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1、真核表达系统真核表达系统酵母酵母丝状真菌丝状真菌昆虫昆虫哺乳动物细胞哺乳动物细胞转基因动物转基因动物植物反应器植物反应器酵母表达系统的优缺点酵母表达系统的优缺点遗传背景清楚（基因组是大肠杆菌的遗传背景清楚（基因组是大肠杆菌的3.5倍）倍）增殖快（增殖快（90min/代），培养容易，产量较代），培养容易，产量较高高易于研究突变与基因功能，如构建酵母人工易于研究突变与基因功能，如构建酵母人工染色体等染色体等可以进行转录和翻译后修饰加工可以进行转录和翻译后修饰加工提纯工艺复杂，成本高，制品纯度达不到要提纯工艺复杂，成本高，制品纯度达不到要求，制品免疫原性差，接种剂量大求，制品免疫原性差，接种剂量大酵
2、母载体的基本结构酵母载体的基本结构DNA复制起始区：复制起始区：2质粒和自主复制序列质粒和自主复制序列选择标记：营养缺陷型和显性选择（抗药）选择标记：营养缺陷型和显性选择（抗药）整合介导区：同源重组，决定整合位置和拷整合介导区：同源重组，决定整合位置和拷贝数贝数有丝分裂稳定区：帮助载体平均分配有丝分裂稳定区：帮助载体平均分配表达盒表达盒转录启动子转录启动子转录启动子转录启动子终止子终止子终止子终止子分泌信号序列分泌信号序列分泌信号序列分泌信号序列酵母表达系统中载体的种类酵母表达系统中载体的种类按按载体在酵母中的复制形式分为：载体在酵母中的复制形式分为：YIp：酵母整合型载体酵母整合型载体YRp
3、：酵母自主复制型载体酵母自主复制型载体YCp：酵母含着丝粒片段载体酵母含着丝粒片段载体YEp：酵母附加体型载体酵母附加体型载体YAC：酵母人工染色体酵母人工染色体昆虫表达系统昆虫表达系统杆状病毒基因组：闭环双链杆状病毒基因组：闭环双链杆状病毒基因组：闭环双链杆状病毒基因组：闭环双链DNADNA，88-166kb88-166kb启动子：杆状病毒科核多角体病毒的多角蛋白强启启动子：杆状病毒科核多角体病毒的多角蛋白强启启动子：杆状病毒科核多角体病毒的多角蛋白强启启动子：杆状病毒科核多角体病毒的多角蛋白强启动子动子动子动子表达系统表达系统表达系统表达系统杆状病毒表达系统（杆状病毒表达系统（杆状病毒表达
4、系统（杆状病毒表达系统（BEVSBEVS）家蚕核型多角体病毒家蚕核型多角体病毒家蚕核型多角体病毒家蚕核型多角体病毒- -家蚕表达系统家蚕表达系统家蚕表达系统家蚕表达系统宿主：鳞翅目、膜翅目、双翅目、鞘翅目、直翅目、宿主：鳞翅目、膜翅目、双翅目、鞘翅目、直翅目、宿主：鳞翅目、膜翅目、双翅目、鞘翅目、直翅目、宿主：鳞翅目、膜翅目、双翅目、鞘翅目、直翅目、脉翅目、毛翅目的脉翅目、毛翅目的脉翅目、毛翅目的脉翅目、毛翅目的600600多种昆虫多种昆虫多种昆虫多种昆虫克隆基因方法：转移载体克隆基因方法：转移载体克隆基因方法：转移载体克隆基因方法：转移载体共转染共转染共转染共转染同源重组同源重组同源重组同源
5、重组空空空空斑筛选斑筛选斑筛选斑筛选纯化纯化纯化纯化重组病毒重组病毒重组病毒重组病毒杆状病毒表达系统优点杆状病毒表达系统优点容量大：能插入容量大：能插入12kb的外源基因的外源基因高表达：高表达：polh基因启动子是目前所知的最基因启动子是目前所知的最强的真核启动子；产物对宿主影响小；产强的真核启动子；产物对宿主影响小；产物可结晶物可结晶高效：可同时表达多个基因高效：可同时表达多个基因安全：杆状病毒对脊椎动物无病原性安全：杆状病毒对脊椎动物无病原性具加工修饰功能：昆虫细胞较高等具加工修饰功能：昆虫细胞较高等家蚕易饲养家蚕易饲养哺乳动物细胞表达表达系统哺乳动物细胞表达表达系统常用宿主细胞常用宿主
6、细胞哺乳动物细胞常用载体哺乳动物细胞常用载体真核细胞表达元件真核细胞表达元件哺乳动物基因转移的遗传标记哺乳动物基因转移的遗传标记基因表达的检测方法基因表达的检测方法哺乳动物细胞表达的优点哺乳动物细胞表达的优点重组重组DNA易转染，遗传稳定，可重复易转染，遗传稳定，可重复识别和去除内含子识别和去除内含子进行翻译后修饰进行翻译后修饰磷酸化、糖基化、二硫键、寡聚体等的形成、磷酸化、糖基化、二硫键、寡聚体等的形成、磷酸化、糖基化、二硫键、寡聚体等的形成、磷酸化、糖基化、二硫键、寡聚体等的形成、高级结构的正确折叠高级结构的正确折叠高级结构的正确折叠高级结构的正确折叠产品的构型正确率高，可被改造成类人体源
