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1、第九章第九章细胞衰老与凋亡细胞衰老与凋亡一一 细胞衰老细胞衰老（一）基本概念（一）基本概念 cellular aging / cell senescence100年前年前, 人们认为除单细胞原生生物外人们认为除单细胞原生生物外,多细胞生物的体细多细胞生物的体细胞会衰老和死亡胞会衰老和死亡.朴素观点朴素观点鸡心脏细胞无限生长和分裂（连续培养鸡心脏细胞无限生长和分裂（连续培养34年）、年）、hela细胞系细胞系的建立等实验，证明了细胞的建立等实验，证明了细胞“不死性不死性”的观点：细胞本身的观点：细胞本身没有衰老与死亡，细胞衰老的原因不在细胞本身，而是由没有衰老与死亡，细胞衰老的原因不在细胞本身，
2、而是由于体内和体外环境的影响结果。于体内和体外环境的影响结果。 有实验根据有实验根据Hayflick Limitation（1961）：）：细胞不是不死的，而是有一细胞不是不死的，而是有一定的寿命；它们的增殖能力不是无限的，而是有一定的界定的寿命；它们的增殖能力不是无限的，而是有一定的界限。即，限。即，细胞的增殖能力和寿命是有限的。细胞的增殖能力和寿命是有限的。实验一：实验一：胎儿和成人肺成纤维细胞可在体外分别传代胎儿和成人肺成纤维细胞可在体外分别传代50次和次和20次（次（年龄年龄）。）。实验二：实验二：早老症成纤维细胞在体外只能传代早老症成纤维细胞在体外只能传代24次（反次（反映映细胞在体
3、内状况细胞在体内状况）。）。实验三：实验三：龟（龟（175岁）的培养细胞的传代数岁）的培养细胞的传代数90125次，次，小鼠（小鼠（3.5岁）的传代数岁）的传代数1428（寿命长短寿命长短）。）。实验四：实验四：老年男性细胞和年轻女性细胞的倍增次数实验老年男性细胞和年轻女性细胞的倍增次数实验（巴氏小体标记）。（巴氏小体标记）。（细胞内部，细胞内部，而不是细胞外部决定而不是细胞外部决定细胞衰老细胞衰老）。）。实验五：实验五：去核的胞质体与完整细胞杂交实验，与胞质体去核的胞质体与完整细胞杂交实验，与胞质体细胞的年龄无关（细胞的年龄无关（细胞核细胞核决定细胞衰老决定细胞衰老）。）。所以，对于细胞而言
4、，衰老是不可避免的，衰老的原因所以，对于细胞而言，衰老是不可避免的，衰老的原因在于细胞本身。在于细胞本身。 （二）细胞在体内条件下的衰老二）细胞在体内条件下的衰老细胞的衰老和死亡不仅发生在细胞的衰老和死亡不仅发生在成体内成体内，发育早期发育早期（蝌蚪尾和期）也有。（蝌蚪尾和期）也有。测定测定不同年龄不同年龄小鼠小肠腺窝上皮细胞的周期长度，发现随年龄的增高，小鼠小肠腺窝上皮细胞的周期长度，发现随年龄的增高，细胞衰老，细胞周期长度明显延长（主要细胞衰老，细胞周期长度明显延长（主要G1期）。期）。周期的延长就是细胞分裂能力的下降，这种变化是由于体内环境影响的周期的延长就是细胞分裂能力的下降，这种变化
5、是由于体内环境影响的结果：结果：小鼠小鼠皮肤移植皮肤移植实验实验F1代、代、F2代代等，皮肤细胞的寿命等，皮肤细胞的寿命明显长于小鼠寿命；老年骨髓明显长于小鼠寿命；老年骨髓造血干细胞复壮造血干细胞复壮实验实验（三）衰老细胞结构的变化（三）衰老细胞结构的变化细胞核变化：细胞核变化：随着细胞分裂次数的增加，核不断增大；随着细胞分裂次数的增加，核不断增大；核膜内折；染色质固缩；有的细胞核的核仁裂解为小核膜内折；染色质固缩；有的细胞核的核仁裂解为小体。体。内质网变化：内质网变化：粗面内质网的总量呈粗面内质网的总量呈减少减少趋势；原来的有趋势；原来的有序序排列被打乱排列被打乱。体外培养的人胚肺成纤维细胞
