发酵工程制药FermentationEngineeringPPT课件

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1、发酵工程发酵工程（Fermentation Engineering）第一节第一节 概概 述述发酵的相关概念发酵的相关概念 发酵工程的发展简史发酵工程的发展简史 发酵类型发酵类型微生物发酵生产的药物微生物发酵生产的药物一、发酵的相关概念一、发酵的相关概念 发酵发酵：传统发酵：传统发酵 生化和生理学意义的发酵生化和生理学意义的发酵 工业上的发酵工业上的发酵 传统发酵传统发酵：最初发酵是用来描述酵母菌作用于果汁或：最初发酵是用来描述酵母菌作用于果汁或麦芽汁产生气泡的现象，或者是指酒的生产过程。麦芽汁产生气泡的现象，或者是指酒的生产过程。生化和生理学意义的发酵生化和生理学意义的发酵：指微生物在无氧条件

2、下，：指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式，或者更严格分解各种有机物质产生能量的一种方式，或者更严格地说，发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能地说，发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应。如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精反应。如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出并放出CO2。工业上的发酵工业上的发酵：泛指利用微生物制造或生产某些产品：泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程的过程 包括：厌氧培养的生产过程，如酒精，乳酸等；包括：厌氧培养的生产过程，如酒精，乳酸等；通气（有氧）培养的生产过程，如抗生素、氨基酸、通气（有氧）培养的生产过程，如抗生素、氨

3、基酸、酶制剂等。产品有细胞代谢产物，也包括菌体细胞、酶制剂等。产品有细胞代谢产物，也包括菌体细胞、酶等。酶等。发酵工程发酵工程：利用微生物的特定性状，通过现代：利用微生物的特定性状，通过现代工程技术在生物反应器中生产有用物质的一种技工程技术在生物反应器中生产有用物质的一种技术体系。术体系。二、发酵工程的发展简史二、发酵工程的发展简史19世纪或更早世纪或更早:酿酒、酒变质酿酒、酒变质20世纪初：一战世纪初：一战-丙酮丁醇的发酵丙酮丁醇的发酵1929年年1942：青霉素的发现及生产：青霉素的发现及生产20 世纪世纪40 年代：抗生素工业年代：抗生素工业 20 世纪世纪50 年代：氨基酸发酵工业年代

4、：氨基酸发酵工业 20世纪世纪60年代：酶制剂工业年代：酶制剂工业70年代年代 ：非碳水化合物代替碳水化合物的发酵：非碳水化合物代替碳水化合物的发酵 80 年代以来：重组年代以来：重组DNA 技术技术第一个第一个 大规大规模工业生产的模工业生产的发酵过程发酵过程厌氧发酵厌氧发酵 有氧发酵有氧发酵三、发酵类型及微生物发酵生产的药物三、发酵类型及微生物发酵生产的药物1.微生物菌体发酵微生物菌体发酵 2.微生物的酶微生物的酶 3.微生物代谢产物发酵微生物代谢产物发酵 4.微生物转化发酵微生物转化发酵 5.微生物特殊机能的利用微生物特殊机能的利用 1、微生物菌体发酵、微生物菌体发酵定义：是以获得具有多

5、种用途的微生物菌体细胞定义：是以获得具有多种用途的微生物菌体细胞为目的的产品的发酵工业，包括单细胞的酵母和藻为目的的产品的发酵工业，包括单细胞的酵母和藻类、担子菌，生物防治的苏云金杆菌以及人、畜防类、担子菌，生物防治的苏云金杆菌以及人、畜防治疾病用的疫苗等。治疾病用的疫苗等。特点：细胞的生长与产物积累成平行关系，生长特点：细胞的生长与产物积累成平行关系，生长速率最大时期也是产物合成速率最高阶段，生长稳速率最大时期也是产物合成速率最高阶段，生长稳定期产量最高。定期产量最高。2、微生物的酶、微生物的酶 酶的特点：易于工业化生产，便于改善工艺酶的特点：易于工业化生产，便于改善工艺提高产量。提高产量。

6、分类：胞内酶分类：胞内酶 和胞外酶和胞外酶生物合成特点：需要诱导作用，或遭受阻遏、生物合成特点：需要诱导作用，或遭受阻遏、抑制等调控作用的影响，在菌种选育、培养抑制等调控作用的影响，在菌种选育、培养基配制以及发酵条件等方面需给予注意。基配制以及发酵条件等方面需给予注意。3、微生物代谢产物发酵、微生物代谢产物发酵 包括初级代谢产物、中间代谢产物和次级包括初级代谢产物、中间代谢产物和次级代谢产物。代谢产物。对数生长期形成的产物是细胞自身生长所对数生长期形成的产物是细胞自身生长所必需的，称为初级代谢产物或中间代谢产物。必需的，称为初级代谢产物或中间代谢产物。各种次级代谢产物都是在微生物生长缓慢各种次

7、级代谢产物都是在微生物生长缓慢或停止生长时期即稳定期所产生的，来自于或停止生长时期即稳定期所产生的，来自于中间代谢产物和初级代谢产物。中间代谢产物和初级代谢产物。4、微生物转化发酵、微生物转化发酵 定义：是利用生物细胞对一些化合物某一特定义：是利用生物细胞对一些化合物某一特定部位（基团）的作用，使它转变成结构相类定部位（基团）的作用，使它转变成结构相类似但具有更在经济价值的化合物。似但具有更在经济价值的化合物。最终产物是由微生物细胞的酶或酶系对底物最终产物是由微生物细胞的酶或酶系对底物某一特定部位进行化学反应而形成的。某一特定部位进行化学反应而形成的。微生物发酵生产的药物：微生物发酵生产的药物

8、：主要包括：主要包括：抗生素类抗生素类、氨基酸类氨基酸类、核核苷酸类苷酸类、维生素类维生素类、甾体类激素甾体类激素、治治疗酶及酶抑制剂疗酶及酶抑制剂5、微生物特殊机能的利用、微生物特殊机能的利用 利用微生物消除环境污染利用微生物消除环境污染利用微生物发酵保持生态平衡利用微生物发酵保持生态平衡微生物湿法冶金微生物湿法冶金利用基因工程菌株开拓发酵工程新领域。利用基因工程菌株开拓发酵工程新领域。发酵的流程：发酵的流程：空气空气空气净化处理空气净化处理保藏菌种保藏菌种斜面活化斜面活化扩大培养扩大培养种子罐种子罐主发酵主发酵碳源、氮源、碳源、氮源、无机盐等营养无机盐等营养物质物质灭菌灭菌产物分离纯化产物

9、分离纯化成品成品菌种选育菌种选育第二节第二节 发酵过程中的微生物发酵过程中的微生物 微生物：指形体微小微生物：指形体微小(小于小于0.1mm)，结构简单，在，结构简单，在适宜环境中能迅速生长繁殖，易变异，通常要借助显适宜环境中能迅速生长繁殖，易变异，通常要借助显微镜才能看清楚的生物。目前已经知道的微生物约有微镜才能看清楚的生物。目前已经知道的微生物约有10万种，分布在以下各界中：万种，分布在以下各界中：原核生物界原核生物界：例如细菌、放线菌、蓝藻：例如细菌、放线菌、蓝藻真菌界真菌界：例如酵母菌、霉菌、大型真菌：例如酵母菌、霉菌、大型真菌原生生物界原生生物界：例如草履虫、变形虫、衣藻：例如草履虫

10、、变形虫、衣藻病毒病毒：例如艾滋病毒、脊髓灰质炎病毒、噬菌体：例如艾滋病毒、脊髓灰质炎病毒、噬菌体一、常见的药用微生物一、常见的药用微生物1、细菌、细菌 细菌的形态：球形、杆形、螺旋形细菌的形态：球形、杆形、螺旋形螺旋菌螺旋菌球菌球菌杆菌杆菌细菌的繁殖细菌的繁殖 ：细菌主要是以二分裂的方式进行的无性繁殖细菌主要是以二分裂的方式进行的无性繁殖细菌主要是以二分裂的方式进行的无性繁殖细菌主要是以二分裂的方式进行的无性繁殖细菌的结构细菌的结构 ：特殊的结构：特殊的结构：荚膜、鞭毛、芽孢荚膜、鞭毛、芽孢荚膜荚膜 主要成分为多糖，与其致病性有关。主要成分为多糖，与其致病性有关。芽孢芽孢 细菌生长到一定阶段

11、产生的一种抗逆细菌生长到一定阶段产生的一种抗逆 性很强的性很强的休眠体休眠体,以度过不良的环境。以度过不良的环境。 一般说，芽孢不起繁一般说，芽孢不起繁殖作用，只起度过不良殖作用，只起度过不良环境的作用，芽孢对热、环境的作用，芽孢对热、紫外线和许多有毒化学紫外线和许多有毒化学物质有很强的抗性物质有很强的抗性细菌的代谢类型：细菌的代谢类型：自养自养：硝化细菌、铁细菌、硫细菌等。：硝化细菌、铁细菌、硫细菌等。异养异养：大肠杆菌、乳酸菌、枯草杆菌等。：大肠杆菌、乳酸菌、枯草杆菌等。腐生腐生依靠分解动植物的遗体（尸体、粪便和枯枝依靠分解动植物的遗体（尸体、粪便和枯枝落叶），从中吸取有机物来生活。例如枯