7、产品的构型正确率高，可被改造成类人体源性，免疫源性好性，免疫源性好可分泌至培养基，提纯工艺简单，成本低可分泌至培养基，提纯工艺简单，成本低可用于基因治疗可用于基因治疗常用宿主细胞常用宿主细胞细胞名称细胞名称细胞名称细胞名称来源来源来源来源已已已已投放产品投放产品投放产品投放产品BHK-21BHK-21地鼠幼鼠肾地鼠幼鼠肾地鼠幼鼠肾地鼠幼鼠肾凝血凝血凝血凝血因子因子因子因子CHO-K1CHO-K1中国仓鼠卵巢中国仓鼠卵巢中国仓鼠卵巢中国仓鼠卵巢tPAtPA，因子，因子，因子，因子，EPOEPO，G-CSFG-CSF等等等等C127C127小鼠乳腺肿瘤小鼠乳腺肿瘤小鼠乳腺肿瘤小鼠乳腺肿瘤GHGHM
8、DCKMDCK长耳狗肾脏长耳狗肾脏长耳狗肾脏长耳狗肾脏兽用疫苗兽用疫苗兽用疫苗兽用疫苗NamalwaNamalwaBurkittBurkitt淋巴瘤病人的类淋巴瘤病人的类淋巴瘤病人的类淋巴瘤病人的类淋巴母细胞淋巴母细胞淋巴母细胞淋巴母细胞EPOEPO，LTLT，tPAtPA，IFNIFNVeroVero成年非洲绿猴肾成年非洲绿猴肾成年非洲绿猴肾成年非洲绿猴肾HBsAgHBsAg，GHGH鼠骨髓瘤细胞鼠骨髓瘤细胞鼠骨髓瘤细胞鼠骨髓瘤细胞骨髓瘤骨髓瘤骨髓瘤骨髓瘤tPAtPA，抗体抗体抗体抗体COSCOSSV40SV40转化的绿猴肾细胞转化的绿猴肾细胞转化的绿猴肾细胞转化的绿猴肾细胞CD34CD34
9、，CD69CD69，TGFTGF真核细胞表达元件真核细胞表达元件原核原核DNA序列序列启动子启动子 增强子增强子 拼接信号拼接信号终止子和多聚腺苷化信号终止子和多聚腺苷化信号筛选标记筛选标记动物病毒基因序列动物病毒基因序列原核原核DNA序列序列原核复制子原核复制子抗生素抗性基因抗生素抗性基因多克隆位点多克隆位点启动子启动子真核启动子：真核启动子：真核启动子：真核启动子：RNARNA聚合酶（聚合酶（聚合酶（聚合酶（）结合并起动转录的）结合并起动转录的）结合并起动转录的）结合并起动转录的DNADNA序列序列序列序列一般包括转录起始点及其上游约一般包括转录起始点及其上游约一般包括转录起始点及其上游约
10、一般包括转录起始点及其上游约100-200100-200bpbp序列，包序列，包序列，包序列，包含有若干具有独立功能的含有若干具有独立功能的含有若干具有独立功能的含有若干具有独立功能的DNADNA序列元件，每个元件序列元件，每个元件序列元件，每个元件序列元件，每个元件约长约长约长约长7-307-30bp bp 核心启动子元件：核心启动子元件：核心启动子元件：核心启动子元件：RNARNA聚合酶起始转录所必需的最聚合酶起始转录所必需的最聚合酶起始转录所必需的最聚合酶起始转录所必需的最小小小小DNADNA序列，包括转录起始点及其上游序列，包括转录起始点及其上游序列，包括转录起始点及其上游序列，包括转
11、录起始点及其上游-25/-30-25/-30bpbp处处处处的的的的TATATATA盒。单独起作用时只能确定转录起始位点和盒。单独起作用时只能确定转录起始位点和盒。单独起作用时只能确定转录起始位点和盒。单独起作用时只能确定转录起始位点和产生基础水平的转录产生基础水平的转录产生基础水平的转录产生基础水平的转录上游启动子元件包括通常位于上游启动子元件包括通常位于上游启动子元件包括通常位于上游启动子元件包括通常位于-70-70bpbp附近的附近的附近的附近的CAATCAAT盒盒盒盒和和和和GCGC盒、以及距转录起始点更远的上游元件。与相盒、以及距转录起始点更远的上游元件。与相盒、以及距转录起始点更远