6、在。体外培养的人胚肺成纤维细胞在26次次倍增前内质网膜腔膨胀扩大，含有不定型的致密物，倍增前内质网膜腔膨胀扩大，含有不定型的致密物，且为核糖体所覆盖；而且为核糖体所覆盖；而40次以后细胞内质网次以后细胞内质网膜腔未见膜腔未见膨胀，膨胀，不定型不定型致密物少致密物少，且具，且具无核糖体覆盖区无核糖体覆盖区。线粒体变化：线粒体变化：数量减少，体积增大，有时外膜破裂。数量减少，体积增大，有时外膜破裂。致密体生成：致密体生成：衰老细胞常见的一种结构。又称脂褐质、衰老细胞常见的一种结构。又称脂褐质、老年色素、血褐质、黄色素、透明蜡体、残体等。是老年色素、血褐质、黄色素、透明蜡体、残体等。是由溶酶体或线粒
7、体转化而来的。由溶酶体或线粒体转化而来的。膜系统变化：膜系统变化：年轻细胞年轻细胞的膜相为液晶相，脂双层柔韧，的膜相为液晶相，脂双层柔韧，脂肪酸链能自由移动，相邻脂质分子之间的位置交换脂肪酸链能自由移动，相邻脂质分子之间的位置交换极其频繁，膜蛋白表现出最大的生物学活性。极其频繁，膜蛋白表现出最大的生物学活性。衰老细衰老细胞胞的膜处于凝胶相或固相，磷脂的脂肪酸尾巴的膜处于凝胶相或固相，磷脂的脂肪酸尾巴“冻结冻结”，不能自由移动，膜的刚性增大，使膜蛋白不能运，不能自由移动，膜的刚性增大，使膜蛋白不能运动。此时，机械刺激或压迫，就会出现裂隙，通透性动。此时，机械刺激或压迫，就会出现裂隙，通透性受损。
8、细胞连接明显减少。受损。细胞连接明显减少。（四）细胞衰老的机制（四）细胞衰老的机制氧化损伤学说氧化损伤学说细胞从外界摄取氧的细胞从外界摄取氧的23%在代谢过程中，产生活性氧在代谢过程中，产生活性氧基团或分子（基团或分子（reactive oxygen species,ROS）：）：超氧自由基（超氧自由基（.O2）、）、羟自由基（羟自由基（.OH）、）、过氧化氢（过氧化氢（H2O2）。）。它们可引发脂质、蛋白质和核它们可引发脂质、蛋白质和核酸分子的氧化性损伤，从而导致细胞结构的损伤和破坏。这些酸分子的氧化性损伤，从而导致细胞结构的损伤和破坏。这些氧化性损氧化性损伤的积累伤的积累，最终导致细胞衰老
9、。如果清除，最终导致细胞衰老。如果清除ROS，就可以延长寿命，如就可以延长寿命，如SOD。有丝分裂钟学说有丝分裂钟学说Telomere是染色体末端的一种特殊结构，其是染色体末端的一种特殊结构，其DNA由简单的串联重复序列组成。它们在细胞分裂过程中不能被由简单的串联重复序列组成。它们在细胞分裂过程中不能被DNA聚合酶聚合酶完全复制，而是随细胞分裂的不断进行而逐渐变短。随着细胞的每次分完全复制，而是随细胞分裂的不断进行而逐渐变短。随着细胞的每次分裂，裂，端粒端粒不断缩短；当端粒长度缩短到一个阈值时，细胞就进入衰老。不断缩短；当端粒长度缩短到一个阈值时，细胞就进入衰老。 端粒酶端粒酶（Telomer
10、ase）可）可催化合成端粒重复序列并加在染色体末端。催化合成端粒重复序列并加在染色体末端。端粒酶由端粒酶由RNA和蛋白质组成，前者是合成端粒和蛋白质组成，前者是合成端粒DNA的模板，后者是反转的模板，后者是反转录酶亚基。录酶亚基。生殖细胞和癌细胞生殖细胞和癌细胞中含有端粒酶。如果将端粒酶基因转染到中含有端粒酶。如果将端粒酶基因转染到正常人二倍体细胞中，可明显延长细胞寿命。正常人二倍体细胞中，可明显延长细胞寿命。rDNA与衰老与衰老在一种酵母（在一种酵母（S. cerevisiae）中，已经确定细胞中，已经确定细胞衰老的步伐是由衰老的步伐是由rDNA的变化所决定的。的变化所决定的。rDNA以以1
