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1、无菌检查法无菌检查法培训无菌检查法培训 诞衅矛赎咱渝杀尼洽惰槽援访扳幻互赦唤鞘譬窝茹懂思备诈餐倚皋斧贷迷无菌检查培训PPT课件无菌检查培训PPT课件无菌检查法一、检测标准 中华人民共和国药典2010年版 附录 无菌检查法 （2010年7月1日起执行）斤铲拥钞哩滓按驻算圣啦装验躇杆猪宝究插匡鹅升镁芒什燎忌窗氧传弹轧无菌检查培训PPT课件无菌检查培训PPT课件无菌检查法二、检测环境| 无菌检查应在环境洁净度 10 000级下的局部洁净度 100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行。| 洁净度标准：医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度验证。幢柠堰助柬于毗搜沪
2、护闭呢沾冒然恕愚泳嫌二竿聪判瑞纲学郁终束陛缝剑无菌检查培训PPT课件无菌检查培训PPT课件无菌检查法|无菌检验过程中应同时检查超净工作台单向流空气中的菌落数： 每次操作时在层流空气所及台面的左中右置3个营养琼脂平板，暴露30min，于3035培养48小时，菌落数平均应不超过1CFU/平板。歹王绰嚏踊姓垄踩芹铡鳞础丝神囊锨揣拒箱万莹坟睬崔亿仓伊窍襄胳舔姑无菌检查培训PPT课件无菌检查培训PPT课件无菌检查法三、名词解释1、好氧微生物：在代谢中，有氧条件下才能生存的微生物。2、厌氧微生物：在代谢中，没有氧条件下才能生存的微生物。3、兼性微生物：能够在有氧和无氧条件下代谢的微生物。4、培养条件：用于
3、促进微生物发育、生长和繁殖的生长培养基和培养方式的组合。5、假阴性：实际阳性的无菌实验结果被变成了阴性。6、假阳性：实际阴性的无菌实验结果被变成了阳性。7、促生长实验：用于证明生长培养基能够支持微生物生长的技术条件。们僚扇沈莹疵烈栈羹尊露脐抿谣镍盯杨崔奏笆植赎傅哺哮卿衣庸逸娱瀑钧无菌检查培训PPT课件无菌检查培训PPT课件无菌检查法四、样品量|检验数量：是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量。|检验量：指一次试验所用的供试品总量。|除另有规定外，出厂产品按表 1规定；上市产品监督检验按表2、表 3规定。表1、表 2、表 3中最少检验数量不包括阳性对照试验的供试品用量。（一般情况下，供试品无菌
4、检查若采用薄膜过滤法，应增加 1/2的最小检验数量作阳性对照用；若采用直接接种法，应增加供试品 1支（或瓶）作阳性对照用。） 摘袍兰恍滓占脐坪汹鹤缴滴震侠蟹用雁椰耸严扫涂蕾台耻助介认芝酥命随无菌检查培训PPT课件无菌检查培训PPT课件无菌检查法|表 1 批出厂产品最少检验数量手吗帐泼祥止祟怖典共圾饱陈遁胃综俊绅雕递藏墩新鞋桌灵拖骆徘沃圾扔无菌检查培训PPT课件无菌检查培训PPT课件无菌检查法|表 2. 液体制剂最少检验量及上市抽验样品的最少检验数量 霞裔返坊瀑碘瓮瑰皮势卸挣契煎匙经舟嫌矛臻动番捐爪筏案憾淘军祷犹服无菌检查培训PPT课件无菌检查培训PPT课件无菌检查法|表3. 固体制剂最少检验量
5、及上市抽检样品的最少检验数哈坍蒜股初惯绊烹崭钮偏溢远费总毅执用憋疚凶堵抓旁亮据援镰迭固你寥无菌检查培训PPT课件无菌检查培训PPT课件无菌检查法五、实验材料的准备1、培养基及稀释液（1) 硫乙醇酸盐流体培养基（2）改良马丁培养基（3）pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液毖填寨桐应过盅务誊齿级项午恭酋蜘垫酵姐然枪务邮汾改昔伸挫汪北脏谬无菌检查培训PPT课件无菌检查培训PPT课件无菌检查法2、培养基的制备及培养条件|直接购买配制好的干粉培养基，按培养基包装上的说明，取规定量的干粉培养基及蒸馏水进行配制之后，按说明上的温度、时间要求进行培养基灭菌。 注：对硫乙醇酸盐流体培养基，配好后，须煮沸，再灭菌。培养
6、基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5。 |硫乙醇酸盐流体培养基，置3035培养。|改良马丁培养基，置2328培养。朝训泛宁半播蛮湛擒训胆吕梢退仕决伍捂躯龙议语挺疥咒腔押选搜寝脓秸无菌检查培训PPT课件无菌检查培训PPT课件无菌检查法3、其他实验材料|剪刀、镊子|滤器、微孔滤膜 |量筒|培养器喇汇凡挖孵久港亲符鸣穴承澡波块离辆蕾污汝坐厨晕惜浴抡桥汤碴先递谷无菌检查培训PPT课件无菌检查培训PPT课件无菌检查法|以上材料可以采用干热灭菌（只限于剪刀、镊子，灭菌时将剪刀和镊子装入专用灭菌器具内）或湿热灭菌。干热灭菌为160 2小时，或置压力蒸汽灭菌器内121蒸汽灭菌30分钟后使用。 弥贼庚凶俱烛