12、的上游元件。与相盒、以及距转录起始点更远的上游元件。与相应的蛋白因子结合改变转录效率。不同基因具有不应的蛋白因子结合改变转录效率。不同基因具有不应的蛋白因子结合改变转录效率。不同基因具有不应的蛋白因子结合改变转录效率。不同基因具有不同的上游启动子元件组成，其位置也不相同，即不同的上游启动子元件组成，其位置也不相同，即不同的上游启动子元件组成，其位置也不相同，即不同的上游启动子元件组成，其位置也不相同，即不同的基因表达分别有不同的调控同的基因表达分别有不同的调控同的基因表达分别有不同的调控同的基因表达分别有不同的调控 哺乳类哺乳类RNA聚合酶聚合酶启动子启动子中常见的元件中常见的元件 元件名称元
13、件名称共同序列共同序列结合的蛋白因子结合的蛋白因子名称名称 分子量分子量 结合结合DNA长度长度 TATA boxTATAAAATBP 30,000 10bpGC box GGGCGGSP-1 105,000 20bpCAAT box GGCCAATCT CTF/NF1 60,000 22bpOctamer ATTTGCAT Oct-1 76,000 20bpOct-2 53,000 23bpk k BGGGACTTTCCNFk k B 44,000 10bpATFGTGACGTAFT ? 20bp常用启动子常用启动子Rous肉瘤启动子（肉瘤启动子（RSV）巨细胞病毒启动子（巨细胞病毒启动子（
14、CMV）SV40启动子启动子增强子增强子增强子：是一种能够提高转录效率的顺式调增强子：是一种能够提高转录效率的顺式调控元件，最早是在控元件，最早是在SV40病毒中发现长约病毒中发现长约200bp的一段的一段DNA，可使旁侧的基因转录可使旁侧的基因转录提高提高100倍，其后在多种真核生物、甚至在倍，其后在多种真核生物、甚至在原核生物中都发现了增强子原核生物中都发现了增强子增强子通常占增强子通常占100-200bp长度，也和启动子长度，也和启动子一样由若干组件构成，其基本核心组件常一样由若干组件构成，其基本核心组件常为为8-12bp，可以单拷贝或多拷贝串连形式可以单拷贝或多拷贝串连形式存在存在 增
15、强子的作用特点增强子的作用特点 提高同一链上基因转录效率，可远距离起作用，提高同一链上基因转录效率，可远距离起作用，提高同一链上基因转录效率，可远距离起作用，提高同一链上基因转录效率，可远距离起作用，通常距离通常距离通常距离通常距离1-41-4kbkb、但远至但远至但远至但远至3030kbkb仍能发挥作用，在仍能发挥作用，在仍能发挥作用，在仍能发挥作用，在基因的上游或下游都能起作用基因的上游或下游都能起作用基因的上游或下游都能起作用基因的上游或下游都能起作用与其序列的正反方向无关与其序列的正反方向无关与其序列的正反方向无关与其序列的正反方向无关要有启动子才能发挥作用。但增强子对启动子没要有启动
16、子才能发挥作用。但增强子对启动子没要有启动子才能发挥作用。但增强子对启动子没要有启动子才能发挥作用。但增强子对启动子没有严格的专一性，同一增强子可以影响不同类型有严格的专一性，同一增强子可以影响不同类型有严格的专一性，同一增强子可以影响不同类型有严格的专一性，同一增强子可以影响不同类型启动子的转录启动子的转录启动子的转录启动子的转录增强子的作用机理虽然还不明确，但与其他顺式增强子的作用机理虽然还不明确，但与其他顺式增强子的作用机理虽然还不明确，但与其他顺式增强子的作用机理虽然还不明确，但与其他顺式调控元件一样，必须与特定的蛋白质因子结合后调控元件一样，必须与特定的蛋白质因子结合后调控元件一样，
17、必须与特定的蛋白质因子结合后调控元件一样，必须与特定的蛋白质因子结合后才能发挥增强转录的作用才能发挥增强转录的作用才能发挥增强转录的作用才能发挥增强转录的作用增强子一般具有组织或细胞特异性，许多增强子增强子一般具有组织或细胞特异性，许多增强子增强子一般具有组织或细胞特异性，许多增强子增强子一般具有组织或细胞特异性，许多增强子只在某些细胞或组织中表现活性，是由这些细胞只在某些细胞或组织中表现活性，是由这些细胞只在某些细胞或组织中表现活性，是由这些细胞只在某些细胞或组织中表现活性，是由这些细胞或组织中具有特异性蛋白质因子所决定的或组织中具有特异性蛋白质因子所决定的或组织中具有特异性蛋白质因子所决定