12、草杆菌，它落叶），从中吸取有机物来生活。例如枯草杆菌，它可以引起食物的腐败。可以引起食物的腐败。寄生寄生从活的动植物体内吸取有机物来生活。例如从活的动植物体内吸取有机物来生活。例如寄生在肠道内的痢疾杆菌，它能够引起细菌性痢疾寄生在肠道内的痢疾杆菌，它能够引起细菌性痢疾需氧型需氧型：好氧性细菌。如：枯草杆菌、硝化细菌、铁：好氧性细菌。如：枯草杆菌、硝化细菌、铁细菌、根细菌、根 瘤菌等。瘤菌等。厌氧型厌氧型：厌氧性细菌。如：破伤风杆菌，产甲烷杆菌，：厌氧性细菌。如：破伤风杆菌，产甲烷杆菌，乳酸菌等。乳酸菌等。细菌的代谢类型与在生态系统中处于的地位细菌的代谢类型与在生态系统中处于的地位?异养需氧型异

13、养需氧型异养厌氧型异养厌氧型自养需氧型自养需氧型自养厌氧型自养厌氧型分解者或消费者分解者或消费者生产者生产者细菌的菌落：细菌的菌落： 单个或者少数细菌在固体培养基上大量繁单个或者少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，会形成一个肉眼可见的、具有一定形殖时，会形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体。态结构的子细胞群体。 特征：大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明特征：大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明特征：大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明特征：大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等。度等。度等。度等。 功能：每种细菌在一定条件下所形成的菌落，可功能：每种细菌在一定条件下所形成的菌落，

14、可功能：每种细菌在一定条件下所形成的菌落，可功能：每种细菌在一定条件下所形成的菌落，可以作为菌种鉴定的重要依据。以作为菌种鉴定的重要依据。以作为菌种鉴定的重要依据。以作为菌种鉴定的重要依据。 举例：如啤酒酵母菌落、红酵母菌落等。举例：如啤酒酵母菌落、红酵母菌落等。举例：如啤酒酵母菌落、红酵母菌落等。举例：如啤酒酵母菌落、红酵母菌落等。2、放线菌、放线菌介于细菌和真菌之间的一类微生物介于细菌和真菌之间的一类微生物放线菌的形态放线菌的形态 ：放线菌的结构放线菌的结构 气气生生菌菌丝丝孢孢子子丝丝孢子孢子基内菌丝基内菌丝培养基培养基放线菌的分布放线菌的分布放线菌的分布放线菌的分布 放线菌在自然界分布

15、很广，在土壤、堆肥放线菌在自然界分布很广，在土壤、堆肥放线菌在自然界分布很广，在土壤、堆肥放线菌在自然界分布很广，在土壤、堆肥和湖底、河底的淤泥等处，尤其在土壤中种和湖底、河底的淤泥等处，尤其在土壤中种和湖底、河底的淤泥等处，尤其在土壤中种和湖底、河底的淤泥等处，尤其在土壤中种类和数量很多。类和数量很多。类和数量很多。类和数量很多。放线菌的繁殖放线菌的繁殖放线菌的繁殖放线菌的繁殖 放线菌没有有性繁殖，主要通过形成无性放线菌没有有性繁殖，主要通过形成无性放线菌没有有性繁殖，主要通过形成无性放线菌没有有性繁殖，主要通过形成无性抱子形式进行无性繁殖，成熟的分生孢子或抱子形式进行无性繁殖，成熟的分生孢

16、子或抱子形式进行无性繁殖，成熟的分生孢子或抱子形式进行无性繁殖，成熟的分生孢子或孢囊孢子在适宜环境里发芽形成新的菌丝体。孢囊孢子在适宜环境里发芽形成新的菌丝体。孢囊孢子在适宜环境里发芽形成新的菌丝体。孢囊孢子在适宜环境里发芽形成新的菌丝体。常见放线菌：常见放线菌：连霉菌属连霉菌属 链霉素、金霉素、四环素链霉素、金霉素、四环素诺卡氏菌属诺卡氏菌属 利福霉素利福霉素小单孢菌属小单孢菌属 庆大霉素庆大霉素游动放线菌属游动放线菌属 创新霉素创新霉素产生抗生素最多产生抗生素最多的一类微生物的一类微生物3、真菌、真菌 伞菌类。属于真核生物，但不含叶绿素，伞菌类。属于真核生物，但不含叶绿素，无根、茎、叶，由

17、单细胞或多细胞组成，按无根、茎、叶，由单细胞或多细胞组成，按有性或无性方式繁殖。在自然界分布广泛，有性或无性方式繁殖。在自然界分布广泛，以寄生或腐生方式存在。以寄生或腐生方式存在。代谢产物代谢产物：抗生素（青、头孢、灰黄）、维生素、：抗生素（青、头孢、灰黄）、维生素、酶制剂、各种有机酸、葡萄糖酸、麦角碱酶制剂、各种有机酸、葡萄糖酸、麦角碱直接入药直接入药：冬虫夏草、麦角、神曲、僵蚕、灵芝：冬虫夏草、麦角、神曲、僵蚕、灵芝等等常见真菌：常见真菌：藻状菌纲：根霉藻状菌纲：根霉-生产甾体激素、延胡索素及生产甾体激素、延胡索素及酶制剂酶制剂子囊子囊菌纲菌纲：酵母菌属：酵母菌属担子菌纲：灵芝担子菌纲：灵

18、芝半知菌纲半知菌纲: 曲霉属、青霉属、头孢菌属曲霉属、青霉属、头孢菌属4、病毒、病毒 化学组成化学组成形态单位形态单位功能功能排列方式排列方式由蛋白质构成由蛋白质构成衣壳粒衣壳粒通常由通常由1-6个多个多肽分子组成肽分子组成保护核酸保护核酸决定抗原特异性决定抗原特异性使病毒呈现不同的形态使病毒呈现不同的形态衣壳衣壳病毒的繁殖病毒的繁殖吸附吸附吸附吸附注入核酸注入核酸注入核酸注入核酸合成核酸和蛋白质合成核酸和蛋白质合成核酸和蛋白质合成核酸和蛋白质释放释放释放释放装配装配装配装配二、生产菌种的选育二、生产菌种的选育自然选育自然选育自然突变与定向培养自然突变与定向培养诱变育种诱变育种杂交育种杂交育种

19、原生质体融合原生质体融合基因重组基因重组 自然选育自然选育 以以采采集集土土壤壤为为主主。一一般般园园田田土土和和耕耕作作过过的的沼沼泽泽土土中中，以以细细菌菌和和放放线线菌菌为为主主，富富含含碳碳水水化化合合物物的的土土壤壤和和沼沼泽泽地地中中，酵酵母母和和霉霉菌菌较较多多，如如一一些些野野果果生生长长区区和和果果园园内内。采采样样的的对对象象也也可可以以是是植植物物，腐腐败败物物品品，某某些水域等。些水域等。采集对象：采集对象：从自然界分离的菌种从自然界分离的菌种从自然界分离的菌种从自然界分离的菌种产 品基因工程基因工程基因工程基因工程诱变育种诱变育种诱变育种诱变育种诱变育种诱变育种诱变育

20、种诱变育种生产用菌种生产用菌种生产用菌种生产用菌种扩大培养扩大培养扩大培养扩大培养原原原原 料料料料微生物菌体微生物菌体微生物菌体微生物菌体代谢产物代谢产物代谢产物代谢产物分离提纯分离提纯分离提纯分离提纯接种接种接种接种培养基配置培养基配置培养基配置培养基配置灭菌灭菌灭菌灭菌菌种保存：菌种保存：1.斜面低温保藏法斜面低温保藏法2.石蜡油封存法石蜡油封存法3.砂土管保藏法砂土管保藏法4.曲法保藏法曲法保藏法5.甘油悬液保藏法甘油悬液保藏法6.冷冻真空干燥保藏法冷冻真空干燥保藏法7.液氮超低温保藏法液氮超低温保藏法8.宿主保藏法宿主保藏法第三节第三节 发酵设备与消毒灭菌发酵设备与消毒灭菌发酵设备：

21、种子罐、发酵罐发酵设备：种子罐、发酵罐发酵罐：生物反应器发酵罐：生物反应器需氧微生物反应器（通气发酵罐）需氧微生物反应器（通气发酵罐）厌氧微生物反应器（嫌气发酵罐）厌氧微生物反应器（嫌气发酵罐） 尽量减少杂菌和噬菌体污染是微生物反应器所尽量减少杂菌和噬菌体污染是微生物反应器所必须具备的第一个条件。反应器内壁和管道焊接的必须具备的第一个条件。反应器内壁和管道焊接的部分，要求平滑、无裂缝和塌陷。此外，阀门应保部分，要求平滑、无裂缝和塌陷。此外，阀门应保持清洁。所有阀门和接管处必须用蒸汽灭菌。容器持清洁。所有阀门和接管处必须用蒸汽灭菌。容器主体的结构要简单、容易清洗。当反应器受到的外主体的结构要简单

22、、容易清洗。当反应器受到的外压略大于内压时，要防止液体和空气从反应器外流压略大于内压时，要防止液体和空气从反应器外流入器内。入器内。 大部分微生物反应器都是针对微生物悬浮在培大部分微生物反应器都是针对微生物悬浮在培养基中的，统称为深层发酵罐的形式。养基中的，统称为深层发酵罐的形式。主要内容主要内容（一）培养基及灭菌（一）培养基及灭菌1.培养基的定义、成份培养基的定义、成份2.培养基的类型培养基的类型3.培养条件培养条件4.培养基确定方法培养基确定方法5.培养基的灭菌：空消、实消、连消培养基的灭菌：空消、实消、连消（二）发酵工程制药的过程与控制（二）发酵工程制药的过程与控制1.种子的扩大培养种子