11、00200份串联拷份串联拷贝存在于第贝存在于第12号染色体上，在酵母达到中年的某一时刻，通过同源号染色体上，在酵母达到中年的某一时刻，通过同源重组产生的第一份环状重组产生的第一份环状rDNA片段膨冲而出，成为片段膨冲而出，成为染色体外染色体外rDNA环环（ERC）。）。随着分裂的进行，随着分裂的进行，ERC不断复制增加，当积累到不断复制增加，当积累到5001000份拷贝时细胞就进入衰老。份拷贝时细胞就进入衰老。（与下一个机理密切相关）（与下一个机理密切相关）沉默信息调节蛋白复合物沉默信息调节蛋白复合物Silencing information regulator complex, Sir Co
12、mplexSir复合物通常存在于异染色质的端粒及与性别决定有关的复合物通常存在于异染色质的端粒及与性别决定有关的HML和和HMR位点上，其功能是阻止它们所在位点的位点上，其功能是阻止它们所在位点的DNA的转录。在的转录。在Sir突变体中，突变体中，Sir蛋白由端粒向核仁转移，使核仁蛋白由端粒向核仁转移，使核仁rDNA处于沉默处于沉默状态，抑制了复制及状态，抑制了复制及ERC的生成，阻止细胞衰老，而使生命延长。的生成，阻止细胞衰老，而使生命延长。线粒体线粒体DNA与衰老与衰老随着年龄的增长，线粒体随着年龄的增长，线粒体DNA的突变是相当显著的。而线粒体的突变是相当显著的。而线粒体DNA中存在着衰
13、老中存在着衰老DNA (Sen-DNA)。由于线粒体由于线粒体DNA参与电子传递链中某些成分的参与电子传递链中某些成分的编码，所以线粒体编码，所以线粒体DNA的突变可能导致电子传递链不能执的突变可能导致电子传递链不能执行正常功能，促进活性氧基团的生成。行正常功能，促进活性氧基团的生成。SGS1基因、基因、WRN基因与衰老基因与衰老酵母中，酵母中，90以上以上的的SGS1蛋白定位于核仁，如果核仁缺少蛋白定位于核仁，如果核仁缺少SGS1，它它就会裂解。就会裂解。在在SGS1突变细胞中，其核仁结构在年轻细胞中正常，而在突变细胞中，其核仁结构在年轻细胞中正常，而在年老细胞中核仁裂解为小体。人成纤维细胞
14、中，年老细胞中核仁裂解为小体。人成纤维细胞中，WRN基因基因也定位于核仁中，其功能是编码也定位于核仁中，其功能是编码DNA解旋酶，保证细胞生解旋酶，保证细胞生命周期正常进行，如果发生突变就引起衰老提前发生和寿命命周期正常进行，如果发生突变就引起衰老提前发生和寿命的缩短。的缩短。二、细胞凋亡二、细胞凋亡（一）细胞凋亡的概念及生物学意义（一）细胞凋亡的概念及生物学意义1965年年Kerr观察大鼠肝细胞，在局部缺血条件下观察大鼠肝细胞，在局部缺血条件下不断转化为膜包的小的圆形细胞质团，称此现不断转化为膜包的小的圆形细胞质团，称此现象为象为“皱缩型坏死皱缩型坏死”。由于这些细胞质团是在。由于这些细胞质
15、团是在生理条件下产生的，生理条件下产生的，1972年改称为年改称为“细胞凋亡细胞凋亡”。90年代后，方兴未艾。年代后，方兴未艾。细胞凋亡（细胞凋亡（apoptosis）是一种主动的由基是一种主动的由基因决定的细胞自我破坏过程，自动结束其生命。因决定的细胞自我破坏过程，自动结束其生命。由于细胞凋亡受到严格的由遗传机制决定的程由于细胞凋亡受到严格的由遗传机制决定的程序性调控，又称为序性调控，又称为细胞编程性死亡细胞编程性死亡（programmed cell death,PCD）。）。通过细胞凋亡，通过细胞凋亡，有机体清除不再需要的细胞（蝌蚪尾消失、有机体清除不再需要的细胞（蝌蚪尾消失、手和足的成形
16、、手和足的成形、50%的神经细胞；成体的骨髓和肠每小时有的神经细胞；成体的骨髓和肠每小时有10亿个细胞凋亡、被病原感染细胞的清除）；淋巴细胞的克亿个细胞凋亡、被病原感染细胞的清除）；淋巴细胞的克隆选择过程中，细胞凋亡起着关键的作用；各种免疫细胞对隆选择过程中，细胞凋亡起着关键的作用；各种免疫细胞对靶细胞的攻击并引起其死亡，也是基于细胞凋亡。靶细胞的攻击并引起其死亡，也是基于细胞凋亡。诱导细胞凋亡的因子有两大类：诱导细胞凋亡的因子有两大类： 物理因子物理因子射线（紫外线、射线）、较温和的温度刺射线（紫外线、射线）、较温和的温度刺激激(热激、冷激热激、冷激) 化学及生物因子化学及生物因子活性氧基团