18、的或组织中具有特异性蛋白质因子所决定的 常用增强子常用增强子LTR：Rous肉瘤病毒基因长末端重复序列肉瘤病毒基因长末端重复序列人类巨细胞病毒增强子人类巨细胞病毒增强子SV40病毒增强子病毒增强子终止信号和终止信号和poly A信号信号真核基因转录的终止信号与机制还不明确真核基因转录的终止信号与机制还不明确poly A增加增加mRNA的的稳定性的的稳定性多聚腺苷化所需的两种序列多聚腺苷化所需的两种序列位于位于位于位于poly Apoly A下游下游下游下游GUGU丰富区或丰富区或丰富区或丰富区或U U丰富区丰富区丰富区丰富区位于位于位于位于poly Apoly A上游上游上游上游11-3011
19、-30bpbp处的处的处的处的5-5-AAUAAAAAUAAASV40 poly A信号信号遗传性标记遗传性标记胸苷激酶基因（胸苷激酶基因（tk）选择系统选择系统二氢叶酸还原酶基因（二氢叶酸还原酶基因（dhfr）选择系统选择系统新霉素抗性基因（新霉素抗性基因（neo）选择系统选择系统氯霉素乙酰转移酶基因（氯霉素乙酰转移酶基因（cat）选择系统选择系统胸苷激酶（胸苷激酶（TK）基因选择系统基因选择系统TK是核苷酸补救合成途径的一个关键酶是核苷酸补救合成途径的一个关键酶内源性缺陷内源性缺陷tk的宿主细胞的宿主细胞小鼠小鼠LMTK细胞细胞HAT选择法选择法H H：次黄嘌呤；补救合成三种核苷酸的原料次
20、黄嘌呤；补救合成三种核苷酸的原料次黄嘌呤；补救合成三种核苷酸的原料次黄嘌呤；补救合成三种核苷酸的原料A A：氨基喋呤；抑制四氢叶酸合成氨基喋呤；抑制四氢叶酸合成氨基喋呤；抑制四氢叶酸合成氨基喋呤；抑制四氢叶酸合成T T：胸苷；补救合成胸苷；补救合成胸苷；补救合成胸苷；补救合成dTTPdTTP的原料的原料的原料的原料tk细胞的鉴别与获得：细胞的鉴别与获得：5-溴脱氧核糖尿苷溴脱氧核糖尿苷（BUdR）筛选筛选二氢叶酸还原酶（二氢叶酸还原酶（DHFR）基因基因选择系统选择系统DHFR：真核细胞生物合成核苷酸的关键酶，真核细胞生物合成核苷酸的关键酶，功能是催化二氢叶酸还原成四氢叶酸功能是催化二氢叶酸还
21、原成四氢叶酸筛选剂：叶酸类似物筛选剂：叶酸类似物氨基喋呤或氨甲喋氨基喋呤或氨甲喋呤呤dhfr缺陷型细胞缺陷型细胞CHO细胞细胞正常细胞可通过提高氨甲喋呤浓度筛选正常细胞可通过提高氨甲喋呤浓度筛选突变型突变型dhfr基因的导入扩大筛选宿主细胞的基因的导入扩大筛选宿主细胞的范围范围新霉素抗性基因选择系统新霉素抗性基因选择系统新霉素（新霉素（neo）：）：即即G418，一种氨基糖苷一种氨基糖苷类抗生素，影响类抗生素，影响80S核糖体功能核蛋白质的核糖体功能核蛋白质的合成合成新霉素抗性基因编码新霉素抗性基因编码3-磷酸转移酶降解磷酸转移酶降解G418适用于所有的真核细胞适用于所有的真核细胞氯霉素乙酰转
22、移酶（氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因基因选择系统选择系统CAT：大肠杆菌大肠杆菌Tn9转座子编码的催化氯霉转座子编码的催化氯霉素乙酰化反应的蛋白质素乙酰化反应的蛋白质真核细胞缺乏真核细胞缺乏CAT导入导入CAT可作为报告基因可作为报告基因常用于瞬时表达研究常用于瞬时表达研究表位标记表位标记表位：抗原决定簇即抗原分子于一特定抗体表位：抗原决定簇即抗原分子于一特定抗体结合的化学基团，一般由少至几个氨基酸结合的化学基团，一般由少至几个氨基酸的多肽组成的多肽组成用于重组用于重组DNA技术的示踪、分析、纯化技术的示踪、分析、纯化（亲和）（亲和）优点优点用一种抗体可鉴别不同重组蛋白用一种抗体可鉴别不同重组
23、蛋白用一种抗体可鉴别不同重组蛋白用一种抗体可鉴别不同重组蛋白不影响蛋白功能不影响蛋白功能不影响蛋白功能不影响蛋白功能有利于研究蛋白功能有利于研究蛋白功能有利于研究蛋白功能有利于研究蛋白功能常用表位：常用表位：6His；FLAG；LZ等等构建含表位的重组体构建含表位的重组体使用常用密码子使用常用密码子注意克隆位点（限制性酶切位点）相符注意克隆位点（限制性酶切位点）相符5端加上起始密码子端加上起始密码子ATG3端加上终止密码子端加上终止密码子可插入蛋白酶切位点基因，以利于产生天然可插入蛋白酶切位点基因，以利于产生天然蛋白蛋白其他常规构建载体的注意点其他常规构建载体的注意点真核表达载体真核表达载体质