23、的扩大培养定义、目的定义、目的优良的种子应具备条件优良的种子应具备条件几个与种子有关的参数：发酵级数、种龄、接种几个与种子有关的参数：发酵级数、种龄、接种量量2.微生物发酵方式微生物发酵方式（三）思考题练习（三）思考题练习一、培养基及灭菌一、培养基及灭菌（一）、（一）、培养基的定义、成份培养基的定义、成份 培养基（培养基（culture mediumculture medium）：是人工）：是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。谢产物的营养基质。 主要成分：主要成分：碳源、氮源、无机盐、生长碳源、氮源、无机盐、生长因子、前体、水因子、前体、

24、水1、碳源、碳源 作用：提供微生物菌种的生长繁殖所需作用：提供微生物菌种的生长繁殖所需的的能源能源和合成菌体所必需的和合成菌体所必需的碳成分碳成分来源来源：糖类、油脂、有机酸、正烷烃糖类、油脂、有机酸、正烷烃工业上常用的糖类：葡萄糖、蜜糖工业上常用的糖类：葡萄糖、蜜糖2、氮类、氮类 作用：氮源主要用于构成菌体细胞物质作用：氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。氮源。 （1）无机氮源：）无机氮源：常用：硫酸铵、硝酸钠常用：硫酸铵、硝酸钠特点：特点

25、：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起引起pH的变化如：的变化如：(NH4)2SO4 2NH3 + 2H2SO4 NaNO3 + 4H2 NH3 + 2H2O + NaOH 无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质生理酸性物质，如硫酸胺，如硫酸胺，若菌体代谢后能产生碱性物质的

26、则此种无机氮源称为若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生生理碱性物质理碱性物质，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的稳定和调节发酵过程的pH有积极作用。有积极作用。所以选择合适的无机氮源有两层意义：所以选择合适的无机氮源有两层意义： 满足菌体生长满足菌体生长 稳定和调节发酵过程中的稳定和调节发酵过程中的pH（2）有机氮源）有机氮源来源来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼粉、黄料，花生饼粉、黄豆饼粉豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、玉米蛋白粉、牛肉膏牛肉

27、膏、蛋白胨蛋白胨、酵母粉酵母粉、鱼粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟。蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟。成分复杂成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子大量的无机盐及生长因子例例 玉米浆玉米浆： 可溶性蛋白、生长因子（生物素）可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸、苯乙酸 较多的乳酸较多的乳酸硫、磷、微量元素等硫、磷、微量元素等工业常工业常用用实验室实验室常用常用3、无机盐的微量元素无机盐的微量元素1、作用：各种不一样、作用：各种不一样2、来源：来源：C、N源，以盐的形式补充源，以盐的形式补充3、用量：根据具体的产品，以实验决定用量：根

28、据具体的产品，以实验决定4、使用注意点使用注意点A. 对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和 微量元素在发酵过程中必须加以考虑微量元素在发酵过程中必须加以考虑例：铁离子例：铁离子 青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20g/ml 发酵罐必须进行表面处理发酵罐必须进行表面处理B、使用时注意盐的形式（、使用时注意盐的形式（pH的变化）的变化）例例：黑曲酶黑曲酶NRRL-330,生产生产-淀粉酶，淀粉酶，P对酶活的影响对酶活的影响 pH 酶活酶活不加不加 4.25 120分钟分钟加加 K2HPO4 5.45 30分钟分钟加

29、加 KH2PO4 4.62 75分钟分钟4、生长因子、前体和产物促进剂生长因子、前体和产物促进剂（1）生长因子：）生长因子：通常指那些微生物生长所必需而通常指那些微生物生长所必需而且需要量很小，但微生物自身不能合成或且需要量很小，但微生物自身不能合成或 合成合成量不足以满足机体生长需要的有机化合物。量不足以满足机体生长需要的有机化合物。广义广义说，凡是微生物生长不可缺少的微量有机物质都说，凡是微生物生长不可缺少的微量有机物质都称为生长因子称为生长因子(又称生长素又称生长素)，包括氨基酸、嘌呤、，包括氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等；嘧啶、维生素等；狭义狭义说，生长素仅指维生素。说，生长素仅指维生素

30、。 与微生物有关的维生素主要是与微生物有关的维生素主要是B族维生素，这族维生素，这些维生素是各种酶的活性基的组成部分，没有它些维生素是各种酶的活性基的组成部分，没有它们，酶就不能活动。们，酶就不能活动。 凡是缺少合成生长素类物质的微生物凡是缺少合成生长素类物质的微生物(即缺少即缺少了合成生长素过程中的某种酶了合成生长素过程中的某种酶)，统称为营养缺陷，统称为营养缺陷型。型。 前前体体指指某某些些化化合合物物加加入入到到发发酵酵培培养养基基中中，能能直直接接彼彼微微生生物物在在生生物物合合成成过过程程中中合合成成到到产产物物物物分分子子中中去去，而而其其自自身身的的结结构构并并没没有有多多大大变

31、变化化，但但是是产产物物的的产产量量却却因因加加入入前前体体而而有有较较大大的提高。的提高。（2）前体）前体青霉素：分子量青霉素：分子量356苯乙酸苯乙酸:分子量分子量136作用作用：前体有助于提高产量和组份：前体有助于提高产量和组份 P107用量用量：前体的用量可以按分子量衡算，具体使用有个转化：前体的用量可以按分子量衡算，具体使用有个转化 率的问题率的问题例：例：6000单位单位/ml的青霉素的青霉素G,需要多少苯乙酸需要多少苯乙酸 青霉素青霉素6000*0.6（微克）（微克）36mg/ml 苯乙酸（苯乙酸（36*136）/356=13.8mg/ml=1.38%实际使用时的转化率在实际使用

32、时的转化率在46-90%之间之间 例某厂单耗为：例某厂单耗为：0.337（kg/10亿青霉素）亿青霉素） 转化率为：转化率为：13.8/(0.337/0.6)*36=68%用法用法：前体使用时普遍采用流加的方法：前体使用时普遍采用流加的方法 前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利 苯乙酸，一般基础料中仅仅添加苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07% 前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化，前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化， 流加也有利于提高前提的转化率流加也有利于提高前提的转化率（3）产物促进剂）产物促进剂 所谓产物促进剂是指那

33、些非细胞生长所必须的营养物，又所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。 促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的。面的。 有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂本身是酶的诱导物； 有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善 细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产，细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产， 也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用； 有些促进剂的

34、作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。（5）水）水 对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。 水源质量的主要考虑参数包括水源质量的主要考虑参数包括pH值、溶解氧、可溶值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。 对于酿造行业，水的重要性不言而喻对于酿造行业，水的重要性不言而喻对于常规发酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清洁的对于常规发酵，可靠、持久，能

35、提供大量成分一致清洁的水。水。（二）培养基的类型（二）培养基的类型液体用 途化学成分物理性质作 用类 型分类依据半固体固体合成天然孢子培养基种子培养基发酵培养基 工业生产 观察微生物的运动、鉴定菌种的分离、计数分类、鉴定工业生产供菌种繁殖孢子提供大量优质的菌体累积代谢产物固体培养基固体培养基半固体培养基半固体培养基液体培养基液体培养基基础培养基基础培养基鉴别培养基鉴别培养基选择培养基选择培养基：在培养基内加入某种化学物质或：在培养基内加入某种化学物质或去除某些营养物质以抑制杂菌。去除某些营养物质以抑制杂菌。加富培养基加富培养基：在培养基中加入特定的营养物质，：在培养基中加入特定的营养物质，以供

36、少数特殊需要的微生物生长的培养基。以供少数特殊需要的微生物生长的培养基。富集培养富集培养：在培养基中加入特别的营养要素以：在培养基中加入特别的营养要素以增殖少数微生物的培养方式。增殖少数微生物的培养方式。发酵培养基的要求：发酵培养基的要求： 培养基能够满足产物最经济的合成。培养基能够满足产物最经济的合成。 发酵后所形成的副产物尽可能的少。发酵后所形成的副产物尽可能的少。 培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源丰富，便于采购运输，适合性能稳定，资源丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的大规模储藏，能保证生产上的 供应。供应。 所选用的培

37、养基应能满足总体工艺的要求，所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响通气、提取、纯化及废物处理如不应该影响通气、提取、纯化及废物处理等。等。合成培养基合成培养基 : : 原料其化学成分明确、稳定原料其化学成分明确、稳定 适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化规律培养基营养单一，价格较高，不适合用规律培养基营养单一，价格较高，不适合用于大规模工业生产于大规模工业生产 天然培养基天然培养基：采用天然原料：采用天然原料 原料来源丰富原料来源丰富( (大多为农副产品大多为农副产品) )、价格低廉、价格低廉、适于工业适于工业 化生产；原料质量等方面不加控制