17、和分子、活性氧基团和分子、Ca2+载体、载体、VK3、视黄酸、细胞毒素。视黄酸、细胞毒素。DNA和蛋白质合成抑制剂、正常和蛋白质合成抑制剂、正常生理因子（激素、细胞生长因子）的失调、肿瘤坏死因子等。生理因子（激素、细胞生长因子）的失调、肿瘤坏死因子等。细胞凋亡举例（二）细胞凋亡与坏死（二）细胞凋亡与坏死细胞坏死与细胞凋亡是两种完全不同的过程和生物学现象，它是因细胞坏死与细胞凋亡是两种完全不同的过程和生物学现象，它是因病理而产生的被动死亡病理而产生的被动死亡,细胞膜发生渗漏，细胞内容物释放到胞外，细胞膜发生渗漏，细胞内容物释放到胞外，导致炎症反应导致炎症反应。（三）细胞凋亡的变化过程（三）细胞凋
18、亡的变化过程形态学变化过程：形态学变化过程：凋亡的起始凋亡的起始历经数分钟。细胞表面的特化结构历经数分钟。细胞表面的特化结构（微绒毛）消失，细胞间连接消失，但细胞膜完整并（微绒毛）消失，细胞间连接消失，但细胞膜完整并具选择透性；线粒体基本完整，但核糖体逐渐从内质具选择透性；线粒体基本完整，但核糖体逐渐从内质网上脱离，内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合；染网上脱离，内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合；染色质固缩，形成新月形结构，沿核膜分布。色质固缩，形成新月形结构，沿核膜分布。凋亡小体的形成凋亡小体的形成染色质断裂为大小不等的片段，染色质断裂为大小不等的片段，与某些细胞器（线粒体）一起聚集，被反折的
19、细胞膜与某些细胞器（线粒体）一起聚集，被反折的细胞膜所包围，使细胞表面形成了许多泡状或芽状突起。以所包围，使细胞表面形成了许多泡状或芽状突起。以后，逐渐分割，形成单个的凋亡小体。后，逐渐分割，形成单个的凋亡小体。凋亡小体逐渐为邻近的细胞所吞噬并消化凋亡小体逐渐为邻近的细胞所吞噬并消化。整个。整个凋亡过程需要凋亡过程需要49小时。小时。 a 正常T细胞杂 b 凋亡细胞； c 凋亡细胞(透射电镜) 交瘤细胞； 生化变化过程：生化变化过程：在核酸内切酶（在核酸内切酶（Ca2+ / Mg2+激活；激活；Zn2+抑制）的催化抑制）的催化下，核小体间的下，核小体间的DNA断裂，产生含有断裂，产生含有180
20、200bp整倍数整倍数的片段。这些片段在进行琼脂糖凝胶电泳时，形成了的片段。这些片段在进行琼脂糖凝胶电泳时，形成了特征性的特征性的梯状条带梯状条带(DNA ladders)。这也是鉴定细胞凋亡这也是鉴定细胞凋亡的一种可靠方法。的一种可靠方法。凋亡细胞的凋亡细胞的组织转谷氨酰胺酶组织转谷氨酰胺酶(tTG)不断积累并达到较不断积累并达到较高水平高水平。tTG催化某些蛋白质的翻译后修饰，导致蛋白催化某些蛋白质的翻译后修饰，导致蛋白质聚合。这些蛋白质不溶于水，不为溶酶体所降解，质聚合。这些蛋白质不溶于水，不为溶酶体所降解，它们进入凋亡小体，有助于凋亡小体完整性的保持，它们进入凋亡小体，有助于凋亡小体完
21、整性的保持，防止有害物质逸出。防止有害物质逸出。（四）细胞凋亡的检测（四）细胞凋亡的检测主要基于主要基于DNA的断裂的断裂。形态学观察形态学观察各种染色法：台盼蓝；各种染色法：台盼蓝；DAPI是一种与是一种与DNA结合的荧光染料，结合的荧光染料，可观察细胞核的形态变化；可观察细胞核的形态变化；Giemsa染色可以观察染色质固缩、趋边、染色可以观察染色质固缩、趋边、凋亡小体的形成等；透射电镜和扫描电镜。凋亡小体的形成等；透射电镜和扫描电镜。两种染料复染更好。两种染料复染更好。DNA电泳电泳凋亡细胞中提取的凋亡细胞中提取的DNA进行常规进行常规琼脂糖电泳时，大小不等的琼脂糖电泳时，大小不等的DNA