24、粒：真核表达元件、真核抗性质粒：真核表达元件、真核抗性病毒载体：改建后病毒载体：改建后SV40SV40病毒病毒病毒病毒腺病毒腺病毒腺病毒腺病毒反转录病毒反转录病毒反转录病毒反转录病毒痘苗病毒痘苗病毒痘苗病毒痘苗病毒病毒基因组的结构特点病毒基因组的结构特点病毒基因组大小相差较大病毒基因组大小相差较大病毒基因组大小相差较大病毒基因组大小相差较大, ,与细菌或真核细胞相比，病毒与细菌或真核细胞相比，病毒与细菌或真核细胞相比，病毒与细菌或真核细胞相比，病毒的基因组很小的基因组很小的基因组很小的基因组很小 病毒基因组可以由病毒基因组可以由病毒基因组可以由病毒基因组可以由DNADNA组成，也可以由组成，也
25、可以由组成，也可以由组成，也可以由RNARNA组成组成组成组成 多数多数多数多数RNARNA病毒的基因组是由连续的核糖核酸链组成病毒的基因组是由连续的核糖核酸链组成病毒的基因组是由连续的核糖核酸链组成病毒的基因组是由连续的核糖核酸链组成 基因重叠即同一段基因重叠即同一段基因重叠即同一段基因重叠即同一段DNADNA片段能够编码两种甚至三种蛋白质片段能够编码两种甚至三种蛋白质片段能够编码两种甚至三种蛋白质片段能够编码两种甚至三种蛋白质分子分子分子分子 病毒基因组的大部分是用来编码蛋白质的病毒基因组的大部分是用来编码蛋白质的病毒基因组的大部分是用来编码蛋白质的病毒基因组的大部分是用来编码蛋白质的 病
26、毒基因组病毒基因组病毒基因组病毒基因组DNADNA序列中功能上相关的蛋白质的基因或序列中功能上相关的蛋白质的基因或序列中功能上相关的蛋白质的基因或序列中功能上相关的蛋白质的基因或rRNArRNA的基因往往丛集在基因组的一个或几个特定的部位的基因往往丛集在基因组的一个或几个特定的部位的基因往往丛集在基因组的一个或几个特定的部位的基因往往丛集在基因组的一个或几个特定的部位, ,形成一个功能单位或转录单元形成一个功能单位或转录单元形成一个功能单位或转录单元形成一个功能单位或转录单元 除了反转录病毒以外，一切病毒基因组都是单倍体，每个除了反转录病毒以外，一切病毒基因组都是单倍体，每个除了反转录病毒以外
27、，一切病毒基因组都是单倍体，每个除了反转录病毒以外，一切病毒基因组都是单倍体，每个基因在病毒颗粒中只出现一次基因在病毒颗粒中只出现一次基因在病毒颗粒中只出现一次基因在病毒颗粒中只出现一次 噬菌体（细胞病毒）的基因是连续的；而真核细胞病毒的噬菌体（细胞病毒）的基因是连续的；而真核细胞病毒的噬菌体（细胞病毒）的基因是连续的；而真核细胞病毒的噬菌体（细胞病毒）的基因是连续的；而真核细胞病毒的基因是不连续的基因是不连续的基因是不连续的基因是不连续的 病毒载体优点病毒载体优点真核细胞可识别的启动子真核细胞可识别的启动子报告基因报告基因可持续复制（感染周期）可持续复制（感染周期）部分载体可整合入基因组部分
28、载体可整合入基因组部分载体本身带有完整的复制及表达元件部分载体本身带有完整的复制及表达元件部分载体具有宿主细胞特异性部分载体具有宿主细胞特异性识别受体识别受体识别受体识别受体假病毒颗粒假病毒颗粒假病毒颗粒假病毒颗粒猿猴空泡病毒（猿猴空泡病毒（SV40）种属分类：乳多空病毒科多瘤病毒属种属分类：乳多空病毒科多瘤病毒属种属分类：乳多空病毒科多瘤病毒属种属分类：乳多空病毒科多瘤病毒属双链共价闭合环状双链共价闭合环状双链共价闭合环状双链共价闭合环状DNADNA（cccDNAcccDNA），），），），5243bp5243bp2020面体立体对称结构，直径面体立体对称结构，直径面体立体对称结构，直径面体