38、化生产；原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性会影响生产稳定性 培养大肠杆菌常用两种培养基培养大肠杆菌常用两种培养基：M培养基培养基(1L)： Na2HPO4 6g，KH2PO4 3g， NaCl 0.5g， NH4Cl 1g， MgSO4.7H2O 0.5g， CaCl2 0.011g，葡萄糖，葡萄糖 2-10, pH 7.0 YPS培养基培养基：酪蛋白胨（日本大五营养）：酪蛋白胨（日本大五营养）10g，酵母提取物（英国酵母提取物（英国Oxoid）5g, NaCl 10g，PH 7.2 固体培养基固体培养基 :适合于菌种和孢子的培养和保存，适合于菌种和孢子的培养和保存，也广泛应用于有子实体的

39、真菌类，如香菇、白也广泛应用于有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的生产木耳等的生产 半固体培养基半固体培养基:即在配好的液体培养基中加入少即在配好的液体培养基中加入少量的琼脂，一般用量为量的琼脂，一般用量为0.5%0.8% ,主要用于主要用于微生物的鉴定。微生物的鉴定。液体培养基液体培养基:80%90%是水，其中配有可溶性是水，其中配有可溶性的或不溶性的或不溶性 的营养成分，是发酵工业大规模使的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基。用的培养基。 （三）培养条件（三）培养条件1.温度温度 2.pH值值 3.氧氧4.种龄种龄5.接种量接种量1、温度、温度 通常在生物学范围内每升高通常在生物学范围

40、内每升高1010，生，生长速度就加快一倍，所以温度直接影响酶长速度就加快一倍，所以温度直接影响酶反应，对于微生物来说，温度直接影响其反应，对于微生物来说，温度直接影响其生长和合成酶。生长和合成酶。 机体的重要组成如蛋白质、核酸等都对机体的重要组成如蛋白质、核酸等都对温度较敏感，随着温度的增高有可能遭受温度较敏感，随着温度的增高有可能遭受不可逆的破坏。不可逆的破坏。 微生物可生长的温度范围较广，总体微生物可生长的温度范围较广，总体说在说在-10-109595。2、pH值值 培养基中的培养基中的pHpH值与微生物生命活动有着密切值与微生物生命活动有着密切关系，各种微生物有其可以生长的和最适生长的关

41、系，各种微生物有其可以生长的和最适生长的pHpH范围。范围。 微生物通过其活动也能改变环境的微生物通过其活动也能改变环境的pHpH值。值。 发酵过程中，控制发酵液的发酵过程中，控制发酵液的pHpH值是控制生产的值是控制生产的指标之一，指标之一，pHpH值过高、过低都会影响微生物的生值过高、过低都会影响微生物的生长繁殖以及代谢产物的积累。长繁殖以及代谢产物的积累。 控制控制pHpH值不但可以保证微生物良好的生长，而值不但可以保证微生物良好的生长，而且可以防止杂菌的污染且可以防止杂菌的污染 一般来说，高碳源培养基倾向于向酸性一般来说，高碳源培养基倾向于向酸性pHpH转移，转移，高氮源培养基倾向于向

42、碱性高氮源培养基倾向于向碱性pHpH转移，这都跟碳氮转移，这都跟碳氮比直接有关。比直接有关。 微生物对氧的需要不同，是由于依赖获得能微生物对氧的需要不同，是由于依赖获得能量的代谢方面的差异。好气性菌主要是有氧呼吸量的代谢方面的差异。好气性菌主要是有氧呼吸或氧化代谢，厌气菌为厌气发酵或氧化代谢，厌气菌为厌气发酵( (分子间呼吸分子间呼吸) )，兼性厌气菌则两者兼而有之。兼性厌气菌则两者兼而有之。 不同微生物或同一微生物的不同生长阶段对不同微生物或同一微生物的不同生长阶段对通风量的要求也不相同。通风量的要求也不相同。 通风和搅拌通风和搅拌-搅拌搅拌则能使新鲜氧气更好则能使新鲜氧气更好地与培养液混合

43、，保证氧的最大限度溶解，并且地与培养液混合，保证氧的最大限度溶解，并且搅拌有利于热交换，使培养液的温度一致，还有搅拌有利于热交换，使培养液的温度一致，还有利于营养物质和代谢物的分散。此外，挡板则有利于营养物质和代谢物的分散。此外，挡板则有助于搅拌，使其效果更好。助于搅拌，使其效果更好。3、氧、氧4、种龄与接种量、种龄与接种量 种子培养期应取菌种的对数生长期为宜，菌种子培养期应取菌种的对数生长期为宜，菌种过嫩或过老，不但延长发酵周期，而且会降低种过嫩或过老，不但延长发酵周期，而且会降低产量。产量。 接种量的大小直接影响发酵周期。大量地接接种量的大小直接影响发酵周期。大量地接入培养成熟的菌种的优点

44、：入培养成熟的菌种的优点：1.1.可以缩短生长过程的延缓期，因而缩短了发酵可以缩短生长过程的延缓期，因而缩短了发酵周期，提高了设备利用率，周期，提高了设备利用率，2. 2. 节约了发酵培养的动力消耗，节约了发酵培养的动力消耗，3.3.并有利于减少染菌机会并有利于减少染菌机会 一般都将菌种扩大培养，进行两级发酵或三级发一般都将菌种扩大培养，进行两级发酵或三级发酵。接种量和培养物的生长过程的延缓期长短呈反比。酵。接种量和培养物的生长过程的延缓期长短呈反比。接种量过多也无必要。因培养种子费时，而且过多地接种量过多也无必要。因培养种子费时，而且过多地移人代谢废物，反而会影响正常发酵。移人代谢废物，反而

45、会影响正常发酵。 （四）培养基确定方法（四）培养基确定方法（1 1）首先必须做好调查研究工作，了解菌）首先必须做好调查研究工作，了解菌种的来源、生活习惯、生理生化特性和一种的来源、生活习惯、生理生化特性和一般的营养要求。般的营养要求。工业生产主要应用细菌、放线菌、酵母菌工业生产主要应用细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类微生物。它们对营养的要求和霉菌四大类微生物。它们对营养的要求既有共性，也有各自的特性，应根据不同既有共性，也有各自的特性，应根据不同类型微生物的生理特性考虑培养基的组成。类型微生物的生理特性考虑培养基的组成。 （2 2）其次，对生产菌种的培养条件，生物合成）其次，对生产菌种的培养条

46、件，生物合成的代谢途径，代谢产物的化学性质、分子结构、的代谢途径，代谢产物的化学性质、分子结构、一般提炼方法和产品质量要求等也需要有所了解，一般提炼方法和产品质量要求等也需要有所了解，以便在选择培养基时做到心中有数以便在选择培养基时做到心中有数（3 3）最好先选择一种较好的化学合成培养基做）最好先选择一种较好的化学合成培养基做基础，开始时先做一些摇瓶试验基础，开始时先做一些摇瓶试验; ;然后进一步做小型发酵罐培养，摸索菌种对各种然后进一步做小型发酵罐培养，摸索菌种对各种主要有机碳源和氮源的利用情况和产生代谢产物主要有机碳源和氮源的利用情况和产生代谢产物的能力。的能力。注意培养过程中的注意培养过

47、程中的pHpH变化，观察适合于菌种生长变化，观察适合于菌种生长繁殖和适合于代谢产物形成的两种不同繁殖和适合于代谢产物形成的两种不同pHpH，不断，不断调整配比来适应上述各种情况。调整配比来适应上述各种情况。（4 4）注意每次只限一个变动条件。有了初步结果以）注意每次只限一个变动条件。有了初步结果以后，先确定一个培养基配比。其次再确定各种重要后，先确定一个培养基配比。其次再确定各种重要的金属和非金属离子对发酵的影响，即对各种无机的金属和非金属离子对发酵的影响，即对各种无机元素的营养要求，试验其最高、最低和最适用量。元素的营养要求，试验其最高、最低和最适用量。在合成培养基上得出一定结果后，再做复合

48、培养基在合成培养基上得出一定结果后，再做复合培养基试验。最后试验各种发酵条件和培养基的关系。培试验。最后试验各种发酵条件和培养基的关系。培养基内养基内pHpH可由添加碳酸钙来调节，其他如硝酸钠、可由添加碳酸钙来调节，其他如硝酸钠、硫酸铵也可用来调节。硫酸铵也可用来调节。（5 5） 有些发酵产物，如抗生素等，除了配制培养有些发酵产物，如抗生素等，除了配制培养基以外，还要通过中间补料法，一面对碳及氮的代基以外，还要通过中间补料法，一面对碳及氮的代谢予以适当的控制，一面间歇添加各种养料和前体谢予以适当的控制，一面间歇添加各种养料和前体类物质，引导发酵走向合成产物的途径。类物质，引导发酵走向合成产物的

49、途径。（6 6）根据生产和科学研究的需要选择培养基）根据生产和科学研究的需要选择培养基(7)(7)根据经济效益选择培并基原料根据经济效益选择培并基原料（五）培养基的灭菌（五）培养基的灭菌主要湿热灭菌主要湿热灭菌空罐灭菌（空消）空罐灭菌（空消）实罐灭菌（实消）实罐灭菌（实消）连续灭菌（连消）连续灭菌（连消）二、发酵工程制药的过程与控制二、发酵工程制药的过程与控制一、菌种的扩大与培养一、菌种的扩大与培养 种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大活化