22、片段（片段（180200整倍数）呈现梯状条带。整倍数）呈现梯状条带。彗星电泳法（彗星电泳法（comet assay）将单个细胞悬将单个细胞悬浮于琼脂糖凝胶中，经裂解处理后，再在电场浮于琼脂糖凝胶中，经裂解处理后，再在电场中进行短时间的电泳，用荧光染料染色后，凋中进行短时间的电泳，用荧光染料染色后，凋亡细胞中形成的亡细胞中形成的DNA降解片段在电场中泳动速降解片段在电场中泳动速度不同，使细胞呈现一种彗星式的图案；而正度不同，使细胞呈现一种彗星式的图案；而正常的无常的无DNA断裂的核在泳动时保持圆球形。断裂的核在泳动时保持圆球形。流式细胞分析流式细胞分析采用碘化丙锭使凋亡细胞采用碘化丙锭使凋亡细胞
23、DNA片段产生激发荧光，用流式细胞仪检出片段产生激发荧光，用流式细胞仪检出凋亡的二倍体细胞，同时又能观察细胞的周凋亡的二倍体细胞，同时又能观察细胞的周期状态。期状态。（五）细胞凋亡的机制（五）细胞凋亡的机制1、caspase家族与凋亡家族与凋亡 Cysteine aspartic acic specific protease是一组结构相关的是一组结构相关的半胱氨酸蛋白酶半胱氨酸蛋白酶，存在于细胞质中，共同特点是能特异性断开天冬氨酸存在于细胞质中，共同特点是能特异性断开天冬氨酸残基后的肽键。所以，可以选择性地切割某些蛋白质，残基后的肽键。所以，可以选择性地切割某些蛋白质，使其活化或失活。目前发现
24、使其活化或失活。目前发现11种种caspase成分成分（caspase111），）， 其中其中，1、11和和4不直接参与凋亡不直接参与凋亡信号的转导，而是参与白介素的活化；信号的转导，而是参与白介素的活化；2、8、9和和10参与细胞凋亡的起始；参与细胞凋亡的起始；3、6和和7参与细胞凋亡的执行。参与细胞凋亡的执行。哺乳类细胞内存在编程性细胞死亡抑制因子（哺乳类细胞内存在编程性细胞死亡抑制因子（inhibitor of apoptosis,IAP）家族，如家族，如XIAP, cIAP1, cIAP2，可可特异地抑制特异地抑制caspase3和和7。2、Bcl2家族家族 Bcl2是是 一种原癌基因
25、，能延长细胞的生一种原癌基因，能延长细胞的生存，抑制细胞凋亡。存，抑制细胞凋亡。在胚胎发育过程中，在胚胎发育过程中，BCL2的表达十分常见，但在成熟组的表达十分常见，但在成熟组织中，只有那些长期生存的细胞（干细胞、分裂后的神织中，只有那些长期生存的细胞（干细胞、分裂后的神经元等细胞）才表达。经元等细胞）才表达。Bcl2家族成员的基因中，常常含家族成员的基因中，常常含有三个保守的有三个保守的Bcl2同源区同源区BH1、BH2和和BH3，此三，此三区是调节凋亡以及蛋白质相互作用所必须的结构。虽然区是调节凋亡以及蛋白质相互作用所必须的结构。虽然同源，但不同成员，是以不同方式调节细胞凋亡。同源，但不同成员，是以不同方式调节细胞凋亡。3、p53与细胞凋亡与细胞凋亡P53是肿瘤抑制因子，人类肿瘤有是肿瘤抑制因子，人类肿瘤有50%以上是由以上是由p53基因的缺陷造基因的缺陷造成的。如将成的。如将p53基因重新导入已转化的细胞中，则可能产生两种基因重新导入已转化的细胞中，则可能产生两种不同的结果：生长阻遏或不同的结果：生长阻遏或细胞凋亡细胞凋亡。P53基因是通过调节基因是通过调节Bcl2基因的表达来影响细胞凋亡的。基因的表达来影响细胞凋亡的。P53可以可以特异性地抑制特异性地抑制Bcl2的表达，从而引起细胞凋亡。的表达，从而引起细胞凋亡。