29、立体对称结构，直径4545nmnm以以以以EcoRlEcoRl内切酶切点作为内切酶切点作为内切酶切点作为内切酶切点作为0 0点分成点分成点分成点分成100100等分，等分，等分，等分，OriOri点是点是点是点是DNADNA双向复制的起绐点双向复制的起绐点双向复制的起绐点双向复制的起绐点早期编码进程是逆时钟方向，在病毒早期编码进程是逆时钟方向，在病毒早期编码进程是逆时钟方向，在病毒早期编码进程是逆时钟方向，在病毒DNADNA自制前，自制前，自制前，自制前，编码的蛋白质编码的蛋白质编码的蛋白质编码的蛋白质( (大大大大T T、小小小小T T抗原抗原抗原抗原) )与诱发宿主细胞的转与诱发宿主细胞的
30、转与诱发宿主细胞的转与诱发宿主细胞的转化有关化有关化有关化有关晚期编码区进程为顺时钟方向，是在病毒晚期编码区进程为顺时钟方向，是在病毒晚期编码区进程为顺时钟方向，是在病毒晚期编码区进程为顺时钟方向，是在病毒DNADNA复制复制复制复制开始以后，编码的蛋白质为三种病毒壳体蛋白开始以后，编码的蛋白质为三种病毒壳体蛋白开始以后，编码的蛋白质为三种病毒壳体蛋白开始以后，编码的蛋白质为三种病毒壳体蛋白VP1VP1、VP2VP2和和和和VP3VP3，这些蛋白是病毒的结构蛋白，不参与这些蛋白是病毒的结构蛋白，不参与这些蛋白是病毒的结构蛋白，不参与这些蛋白是病毒的结构蛋白，不参与细胞的转化过程细胞的转化过程细
31、胞的转化过程细胞的转化过程SV40感染细胞模式感染细胞模式感染形式：随宿主的不同产生的效应不同感染形式：随宿主的不同产生的效应不同许可性细胞许可性细胞许可性细胞许可性细胞裂解性感染（猿猴细胞）裂解性感染（猿猴细胞）裂解性感染（猿猴细胞）裂解性感染（猿猴细胞）非许可性细胞非许可性细胞非许可性细胞非许可性细胞整合入染色体（啮齿动物细胞）整合入染色体（啮齿动物细胞）整合入染色体（啮齿动物细胞）整合入染色体（啮齿动物细胞）半许可性细胞半许可性细胞半许可性细胞半许可性细胞既不整合也不裂解（人细胞）既不整合也不裂解（人细胞）既不整合也不裂解（人细胞）既不整合也不裂解（人细胞）SV40载体类型载体类型取代型
32、重组病毒取代型重组病毒去掉晚期区一段去掉晚期区一段去掉晚期区一段去掉晚期区一段DNADNA，外源基因可插入外源基因可插入外源基因可插入外源基因可插入需辅助病毒感染需辅助病毒感染需辅助病毒感染需辅助病毒感染可形成病毒颗粒可形成病毒颗粒可形成病毒颗粒可形成病毒颗粒重组病毒重组病毒-质粒载体质粒载体保留病毒复制相关序列保留病毒复制相关序列保留病毒复制相关序列保留病毒复制相关序列插入细菌质粒序列，可在大肠杆菌种复制增殖插入细菌质粒序列，可在大肠杆菌种复制增殖插入细菌质粒序列，可在大肠杆菌种复制增殖插入细菌质粒序列，可在大肠杆菌种复制增殖不形成病毒颗粒不形成病毒颗粒不形成病毒颗粒不形成病毒颗粒SV40及
33、衍生载体的优点及衍生载体的优点可在多种细胞中表达可在多种细胞中表达基因组基因组DNA、cDNA均可表达均可表达SV40的复制起始点的复制起始点广泛宿主范围的启动子广泛宿主范围的启动子多聚多聚A信号信号DNA拼接供体和信号（剪接内含子）拼接供体和信号（剪接内含子）部分载体含有报告基因部分载体含有报告基因感染宿主范围有限感染宿主范围有限复制只能在猿猴细胞中复制只能在猿猴细胞中载体载体DNA分子量小，容量小分子量小，容量小在用辅助病毒混合感染时，有野生化危险在用辅助病毒混合感染时，有野生化危险SV40及衍生载体的缺点及衍生载体的缺点痘苗病毒痘苗病毒双链双链DNA病毒病毒180kb，编码编码200种左
34、右的蛋白种左右的蛋白可独立的在细胞质中复制转录可独立的在细胞质中复制转录痘苗病毒载体优越性痘苗病毒载体优越性宿主范围广泛宿主范围广泛容量大容量大插入的外源基因可达插入的外源基因可达25kb瞬时表达瞬时表达无致癌性无致癌性本身即需接种本身即需接种可作为重组活疫苗的载体可作为重组活疫苗的载体痘苗病毒载体的缺点痘苗病毒载体的缺点分子量大，操作较困难分子量大，操作较困难无剪接功能无剪接功能不能插入含内含子的基因不能插入含内含子的基因外源基因必须插入非必需区外源基因必须插入非必需区构建重组痘苗病毒流程构建重组痘苗病毒流程tk基因插入质粒基因插入质粒tk基因内插入痘病毒早期启动子基因内插入痘病毒早期启动子