50、后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养培养, ,最终获得一定数量和质量的纯种过程。最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。这些纯种培养物称为种子。种子扩大培养的概念种子扩大培养的概念: :种子扩培的目的种子扩培的目的q 接种量的需要接种量的需要q 菌种的驯化菌种的驯化q 缩短发酵时间、保证生产水平缩短发酵时间、保证生产水平种子的要求：种子的要求：q 总量及浓度能满足要求总量及浓度能满足要求q 生理状况稳定，个体与群体生理状况稳定，个体与群体q 无杂菌污染无杂菌污染q 活力强，移种至发酵后，能够迅速生长活力强，移种至发酵后，能够迅速生长种子制备的过程种子制备的过程实验室阶段：

51、实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。生产车间阶段生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。段。几个与种子有关的参数：几个与种子有关的参数：发酵级数发酵级数种龄种龄接种量接种量 种子制备

52、过程举例种子制备过程举例一、谷氨酸生产的种子制备一、谷氨酸生产的种子制备制备过程制备过程斜面菌种斜面菌种一级种子培养一级种子培养二级种子培养二级种子培养发酵发酵1、斜面、斜面 (AS1.299)培养基：蛋白胨培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏，牛肉膏1%，氯化钠，氯化钠 0.5 琼脂琼脂 2%， pH 7.0-7.2培养基特点：培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细有利于菌体的生长，原料比较精细培养条件：培养条件：32，生长，生长18-24小时小时生长斜面要求：生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过生长良好，所使用斜面连续传代不超过 3次次2. 一级一级种子（摇瓶）种子（摇瓶）培养条件

53、：于培养条件：于1000ml三角瓶中，装液三角瓶中，装液200-250ml,32培培 养养12小时。小时。培养基：葡萄糖培养基：葡萄糖2%，尿素，尿素0.5%，玉米浆，玉米浆 2.5%， K2HPO4 0.1%培养基特点：培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基有利于菌体的生长，所使用的原料已经基 本接近于发酵培养基本接近于发酵培养基3. 二级种子二级种子(种子罐种子罐)培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%(10%)），）， 32培养培养7-10个小时个小时培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖

54、用水解糖代替， 浓度为浓度为2.5%培养基的特点培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基：长菌体，更接近于发酵培养基种子的质量要求：种子的质量要求：108-109个个/ml大小均匀，呈单个或八字排列大小均匀，呈单个或八字排列PH 7.0-7.2时结束，时结束，6.887.0-7.2活力旺盛活力旺盛二、青霉素生产的种子制备二、青霉素生产的种子制备制备过程制备过程安培管安培管 斜面孢子斜面孢子 大米孢子大米孢子 一级种子一级种子 二级种子二级种子 发酵发酵1、斜面孢子、斜面孢子培养基：甘油、培养基：甘油、 葡萄糖、葡萄糖、 蛋白胨等蛋白胨等培养基特点培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细有利于长孢

55、子，用量少而精细培养条件：培养条件：25、7天天, 注意湿度注意湿度50%左右左右2、大米孢子、大米孢子培养基：大米及氮源（玉米浆）培养基：大米及氮源（玉米浆）培养基的特点培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表成本低、米粒之间结构疏松提高比表面积和氧的传质，营养适当（要求大米面积和氧的传质，营养适当（要求大米的白点小）有利于孢子的生长。的白点小）有利于孢子的生长。培养条件：培养条件：25、7天，控制湿度天，控制湿度大米孢子的要求大米孢子的要求：1粒米含粒米含1.4*106个孢子个孢子3、一级种子、一级种子培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆目的目

56、的：长菌体长菌体培养条件：培养条件：27，40小时小时接种量：接种量：200亿孢子亿孢子/吨吨4、二级种子、二级种子培养基：同上培养基：同上培养条件：培养条件：27、10-14小时小时接种量：接种量：10%种子的质量要求种子的质量要求菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于期期青霉素发酵菌丝体的生长共分为青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期，个期，1-4为年青期，为年青期，4-6期合成青霉素的能力最强期合成青霉素的能力最强菌种筛选菌种筛选摇瓶试验摇瓶试验发酵罐试验发酵罐试验发酵方式发酵方式 ：（1 1）分批发酵法）分批发酵法( (间歇发酵法间歇发酵

57、法) ) ： 先将空罐杀菌，培养基装入发酵罐，先将空罐杀菌，培养基装入发酵罐，接种之后进行培养，在培养过程中，培接种之后进行培养，在培养过程中，培养基成分减少，微生物增殖。微生物周养基成分减少，微生物增殖。微生物周围的环境随时间而变化，是一种非稳态围的环境随时间而变化，是一种非稳态操作法。操作法。 此法不易染菌，但很难采用控制基此法不易染菌，但很难采用控制基质等浓度的方法来增大发酵生产能力。质等浓度的方法来增大发酵生产能力。目前多用在酒精、氨基酸、抗生素生产目前多用在酒精、氨基酸、抗生素生产中。中。 （2）连续培养法）连续培养法 在往发酵罐中连续供给新鲜培养基的同时，将含在往发酵罐中连续供给新

58、鲜培养基的同时，将含有微生物和产物的培养液，从发酵罐中连续放出，有微生物和产物的培养液，从发酵罐中连续放出，叫做连续培养法。叫做连续培养法。 其特点是能使微生物处于恒定不变的环境中进行其特点是能使微生物处于恒定不变的环境中进行长期持续的培养，该系统的稳态被叫做恒化器。同长期持续的培养，该系统的稳态被叫做恒化器。同时包含了流入和流出，属开放系统，故变异菌株和时包含了流入和流出，属开放系统，故变异菌株和杂菌污染随时间的延长而增大。从技术上也很难保杂菌污染随时间的延长而增大。从技术上也很难保证流入和流出速度的一致。证流入和流出速度的一致。 连续培养用于废水处理、葡萄糖酸发酵、酒精发连续培养用于废水处

59、理、葡萄糖酸发酵、酒精发酵等工业中。酵等工业中。（3）补料分批培养法）补料分批培养法(流加法流加法) 在分批培养时，不断地供给培养基，但在分批培养时，不断地供给培养基，但所需产物不到一定时刻不放出的方法，称所需产物不到一定时刻不放出的方法，称为补料分批培养法。为补料分批培养法。用于面包酵母、氨基酸、抗生素等工业。用于面包酵母、氨基酸、抗生素等工业。 思考题练习思考题练习1.1.培养基应具备微生物生长所需要的六大营养要素是：培养基应具备微生物生长所需要的六大营养要素是：2.2.什么是前体？什么是生长因子？生长因子的来源？什么是前体？什么是生长因子？生长因子的来源？什么是产物促进剂？产物促进剂举例

60、？什么是产物促进剂？产物促进剂举例？3.3.什么是种子的扩大培养？什么是种子的扩大培养？ 种子扩大培养的目的与种子扩大培养的目的与要求？种子扩大培养的一般步骤？要求？种子扩大培养的一般步骤？什么是接种量？对于细菌、放线菌及霉菌常用的接什么是接种量？对于细菌、放线菌及霉菌常用的接种量是多少？种量是多少？4.4.什么时发酵级数？发酵级数对发酵有何影响，影响什么时发酵级数？发酵级数对发酵有何影响，影响发酵级数的因素有哪些？发酵级数的因素有哪些？什么是种龄？事宜种龄确定的依据？什么是种龄？事宜种龄确定的依据？什么是一类发酵？二类发酵？三类发酵？什么是一类发酵？二类发酵？三类发酵？什么是连续培养？什么是

61、连续培养的稀释率？什么是连续培养？什么是连续培养的稀释率？To be continue发酵工程（三）发酵工程（三）主要内容：主要内容：1.发酵过程的控制发酵过程的控制（1）中间分析项目）中间分析项目（2）发酵过程的影响因素及分析）发酵过程的影响因素及分析（3）发酵终点的确定）发酵终点的确定2.发酵控制与中间补料视频讲座发酵控制与中间补料视频讲座中间分析项目中间分析项目 发酵过程的中间分析是生产控制的眼睛，它显发酵过程的中间分析是生产控制的眼睛，它显示了发酵过程中微生物的主要代谢变化。因为微生示了发酵过程中微生物的主要代谢变化。因为微生物个体极微小，肉眼无法看见，要了解它的代谢状物个体极微小，肉

62、眼无法看见，要了解它的代谢状况，只能从分析一些参数来判断，所以说中间分析况，只能从分析一些参数来判断，所以说中间分析是生产控制的眼睛。是生产控制的眼睛。 这些代谢参数又称为状态参数，因为它们反映这些代谢参数又称为状态参数，因为它们反映发酵过程中菌的生理代谢状况，如发酵过程中菌的生理代谢状况，如pH，溶氧，尾气，溶氧，尾气氧，尾气二氧化碳，粘度，菌浓度等氧，尾气二氧化碳，粘度，菌浓度等代谢参数按性质分可分三类：代谢参数按性质分可分三类：物理参数：物理参数：温度、搅拌转速、空气压力、空温度、搅拌转速、空气压力、空气流量、溶解氧、表观粘度、排气氧（二氧气流量、溶解氧、表观粘度、排气氧（二氧化碳）浓度

63、等化碳）浓度等化学参数：化学参数：基质浓度（包括糖、氮、磷）、基质浓度（包括糖、氮、磷）、pH、产物浓度、核酸量等、产物浓度、核酸量等生物参数：生物参数：菌丝形态、菌浓度、菌体比生长菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速率、呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活速率、呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力等力等从检测手段分可分为：直接参数、间接参数从检测手段分可分为：直接参数、间接参数直接参数：直接参数：通过仪器或其它分析手段可以测得的参数，通过仪器或其它分析手段可以测得的参数，如温度、如温度、pH、残糖等、残糖等间接参数：间接参数：将直接参数经过计算得到的参数，如摄氧将直接参数经过计算得到的参数，如摄氧率、率