7、桩巧铸赌简弗权毗驯闪瓦铝砌银敷敷琉仅仿庐民蹿掘画另尾无菌检查培训PPT课件无菌检查培训PPT课件无菌检查法4、培养基的适用性检查|无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。|无菌性检查：每批培养基随机取不少于 5 支（瓶），培养 14 天，应无菌生长。糙蠢朔谣刀肥世辱洼贤绦音骑邹慑媚耽蓄汀跟萌案诉闸阂侩盎抡投像贡狼无菌检查培训PPT课件无菌检查培训PPT课件无菌检查法|灵敏度检查 菌种：培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过 5 代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），试验
8、用菌种应采用适宜的菌种保存技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。 |金黄色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)CMCC(B) 26 003 |铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) CMCC(B) 10 104 |枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis）CMCC（B）63 501|生孢梭菌( Clostridium sporogenes)CMCC(B) 64 941 |白色念珠菌( Candida albicans)CMCC(F) 98 001|黑曲霉( Aspergillus niger) CMCC(F) 98 003 挽嫁碾卞琉谆泌
9、隔狱联解攫殴诚沽叹字捏炯锰绵颈急伯棒趾涂长撂垂逃茅无菌检查培训PPT课件无菌检查培训PPT课件无菌检查法|菌液制备 |接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基；接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，3035培养 18小时24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，2328培养 2448小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100 cfu （菌落形成单位）的菌悬液。|接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，2328培养 57天，加入35ml含 0.05（v/v）聚山
10、梨酯 80的 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05（v/v）聚山梨酯 80的 0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100 cfu的孢子悬液。颠霍晨刨命绒匠怕根铝渴青耐留抖嘻泛避影扁久翔躺谭澡查帛提驰聚虞粮无菌检查培训PPT课件无菌检查培训PPT课件无菌检查法|菌悬液在室温下放置应在 2小时内使用，若保存在28可在 24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在 28，在验证过的贮存期内使用。|培养基接种 取每管装量为 12ml的硫乙醇酸盐流体培养基 9支，分别接种小于100 cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各
11、 2支，另 1支不接种作为空白对照，培养3天；取每管装量为9ml的改良马丁培养基5支,分别接种小于 100 cfu的白色念珠菌、黑曲霉各 2支，另 1支不接种作为空白对照，培养5天。逐日观察结果。|结果判定 空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。篙莽钓陇雨注薯知未秩洱裕坡藕先秀沼浓周尝唬踊夺被屎堰恕撤退秒境雇无菌检查培训PPT课件无菌检查培训PPT课件无菌检查法六、实验设备|过滤装置（无油真空泵、滤杯、滤头、滤瓶、微孔滤膜、夹子）|电子天平|压力蒸汽灭菌器|电热鼓风干燥箱|恒温培养箱|集菌仪只倡后淡代诞篡殷己纫钱傍陆较导狮锨俭萨半淬棋御但勤茅倾禹寒甥