35、接上多克隆位点接上多克隆位点接上外源基因接上外源基因野毒株感染细胞野毒株感染细胞导入重组载体导入重组载体同源重组同源重组含外源基因的含外源基因的tk基因取代基因取代筛选含外源基因的重组病毒筛选含外源基因的重组病毒感染敏感宿主细胞表达外源基因感染敏感宿主细胞表达外源基因腺病毒腺病毒AdAd病毒颗粒的直径为病毒颗粒的直径为病毒颗粒的直径为病毒颗粒的直径为70-9070-90nmnm，呈呈呈呈2020面体立体对面体立体对面体立体对面体立体对称型，核心外层的壳体由称型，核心外层的壳体由称型，核心外层的壳体由称型，核心外层的壳体由252252个壳粒亚单位组成个壳粒亚单位组成个壳粒亚单位组成个壳粒亚单位组
36、成双股线型双股线型双股线型双股线型DNADNA，DNADNA约占病毒重量的约占病毒重量的约占病毒重量的约占病毒重量的11-14%11-14%不同亚型不同亚型不同亚型不同亚型AdAd病毒的病毒的病毒的病毒的DNADNA的的的的G+C%G+C%含量不同，与其含量不同，与其含量不同，与其含量不同，与其致瘤性能强弱有关致瘤性能强弱有关致瘤性能强弱有关致瘤性能强弱有关Ad2Ad2基因组的早期转录区有基因组的早期转录区有基因组的早期转录区有基因组的早期转录区有6 6个独立的区域个独立的区域个独立的区域个独立的区域: : IA(EIA)IA(EIA)、EIBEIB、E2(E2AE2(E2A和和和和E2B)E
37、2B)、E3E3、E4E4Ad2Ad2基因组约长基因组约长基因组约长基因组约长3636kbkb，EIAEIA和和和和EIBEIB与与与与Ad2Ad2的启动和的启动和的启动和的启动和转化细胞密切有关转化细胞密切有关转化细胞密切有关转化细胞密切有关腺病毒虽然分布广泛，其中某些亚型对动物具强腺病毒虽然分布广泛，其中某些亚型对动物具强腺病毒虽然分布广泛，其中某些亚型对动物具强腺病毒虽然分布广泛，其中某些亚型对动物具强致瘤性，但是从致瘤性，但是从致瘤性，但是从致瘤性，但是从A A组到组到组到组到E E组，迄今尚未证明与人类组，迄今尚未证明与人类组，迄今尚未证明与人类组，迄今尚未证明与人类肿瘤有病因学上的
38、联系肿瘤有病因学上的联系肿瘤有病因学上的联系肿瘤有病因学上的联系 腺病毒载体腺病毒载体容量较大：可插入容量较大：可插入7kb易培养、纯化易培养、纯化复制与转录依赖与宿主聚合酶复制与转录依赖与宿主聚合酶不整合不整合释放壳体蛋白，引起免疫反应释放壳体蛋白，引起免疫反应基因的导入方法基因的导入方法光穿孔法：激光；悬浮细胞光穿孔法：激光；悬浮细胞光穿孔法：激光；悬浮细胞光穿孔法：激光；悬浮细胞冲击波：活体局部的基因转移冲击波：活体局部的基因转移冲击波：活体局部的基因转移冲击波：活体局部的基因转移基因枪法：即微粒轰击；动物细胞，更适用于植基因枪法：即微粒轰击；动物细胞，更适用于植基因枪法：即微粒轰击；动
39、物细胞，更适用于植基因枪法：即微粒轰击；动物细胞，更适用于植物细胞物细胞物细胞物细胞穿孔法：脉冲电场；穿孔法：脉冲电场；穿孔法：脉冲电场；穿孔法：脉冲电场；CytomixCytomix缓冲液；缓冲液；缓冲液；缓冲液；70%70%细胞细胞细胞细胞死亡时效率最高死亡时效率最高死亡时效率最高死亡时效率最高磷酸钙共沉淀法磷酸钙共沉淀法磷酸钙共沉淀法磷酸钙共沉淀法脂质体法：脂质体法：脂质体法：脂质体法：LipofectinLipofectin；阳离子阳离子阳离子阳离子抗体转染法：抗抗体转染法：抗抗体转染法：抗抗体转染法：抗CD3CD3，CD34CD34或表面免疫求蛋白或表面免疫求蛋白或表面免疫求蛋白或表
40、面免疫求蛋白其他：超声波法；微注射法原生质体融合法；反其他：超声波法；微注射法原生质体融合法；反其他：超声波法；微注射法原生质体融合法；反其他：超声波法；微注射法原生质体融合法；反转录病毒感染法转录病毒感染法转录病毒感染法转录病毒感染法表达产物的检测技术表达产物的检测技术Western印迹法印迹法免疫学方法免疫学方法抗原抗原-抗体反应抗体反应荧光显微镜法荧光显微镜法表位标记的抗体与直接抗表位标记的抗体与直接抗体进行荧光标记体进行荧光标记免疫学方法免疫学方法Western印迹法印迹法蛋白样品制备蛋白样品制备 SDS-PAGE（按分子量大按分子量大小）小）电转移电转移一抗（特异性）一抗（特异性）二