64、、KLa等等1.产物产量产物产量 在培养过程中，产生菌的合成能力和产在培养过程中，产生菌的合成能力和产物积累情况都要通过产物量的测定来了解，物积累情况都要通过产物量的测定来了解，产物浓度直接反映了生产的状况产物浓度直接反映了生产的状况,是发酵控是发酵控制的重要参数。而且通过计算还可以得到制的重要参数。而且通过计算还可以得到生产速率和比生产速率，从而分析发酵条生产速率和比生产速率，从而分析发酵条件如补料、件如补料、pH对产物形成的影响。对产物形成的影响。2.pH值值反映微生物代谢反映微生物代谢基质代谢、产物合成、基质代谢、产物合成、细胞状态、营养状况、供氧状况；菌体生细胞状态、营养状况、供氧状况

65、；菌体生长和产物合成都需最适长和产物合成都需最适pH值值pH与微生物的生命活动密切相关与微生物的生命活动密切相关 酶催化活性酶催化活性3.糖含量糖含量 微生物生长和产物合成与糖代谢有密切关系。微生物生长和产物合成与糖代谢有密切关系。 糖的消耗糖的消耗 反映产生菌的生长繁殖情况反映产生菌的生长繁殖情况 反映产物合成的活力反映产物合成的活力 菌体生长旺盛糖耗一定快，残糖也就降低得快通过糖菌体生长旺盛糖耗一定快，残糖也就降低得快通过糖含量的测定，可以控制菌体生长速率，可控制补糖来调含量的测定，可以控制菌体生长速率，可控制补糖来调节节pH，促进产物合成，不致于盲目补糖，造成发酵不正，促进产物合成，不致

66、于盲目补糖，造成发酵不正常。常。 糖含量测定包括总糖和还原糖。糖含量测定包括总糖和还原糖。 总糖总糖指发酵液中残留的各种糖的总量。如发酵中的指发酵液中残留的各种糖的总量。如发酵中的淀粉、饴糖、单糖等各种糖淀粉、饴糖、单糖等各种糖。 还原糖还原糖指含有自由醛基的单糖，通常指的是葡萄糖。指含有自由醛基的单糖，通常指的是葡萄糖。4.氨基氮和氨氮氨基氮和氨氮 氨基氮氨基氮指有机氮中的氮（指有机氮中的氮（NH2-N），单位是），单位是mg/100ml。如氨基酸中的氮，黄豆饼粉、花生饼粉。如氨基酸中的氮，黄豆饼粉、花生饼粉中都有有机氮。中都有有机氮。 氨氮氨氮指无机氨中的氮（指无机氨中的氮（NH3-N）。

67、）。 氮利用快慢可分析出菌体生长情况，含氮产物合氮利用快慢可分析出菌体生长情况，含氮产物合成情况。但是氮源太多会促使菌体大量生长。有些成情况。但是氮源太多会促使菌体大量生长。有些产物合成受到过量铵离子的抑制，因此必须控制适产物合成受到过量铵离子的抑制，因此必须控制适量的氮。通过氨基氮和氨氮的分析可控制发酵过程，量的氮。通过氨基氮和氨氮的分析可控制发酵过程，适时采取补氨措施。发酵后期氨基氮回升，这时就适时采取补氨措施。发酵后期氨基氮回升，这时就要放罐，否则影响提取过程。要放罐，否则影响提取过程。5.磷含量磷含量 微生物体内磷含量较高，培养基中以磷微生物体内磷含量较高，培养基中以磷酸盐为主，发酵中

68、用来计算磷含量的是磷酸盐为主，发酵中用来计算磷含量的是磷酸根。酸根。 磷是核酸的组成部分，是高能化合物磷是核酸的组成部分，是高能化合物ATP的组成部分，磷还能促进糖代谢。因的组成部分，磷还能促进糖代谢。因此磷在培养基中具有非常重要的作用，如此磷在培养基中具有非常重要的作用，如果磷缺乏就要采取补磷措施。果磷缺乏就要采取补磷措施。6 6、菌浓度和菌形态、菌浓度和菌形态菌形态和菌浓度直接反映菌生长的情况。菌形态和菌浓度直接反映菌生长的情况。菌形态菌形态 显微镜观察显微镜观察菌浓度的测定是衡量产生菌在整个培养过程中菌菌浓度的测定是衡量产生菌在整个培养过程中菌体量的变化，一般前期菌浓增长很快，中期菌浓体

69、量的变化，一般前期菌浓增长很快，中期菌浓基本恒定。补料会引起菌浓的波动，这也是衡量基本恒定。补料会引起菌浓的波动，这也是衡量补料量适合与否的一个参数。补料量适合与否的一个参数。发酵过程的影响因素及控制发酵过程的影响因素及控制1.菌体浓度的影响和控制菌体浓度的影响和控制2.营养物质对发酵的影响和控制营养物质对发酵的影响和控制3.温度的影响控制温度的影响控制4.pH值的影响控制值的影响控制5.溶氧的影响控制溶氧的影响控制6.染菌的影响及控制染菌的影响及控制7.CO2的影响及控制的影响及控制8.泡沫的影响及控制泡沫的影响及控制1.菌体浓度的影响和控制：菌体浓度的影响和控制：C大：产物的产量大；但营养

70、物质消耗快大：产物的产量大；但营养物质消耗快营养成分改变，有毒物质累计营养成分改变，有毒物质累计，摄氧，摄氧，影，影响产物合成响产物合成C低：产物含量低低：产物含量低控制：基础培养基比例适当、中间补料控制：基础培养基比例适当、中间补料2.营养物质对发酵的影响和控制营养物质对发酵的影响和控制C源源N源源P酸盐酸盐补料补料总原则：即满足总原则：即满足菌体菌体生长生长又适合又适合产物合成产物合成 通常在生物学范围内每升高通常在生物学范围内每升高1010，生，生长速度就加快一倍，所以温度直接影响酶长速度就加快一倍，所以温度直接影响酶反应，对于微生物来说，温度直接影响其反应，对于微生物来说，温度直接影响

71、其生长和合成酶。生长和合成酶。 机体的重要组成如蛋白质、核酸等都对机体的重要组成如蛋白质、核酸等都对温度较敏感，随着温度的增高有可能遭受温度较敏感，随着温度的增高有可能遭受不可逆的破坏。不可逆的破坏。 微生物可生长的温度范围较广，总体微生物可生长的温度范围较广，总体说在说在-10-109595。3.温度的影响控制温度的影响控制温度对生长的影响：温度对生长的影响： 不同微生物的生长对温度的要求不同，根不同微生物的生长对温度的要求不同，根据它们对温度的要求大致可分为四类：嗜冷据它们对温度的要求大致可分为四类：嗜冷菌适应于菌适应于026生长，嗜温菌适应于生长，嗜温菌适应于1543生长，嗜热菌适应于生

72、长，嗜热菌适应于3765生长，嗜生长，嗜高温菌适应于高温菌适应于65以上生长以上生长 每种微生物对温度的要求可用最适温度、最高温每种微生物对温度的要求可用最适温度、最高温度、最低温度来表征。在最适温度下，微生物生长迅度、最低温度来表征。在最适温度下，微生物生长迅速；超过最高温度微生物即受到抑制或死亡；在最低速；超过最高温度微生物即受到抑制或死亡；在最低温度范围内微生物尚能生长，但生长速度非常缓慢，温度范围内微生物尚能生长，但生长速度非常缓慢，世代时间无限延长。在最低和最高温度之间，微生物世代时间无限延长。在最低和最高温度之间，微生物的生长速率随温度升高而增加，超过最适温度后，随的生长速率随温度

73、升高而增加，超过最适温度后，随温度升高，生长速率下降，最后停止生长，引起死亡。温度升高，生长速率下降，最后停止生长，引起死亡。 微生物受高温的伤害比低温的伤害大，即超过最微生物受高温的伤害比低温的伤害大，即超过最高温度，微生物很快死亡；低于最低温度，微生物代高温度，微生物很快死亡；低于最低温度，微生物代谢受到很大抑制，并不马上死亡。这就是菌种保藏的谢受到很大抑制，并不马上死亡。这就是菌种保藏的原理。原理。温度影响发酵方向温度影响发酵方向四环素产生菌金色链霉菌同时产生金霉素和四环素产生菌金色链霉菌同时产生金霉素和四环素，当温度低于四环素，当温度低于300C时，这种菌合成金时，这种菌合成金霉素能力

74、较强；温度提高，合成四环素的比霉素能力较强；温度提高，合成四环素的比例也提高，温度达到例也提高，温度达到350C时，金霉素的合成时，金霉素的合成几乎停止，只产生四环素。几乎停止，只产生四环素。温度还影响基质溶解度，氧在发酵液中的溶温度还影响基质溶解度，氧在发酵液中的溶解度也影响菌对某些基质的分解吸收。因此解度也影响菌对某些基质的分解吸收。因此对发酵过程中的温度要严格控制。对发酵过程中的温度要严格控制。最适温度的选择：最适温度的选择：1 1、根据菌种及生长阶段选择、根据菌种及生长阶段选择 微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的温度范围也不同