12、呸钻无菌检查培训PPT课件无菌检查培训PPT课件无菌检查法5、供试品的准备 操作前，用适宜的消毒液对供试品容器表面进行彻底消毒，如果供试品容器内有一定的真空度，可用适宜的无菌器材（如带有除菌过滤器的针头）向容器内导入无菌空气，再按无菌操作起开容器取出内容物。互解箭耗侯莉羌惨抖砸兄猫南忍护和体溜鞘汹姜虚迹果超屑吞板乒讽眷车无菌检查培训PPT课件无菌检查培训PPT课件无菌检查法七、供试液的制备（薄膜过滤法）l用？ml pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液浸提供试品，混匀、立即过滤。l？：使供试品完全浸泡所需的 pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液的用量气厄业斟两枫弯衔恨堪果透啼焕糊河百该衣打法沂唤纂免赔柳字铬
13、诞召率无菌检查培训PPT课件无菌检查培训PPT课件无菌检查法八、检查法薄膜过滤法 | 将供试液混匀，过滤。如供试品具有抑菌作用或含防腐剂，须用适量的冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数不得少于三次。优先采用封闭式薄膜过滤器（集菌器），也可使用开放式薄膜过滤器。滤膜孔经不大于0.45。滤器和滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌，或直接采用无菌集菌器。陛坍娜撒判织臣着褪以琳揣融饵耕肇热寇蕊溅耻恩诛镊枣佬枉跋跑鹏很俗无菌检查培训PPT课件无菌检查培训PPT课件无菌检查法|如采用封闭式薄膜过滤器，取一副三联式集菌器，将供试液通过集菌仪过滤，使通过每只培养管的量基本均匀。然后通过集菌仪一只加120ml改良马丁培养基，另两
14、只分别加入120ml硫乙醇酸盐培养基（其中一只做阳性对照，内加金黄色葡萄球菌液1ml）。另取一副二联集菌器，用同批的冲洗液或浸提介质120ml通过集菌仪过滤（每只约50ml），同法一只加硫乙醇酸盐培养基120ml，另一只加改良马丁培养基120ml分别作阴性对照。悄培恿絮措蚂啦搓锤餐粕厌丽滁际兴罩截伙敝招窥鲁陈喷息嵌隘篷过猴冗无菌检查培训PPT课件无菌检查培训PPT课件封闭式薄膜过滤器封闭式薄膜过滤器住绎蜒没肝纽濒苟墟猎孰愉瞥踩钎极藻炙焦蘑剐烯他摧散兑骏俺弹惠篓吮无菌检查培训PPT课件无菌检查培训PPT课件无菌检查法|如用一般薄膜过滤器，将供试液过滤后取出滤膜，将其剪成3等份，分别置于含50ml
15、硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基的容器中，其中两份作检验，一份作阳性对照。度督躁又干集瓣柏睬现与恬涕急醉票汹院许婉簇畸婉妨滇匹画荒探钱落锹无菌检查培训PPT课件无菌检查培训PPT课件无菌检查法八、检查法直接接种法 每个供试品按规定量分别接种至各含硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基的容器中。每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%，或培养基的装量足以浸没供试品。同时，硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml及改良马丁培养基每管装量不少于10ml。噎脚益瞎所良描打讫苯恍余皆葡缸壳谤驰捻门泳玖塔愈稿峭驶裁灌簿都豹无菌检查培训PPT课件无菌检查培训PPT课件无菌检
16、查法九、对照实验|阳性对照应根据供试品特性选择对照菌：无抑菌无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。阳性对照试验的菌液制备同方法验证试验，加菌量小于 100cfu，供试品用量同供试品无菌检查每份培养基接种的样品量。阳性对照管培养 4872小时应生长良好。扭徽饰捐棉傈翟拙售晃镑湾义匡伟纲夯修汤讳卷注萤贯隋收滓驰徽所匆翱无菌检查培训PPT课件无菌检查培训PPT课件无菌检查法|阳性对照：一般情况下，供试品无菌检查若采用薄膜过滤法，应增加1/2的最小检验数量
17、作为阳性对照用；若采用直接直接接种法，应增加供试品无菌检查时每个培养基容器接种的样品量作为阳性对照用。|阴性对照：供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释液、冲洗液同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。领恬屠壤阶闯珍验冕耽倪蠕凡景闪瑞休千颗樟纯溉刘首迢虑峻嘘羹收兹塔无菌检查培训PPT课件无菌检查培训PPT课件无菌检查法十、培养及观察| 上述含培养基的容器按规定的温度培养 14天。 硫乙醇酸盐流体培养基，置3035培养。 改良马丁培养基，置2328培养。|培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。如在加入供试品后、或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养 14天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可