41、抗二抗显色显色敏感度：敏感度：1-51-5ngng样品的制备样品的制备裂解细胞裂解细胞电泳加样缓冲液裂解细胞（煮沸电泳加样缓冲液裂解细胞（煮沸5-10min）抽提细胞蛋白（超声）抽提细胞蛋白（超声）SDS-PAGE丙烯酰胺和丙烯酰胺和N，N-亚甲双丙烯酰胺交联，亚甲双丙烯酰胺交联，形成一定孔径的分离介质，孔径大小由浓形成一定孔径的分离介质，孔径大小由浓度决定，具有分子筛效应度决定，具有分子筛效应在不连续的缓冲系统，具有浓缩效应在不连续的缓冲系统，具有浓缩效应蛋白质本身的电荷效应蛋白质本身的电荷效应SDS：阴离子去污剂，与蛋白质结合阴离子去污剂，与蛋白质结合SDS浓度大于浓度大于0.05%时，使
42、样品中的蛋白质时，使样品中的蛋白质带同样密度的电荷带同样密度的电荷电泳时使蛋白迁移只与分子量有关，且呈线电泳时使蛋白迁移只与分子量有关，且呈线性（对数分子量与迁移率），可测定分子性（对数分子量与迁移率），可测定分子量量电转移电转移支持介质：重氮苄氧甲基纸（支持介质：重氮苄氧甲基纸（DBP纸）、纸）、阴离子化尼龙膜、硝酸纤维素膜（阴离子化尼龙膜、硝酸纤维素膜（NC）蛋白质带负电，向正极迁移蛋白质带负电，向正极迁移凝胶考马斯亮兰染色，检查转移是否完全凝胶考马斯亮兰染色，检查转移是否完全膜丽春红染色膜丽春红染色标记分子量位置标记分子量位置靶蛋白的免疫学检测靶蛋白的免疫学检测封闭非特异性结合位点，脱脂
43、奶粉或血清白封闭非特异性结合位点，脱脂奶粉或血清白蛋白蛋白第一抗体：具有特异性，最好氏多抗或抗血第一抗体：具有特异性，最好氏多抗或抗血清清标记的第二抗体：同位素标记；碱性磷酸酶标记的第二抗体：同位素标记；碱性磷酸酶（AKP）标记；辣根过氧化物酶（标记；辣根过氧化物酶（HRP）标记标记注意封闭非特异性位点注意封闭非特异性位点注意抗体浓度：尤其是一抗浓度注意抗体浓度：尤其是一抗浓度显色反应显色反应AKP催化催化5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚磷酸与氮蓝四唑吲哚磷酸与氮蓝四唑发生反应，产生深蓝色发生反应，产生深蓝色HRP催化催化3,3-二氨基联苯胺与二氨基联苯胺与H2O2反应产反应产生棕色条带，易褪色，
44、注意保存结果生棕色条带，易褪色，注意保存结果转基因动物转基因动物概念：以动物个体为基因受体的基因表达技概念：以动物个体为基因受体的基因表达技术，并由于这种外源基因的导入而产生可术，并由于这种外源基因的导入而产生可以遗传的变异以遗传的变异这些遗传改变包括：这些遗传改变包括：外源外源外源外源DNADNA至少整合到一条染色体上至少整合到一条染色体上至少整合到一条染色体上至少整合到一条染色体上由于外源由于外源由于外源由于外源DNADNA的插入使任一基因发生改变的插入使任一基因发生改变的插入使任一基因发生改变的插入使任一基因发生改变由于外源由于外源由于外源由于外源DNADNA的插入使染色体发生重排的插入
45、使染色体发生重排的插入使染色体发生重排的插入使染色体发生重排有意识的导入可以持久存在的遗传实体有意识的导入可以持久存在的遗传实体有意识的导入可以持久存在的遗传实体有意识的导入可以持久存在的遗传实体植物生物反应器植物生物反应器生物反应器：一种定向的生产系统，是为获生物反应器：一种定向的生产系统，是为获取某种产品而定向构建和改造的装置，这取某种产品而定向构建和改造的装置，这种装置是最复杂最高等的生命系统种装置是最复杂最高等的生命系统特点：自组织，自复制，自调节，自适应特点：自组织，自复制，自调节，自适应优点优点无污染，可持续发展无污染，可持续发展无污染，可持续发展无污染，可持续发展操作简单灵活操作简单灵活操作简单灵活操作简单灵活成本低廉成本低廉成本低廉成本低廉可直接食用可直接食用可直接食用可直接食用稳定，便于储藏和运输稳定，便于储藏和运输稳定，便于储藏和运输稳定，便于储藏和运输