75、。要求的温度范围也不同。 如黑曲霉生长温度为如黑曲霉生长温度为370C， 谷氨酸产生菌棒状杆菌的生长温度为谷氨酸产生菌棒状杆菌的生长温度为30320C， 青霉菌生长温度为青霉菌生长温度为300C。在发酵前期由于菌量少，发酵目的是要尽快达到大量的菌体，在发酵前期由于菌量少，发酵目的是要尽快达到大量的菌体，取稍高的温度，促使菌的呼吸与代谢，使菌生长迅速；取稍高的温度，促使菌的呼吸与代谢，使菌生长迅速；在中期菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，在中期菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提高产量，因此中期温度要稍低一些，可以推迟衰老。因从而提高产量，因此中期温度要稍低一些，可以

76、推迟衰老。因为在稍低温度下氨基酸合成蛋白质和核酸的正常途径关闭得比为在稍低温度下氨基酸合成蛋白质和核酸的正常途径关闭得比较严密有利于产物合成。较严密有利于产物合成。发酵后期，产物合成能力降低，延长发酵周期没有必要，就发酵后期，产物合成能力降低，延长发酵周期没有必要，就又提高温度，刺激产物合成到放罐。如四环素生长阶段又提高温度，刺激产物合成到放罐。如四环素生长阶段280C，合成期合成期260C后期再升温；黑曲霉生长后期再升温；黑曲霉生长370C，产糖化酶，产糖化酶32340C。但也有的菌种产物形成比生长温度高。如谷氨酸产生菌。但也有的菌种产物形成比生长温度高。如谷氨酸产生菌生长生长30320C，

77、产酸，产酸34370C。最适温度选择要根据菌种与。最适温度选择要根据菌种与发酵阶段做试验。发酵阶段做试验。2 2、根据培养条件选择、根据培养条件选择 温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。些，溶氧浓度也可髙些。培养基稀薄时，温度也该培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。低些。因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。3 3、根据菌生长情况、根据菌生长情况 菌生长快，维持在较高温度时间要短些；菌生长菌生长快，维持在

78、较高温度时间要短些；菌生长慢，维持较高温度时间可长些。培养条件适宜，如营慢，维持较高温度时间可长些。培养条件适宜，如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可髙些，以利于养丰富，通气能满足，那么前期温度可髙些，以利于菌的生长。菌的生长。 总的来说，温度的选择根据菌种生长阶段及培养总的来说，温度的选择根据菌种生长阶段及培养条件综合考虑。要通过反复实践来定出最适温度。条件综合考虑。要通过反复实践来定出最适温度。 pH是微生物代谢的综合反映，又影响代谢的是微生物代谢的综合反映，又影响代谢的进行，所以是十分重要的参数。进行，所以是十分重要的参数。 发酵过程中发酵过程中pH是不断变化的，通过观察是不断变化的，

79、通过观察pH变变化规律可以了解发酵的正常与否化规律可以了解发酵的正常与否4.pH值的影响控制值的影响控制发酵过程发酵过程pH变化的原因：变化的原因：1 1、基质代谢、基质代谢 （1 1）糖代谢）糖代谢 特别是快速利用的糖，分解成小特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使分子酸、醇，使pHpH下降。糖缺乏，下降。糖缺乏，pHpH上升，是补料上升，是补料的标志之一的标志之一（2 2）氮代谢）氮代谢 当氨基酸中的当氨基酸中的-NH-NH2 2被利用后被利用后pHpH会会下降；尿素被分解成下降；尿素被分解成NHNH3 3，pHpH上升，上升，NHNH3 3利用后利用后pHpH下下降，当碳源不足时氮源

80、当碳源利用降，当碳源不足时氮源当碳源利用pHpH上升。上升。（3 3）生理酸碱性物质利用后）生理酸碱性物质利用后pHpH会上升或下降会上升或下降2 2、 产物形成产物形成 某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pHpH变变化。如有机酸类产生使化。如有机酸类产生使pHpH下降，红霉素、洁下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pHpH上升。上升。 3 3、菌体自溶，、菌体自溶，pHpH上升，发酵后期，上升，发酵后期，pHpH上升。上升。 pHpH对发酵的影响对发酵的影响 （1）pH影影响响酶酶的的活活性性。当当pH值值抑抑制制

81、菌菌体体某某些些酶酶的活性时使菌的新陈代谢受阻的活性时使菌的新陈代谢受阻（2）pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变，从而值影响微生物细胞膜所带电荷的改变，从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的排泄，因此影响新陈代谢的进行代谢物的排泄，因此影响新陈代谢的进行 （3）pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离，值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用从而影响微生物对这些物质的利用 （4）pH影响代谢方向影响代谢方向 pH不不同同，往往往往引引起起菌菌体体代代谢谢过过程程不不同同，使使代代谢谢产产物物的的

82、质质量量和和比比例例发发生生改改变变。例例如如黑黑曲曲霉霉在在pH23时时发发酵酵产产生生柠柠檬檬酸酸，在在pH近近中中性性时时，则产生草酸。则产生草酸。谷谷氨氨酸酸发发酵酵，在在中中性性和和微微碱碱性性条条件件下下积积累累谷谷氨氨酸酸，在在酸酸性性条条件件下下则则容容易易形形成成谷谷氨氨酰酰胺胺和和N-乙乙酰谷氨酰胺酰谷氨酰胺pHpH在微生物培养的不同阶段有不同的影响在微生物培养的不同阶段有不同的影响 生长合成pH对菌体生长影响比产物合成影响小对菌体生长影响比产物合成影响小例例 青青霉霉素素：菌菌体体生生长长最最适适pH3.56.0,产产物物合合成成最最适适pH7.27.4 四四环环素素：菌

83、菌体体生生长长最最适适pH6.06.8，产产物物合合成成最最适适pH5.86.0XpH四四环环素素最佳最佳pHpH的确定的确定配制不同初始配制不同初始pH的培养基，摇瓶考察发酵情的培养基，摇瓶考察发酵情况况pH对产海藻酸裂解酶的影响对产海藻酸裂解酶的影响pHpH的控制的控制 1 1、调调节节好好基基础础料料的的pHpH。基基础础料料中中若若含含有有玉玉米米浆浆，pHpH呈呈酸酸性性，必必须须调调节节pHpH。若若要要控控制制消消后后pHpH在在6.06.0，消前，消前pHpH往往要调到往往要调到6.56.86.56.82 2、在基础料中加入维持、在基础料中加入维持pHpH的物质的物质，如如Ca

84、COCaCO3 3 ，或具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液等具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液等3 3、通过补料调节、通过补料调节pHpH 4 4、当补料与调、当补料与调pHpH发生矛盾时，加酸碱发生矛盾时，加酸碱调调pH pH 6.染菌的影响及控制染菌的影响及控制发酵过程污染杂菌，会严重的影响生产，是发发酵过程污染杂菌，会严重的影响生产，是发酵工业的致命伤。酵工业的致命伤。l造成大量原材料的浪费，在经济上造成巨大造成大量原材料的浪费，在经济上造成巨大损失损失l扰乱生产秩序，破坏生产计划。扰乱生产秩序，破坏生产计划。l遇到连续染菌，特别在找不到染菌原因往往遇到连续染菌，特别在找不到染菌原因往往会影

85、响人们的情绪和生产积极性。会影响人们的情绪和生产积极性。l影响产品外观及内在质量影响产品外观及内在质量发酵染菌对不同品种的影响发酵染菌对不同品种的影响放线菌由于生长的最适放线菌由于生长的最适pH为为7左右，因此染细左右，因此染细菌为多，而霉菌生长菌为多，而霉菌生长pH为为5左右，因此染酵母菌左右，因此染酵母菌为多。为多。青霉素发酵染菌青霉素发酵染菌，绝大多数杂菌都能直接产生，绝大多数杂菌都能直接产生青霉素酶，而另一些杂菌则可被青霉素诱导而产青霉素酶，而另一些杂菌则可被青霉素诱导而产生青霉素酶。不论在发酵前期、中期或后期，染生青霉素酶。不论在发酵前期、中期或后期，染有能产生青霉素酶的杂菌，都能使

86、青霉素迅速破有能产生青霉素酶的杂菌，都能使青霉素迅速破坏。坏。 链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素等虽不象青等虽不象青霉素发酵染菌那样一无所得，但也会造成不同程度霉素发酵染菌那样一无所得，但也会造成不同程度的危害。如杂菌大量消耗营养干扰生产菌的正常代的危害。如杂菌大量消耗营养干扰生产菌的正常代谢；改变谢；改变pH，降低产量。，降低产量。灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑制霉菌，等抗生素抑制霉菌，对细菌几乎没有抑制和杀灭作用。对细菌几乎没有抑制和杀灭作用。发酵终点的确定发酵终点的确定迟滞期迟滞期对数生长期对数生长期稳稳 定定 期期死亡

87、期死亡期参数：参数：抗生素单位抗生素单位过滤速度过滤速度氨基氮氨基氮菌丝形态菌丝形态pH值值发酵液外观及粘度等发酵液外观及粘度等发酵工程（四）发酵工程（四）基因工程菌的发酵基因工程菌的发酵何为基因工程菌？宿主系统有哪些？何为基因工程菌？宿主系统有哪些？基因工程菌菌发酵培养的目的和生产基因工程菌菌发酵培养的目的和生产特点特点基因工程菌生产的产品基因工程菌生产的产品基因工程菌基因工程菌：在生物体外对：在生物体外对DNA分子进分子进行重组，然后克隆到适合的宿主细胞进行重组，然后克隆到适合的宿主细胞进行增殖和表达，所得到的重组体菌株即行增殖和表达，所得到的重组体菌株即为工程菌为工程菌宿主细胞宿主细胞-

