠。 产酸判断：紫色培养液变成黄色产酸判断：紫色培养液变成黄色产气判断：发酵导管内有小气泡，如轻轻打动试产气判断：发酵导管内有小气泡，如轻轻打动试管有气泡沿管壁上浮，应考虑可能有气体产生，管有气泡沿管壁上浮，应考虑可能有
18、气体产生，需进一步试验。需进一步试验。 饮用饮用水、乳、冷饮食品卫生标准的细菌指标水、乳、冷饮食品卫生标准的细菌指标 指指 标标 细菌总数细菌总数 大肠菌群大肠菌群 饮用饮用水水 100个个/ml 3个个/L 消毒牛奶消毒牛奶 30，000个个/ml 40个个/100ml 瓶装瓶装汽水、果味水汽水、果味水 及果汁类饮料及果汁类饮料 品品 种种 100个个/ml 5个个/100ml五、实验报告五、实验报告（一）、列表记录并计算实验结果（一）、列表记录并计算实验结果（二）、思考题（二）、思考题1 1、怎样判断分离到的微生物是大肠杆菌、怎样判断分离到的微生物是大肠杆菌？2 2、接种了微生物的培养皿为什么要倒置、接种了微生物的培养皿为什么要倒置培养？培养？实验准备（实验准备（2个样品）个样品）n培养皿：培养皿：1010套套/ /组组n无菌水：无菌水：1010支（支（9 9毫升毫升/ /支）支）n乳糖胆盐发酵培养基：乳糖胆盐发酵培养基：1818支试管、支试管、5ml/5ml/支支 100ml100mln伊红美蓝琼脂培养基（伊红美蓝琼脂培养基（EMBEMB）:100ml:100ml，4 4个平板个平板n牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基:150ml:150ml，6 6个平板个平板