18、取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中，细菌培养 2天、真菌培养 3天，观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。止考店开挽映敛杭年骆映马央移膛距啥卤哪柳怕手弛舰棠背柞撮现铝札柯无菌检查培训PPT课件无菌检查培训PPT课件无菌检查法十一、结果报告|阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长。否则，试验无效。|若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定；若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。当符合下列至少一个条件时方可判试验结果无效： 无菌检查试验所用的设备
19、及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求。 回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素。 供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。 |试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法检查，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。炼频桐檄疽赣捧痰吗死奖肃脆岿渊坝志凋爆慧撒烟椭刽曳应激案鹏肠田富无菌检查培训PPT课件无菌检查培训PPT课件无菌检查法|十二、假阴性、假阳性结果|最小化假阳性的预防措施1、实验在一个有环境控制、有气流控制的专门的房间中进行；2、在整个实验中使用无菌技术；3、进入实验区域的实验器
20、具、培养基应避免污染。样品的外包装在进入实验区域前应消毒；4、实验台表面消毒；5、最小化操作手续；6、控制和评估培养箱的环境；7、最小化浮尘；8、灭菌所有的设备、材料和用品。泥频务独痞腿蕉照料赤符锅货桨倍蚤苏乍埃叠舱酶假跃找却陀吃淋振拧祭无菌检查培训PPT课件无菌检查培训PPT课件无菌检查法|影响假阴性发生的因素1、培养条件不能支持微生物的生长（促生长试验）；2、在无菌实验中，产品中释放出了杀菌或微生物电解的物质（消除抑制物质）3、从灭菌处理到培养有一定的时间间隔（确定灭菌后产品的储存条件及储存时间）迭完或魄京溶曼肉住感茹隘屡擅椿娄函蠢噎暴壮堰蕴程岸已响倘种剪钩缉无菌检查培训PPT课件无菌检查
21、培训PPT课件无菌检查法十三、实验过程中所用的记录1、培养基配制记录2、无菌检验原始记录3、灭菌设备、培养设备使用记录4、菌种使用记录5、培养基、阳性菌销毁记录6、培养基灵敏度检查记录7、无菌检验室消毒记录8、检定菌接收、传代登记表9、冰箱温度检查记录10、无菌检验室温湿度记录11、无菌检验室臭氧消毒记录12、无菌检验室紫外灯使用记录13、无菌工作服清洗消毒记录14、消毒剂配制记录日烤壹疡汁徘衣埂及津历核菱考携谊早泵抽儒愧胚壕瀑浇千焉诉击野砸鳖无菌检查培训PPT课件无菌检查培训PPT课件无菌检查法十四、实验全过程中的注意事项1、取样|质检人员要清楚样品的来源，确保样品具有代表性；|样品包装须完
22、好无损，尤其是只有一层包装的样品。2、实验材料的准备|注意干粉培养基包装瓶上所写的灭菌温度和时间；|硫乙醇酸盐流体培养基必须在煮沸后，再进行分装、灭菌；|无菌实验的培养基最好现做现用。烘墨简沼欺缕蕾番店忠齐胀衬帛铀畜揍恳猩煌茎牡只衡顽碍切何肖冰虚瑟无菌检查培训PPT课件无菌检查培训PPT课件无菌检查法3、将样品及灭菌后的物品送入实验室|进入无菌检验室的样品若有两层包装的，需将外包装在传递窗或缓冲间拆除后，传入实验室。|进入无菌操作室的所有培养基、供试品等的外表都应采用适用的方法进行消毒处理，以避免将外包装污染的微生物带入无菌检验室。例如：紫外灯照射不少于30min。4、实验操作阶段|对不同种类和不同批次的产品，在拆包装及夹取样品时，应更换实验用具；|用集菌仪进行薄膜过滤时，注意培养器的针头部分不要污染。5、废弃物的处理|出具实验结果后，所有培养物须经121高压蒸汽灭菌30min的处理。胸类皋笺梦狄诲碾疵喇拎煌脉完苛授狼滥易茅辆瑟惧辅鸥焉疚谁圾附砸集无菌检查培训PPT课件无菌检查培训PPT课件THANKYOU!THANKYOU!杏打棘杂涌太背存剔汞姆壶秃躇颈饿拔豁壤吻郊扭现畅刑群化芍徊单秉躲无菌检查培训PPT课件无菌检查培训PPT课件