88、载体系统载体系统：大肠杆菌大肠杆菌、G+细菌细菌、酵母酵母、哺乳动物细胞哺乳动物细胞（一）基因工程菌及宿主系统（一）基因工程菌及宿主系统1 1、大肠杆菌、大肠杆菌如果产品翻译后不需要修饰，大肠杆菌是最如果产品翻译后不需要修饰，大肠杆菌是最普遍选用的宿主。普遍选用的宿主。优点：优点：l人们对大肠杆菌的生理学和遗传学背景了解人们对大肠杆菌的生理学和遗传学背景了解得比其他任何生物深。有利于进行复杂的基得比其他任何生物深。有利于进行复杂的基因操作；因操作；l大肠杆菌有相当高的生长速率，并能长到高大肠杆菌有相当高的生长速率，并能长到高细胞浓度（细胞浓度（50g/l）；）；l大肠杆菌能生长在简单的便宜的培

89、养基上。大肠杆菌能生长在简单的便宜的培养基上。 这些因素给大肠杆菌许多经济上的优势。但大肠这些因素给大肠杆菌许多经济上的优势。但大肠杆菌不是完美的宿主。主要问题是大肠杆菌杆菌不是完美的宿主。主要问题是大肠杆菌分泌分泌(secretion)的蛋白通常在细胞内的蛋白通常在细胞内，当这些蛋白达到高，当这些蛋白达到高浓度时，会被水解或形成不溶的浓度时，会被水解或形成不溶的包含体包含体。其中主要是。其中主要是外源蛋白，但也含有其它细胞物质。包含体中的蛋白外源蛋白，但也含有其它细胞物质。包含体中的蛋白是不折叠的，不折叠的蛋白没有生物活性，必须重新是不折叠的，不折叠的蛋白没有生物活性，必须重新溶解并使它复性

90、。溶解并使它复性。 大量的外源蛋白的产生会触发热冲击响应。热冲击大量的外源蛋白的产生会触发热冲击响应。热冲击调节子的一种响应是增加调节子的一种响应是增加蛋白水解酶的活性蛋白水解酶的活性。在一些。在一些情况下，细胞内蛋白水解酶是使蛋白的降解速率几乎情况下，细胞内蛋白水解酶是使蛋白的降解速率几乎等于产生的速率。等于产生的速率。2 2、G G+ +细菌细菌 枯草杆菌是可替代大肠杆菌的菌种，它是枯草杆菌是可替代大肠杆菌的菌种，它是G+菌，菌，它没有外膜，并且能把蛋白分泌（它没有外膜，并且能把蛋白分泌（excretion）到）到胞外。它的这一性质对生产非常有吸引力。然而胞外。它的这一性质对生产非常有吸引

91、力。然而枯草杆菌有许多问题妨碍它在商业上的采用。主枯草杆菌有许多问题妨碍它在商业上的采用。主要是枯草杆菌产生大量的蛋白酶，会很快降解产要是枯草杆菌产生大量的蛋白酶，会很快降解产物。而且枯草杆菌基因构建比大肠杆菌困难，质物。而且枯草杆菌基因构建比大肠杆菌困难，质粒稳定性也比较差，所以在使用上有较大的限制，粒稳定性也比较差，所以在使用上有较大的限制， 酿酒酵母是第一个被人利用的生物，它的酿酒酵母是第一个被人利用的生物，它的最大生长速率是大肠杆菌的最大生长速率是大肠杆菌的25%，酵母比最大，酵母比最大的细菌大，容易从发酵液中回收。酵母有简单的细菌大，容易从发酵液中回收。酵母有简单糖基化能力和分泌蛋白

92、的能力。这些是它的优糖基化能力和分泌蛋白的能力。这些是它的优点。但酵母达到高表达水平比大肠杆菌困难，点。但酵母达到高表达水平比大肠杆菌困难，外源蛋白分泌到胞外也有限，现在发展了其他外源蛋白分泌到胞外也有限，现在发展了其他的酵母如甲醇营养型酵母等。的酵母如甲醇营养型酵母等。当产生是外源蛋白需要复杂的糖基化和翻译后当产生是外源蛋白需要复杂的糖基化和翻译后修饰时，低等真核细胞就不能适应，要用动物修饰时，低等真核细胞就不能适应，要用动物细胞组织培养来达到。细胞组织培养来达到。3 3、酵母菌、酵母菌4、哺乳动物细胞、哺乳动物细胞 哺乳动物细胞在表达时有正确的氨基酸排列，哺乳动物细胞在表达时有正确的氨基酸

93、排列，而且所有转录后处理与在整个动物中相同，在某种而且所有转录后处理与在整个动物中相同，在某种情况下可能转录后修饰有些不同但它可提供情况下可能转录后修饰有些不同但它可提供最接近最接近于天然副本的产物于天然副本的产物，此外多数产物，此外多数产物可以分泌到胞外可以分泌到胞外。 但动物细胞生长缓慢，培养基价格昂贵，蛋白表但动物细胞生长缓慢，培养基价格昂贵，蛋白表达水平较低。用于重组达水平较低。用于重组DNA 生产蛋白的最常用的生产蛋白的最常用的宿主是宿主是CHO（中国仓鼠卵巢细胞）。（中国仓鼠卵巢细胞）。（二）利用基因工程菌生产的特点（二）利用基因工程菌生产的特点l基因工程菌带有外源基因，外源基因可

94、能在质基因工程菌带有外源基因，外源基因可能在质粒上也可能整合到染色体上，这些基因可能不稳粒上也可能整合到染色体上，这些基因可能不稳定。丢失外源基因的菌往往比未丢失的菌生长快定。丢失外源基因的菌往往比未丢失的菌生长快得多，这样就会大大降低产物的表达。为了抑制得多，这样就会大大降低产物的表达。为了抑制基因丢失的菌的生长，一般在培养中加入选择压基因丢失的菌的生长，一般在培养中加入选择压力，如抗生素。力，如抗生素。l基因工程菌的培养一般分两段。前期是菌体生基因工程菌的培养一般分两段。前期是菌体生长，生长到某一阶段，加入诱导因子，诱发产物长，生长到某一阶段，加入诱导因子，诱发产物表达。表达。三、基因不稳

95、定性三、基因不稳定性 生产的目标是得到最大量的外源蛋白，但是生产的目标是得到最大量的外源蛋白，但是大量外源蛋白的形成对宿主细胞是有损害的，通大量外源蛋白的形成对宿主细胞是有损害的，通常是致死的，失去制造外源蛋白的能力的细胞一常是致死的，失去制造外源蛋白的能力的细胞一般生长得快得多，从而能替代有生产能力的菌株，般生长得快得多，从而能替代有生产能力的菌株，这就导致基因的不稳定性。这就导致基因的不稳定性。基因的不稳定性原因：基因的不稳定性原因：l分离丢失、分离丢失、l结构不稳定性结构不稳定性l宿主细胞调节突变宿主细胞调节突变 当细胞分裂时一个子当细胞分裂时一个子细胞没有接受质粒就细胞没有接受质粒就出

96、现分离丢失出现分离丢失指外源基因从质粒上丢指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变致工程菌性能的改变改变细胞调节，结果减少改变细胞调节，结果减少目标蛋白的合成。目标蛋白的合成。（四）基因工程菌生产的产品（四）基因工程菌生产的产品基因工程菌生产的主要产品有二类，蛋白质和基因工程菌生产的主要产品有二类，蛋白质和非蛋白质。非蛋白质。非蛋白质产物可以通过代谢工程细胞来获得，非蛋白质产物可以通过代谢工程细胞来获得，这些细胞插入编码酶的这些细胞插入编码酶的DNA，产生新的途径或增，产生新的途径或增强某一途径，从而得到新的化合物或增加产量。强某一途径，从而得到新的化合物

97、或增加产量。现代基因工程重点在蛋白质产物上，主要产品现代基因工程重点在蛋白质产物上，主要产品如下：如下： 产品最主要的用于人的治疗，此外还有用于畜牧产品最主要的用于人的治疗，此外还有用于畜牧业、食品或工业用的生物催化剂。用于注射用的治业、食品或工业用的生物催化剂。用于注射用的治疗蛋白要求高度纯化，由于病人可能产生的强的免疗蛋白要求高度纯化，由于病人可能产生的强的免疫反应或副作用是灾难性的。疫反应或副作用是灾难性的。 有的蛋白转译后还要进行修饰，如糖基化、磷酸有的蛋白转译后还要进行修饰，如糖基化、磷酸化后才有活性。化后才有活性。 治疗蛋白最主要的是保证产品的质量和安全，降治疗蛋白最主要的是保证产品的质量和安全，降低成本并不重要，由于这些产品大多用量很小，价低成本并不重要，由于这些产品大多用量很小，价格高，附加值高。格高，附加值高。发酵工程在制药工业上的应用发酵工程在制药工业上的应用抗生素发酵生产抗生素发酵生产AA发酵生产发酵生产维生素发酵生产维生素发酵生产The end