细菌内毒素检查法ppt课件

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1、实验本卷须知及影响实验结果的要素分析一、实验本卷须知二、影响实验结果的要素分析三、企业产品优势一、实验操作本卷须知2005年版P297细菌内毒素检查法实验前，须用肥皂洗手，用75酒精棉球消毒。在运用洗耳球、移液管取样时，应留意不要将洗耳球中的气体吹入溶液中，以防止气体中的内毒素进入供试液。复溶0.5ml鲎试剂时，在旋涡混合器上点击1-3秒，促进鲎试剂的溶解。由于凝集反响是不可逆的，所以在反响过程中及察看结果时应留意不要使试管遭到振动，以免使凝胶破碎产生假阴性结果。进展干扰实验时，规范对照系列和含内毒素的供试品溶液系列应同时进展，并运用同一支细菌内毒素规范品。在进展鲎试剂灵敏度复核、干扰实验和供

2、试品细菌内毒素检查时，各个实验中要求的对照应同时进展，并在实验有效的情况才干进展计算和判别。在进展鲎试剂灵敏度复核、干扰实验和供试品细菌内毒素检查时，各个实验中要求的对照应同时进展，并在实验有效的情况才干进展计算和判别。二、实验误差分析及改良措施鲎试剂质量及灵敏度标示值得的影响 细菌内毒素任务规范品效价及运用的影响实验器皿的的影响样品成份及理化性质的影响实验员的影响 环境的影响 1 1、鲎试剂质量及灵敏度标示值得的影响、鲎试剂质量及灵敏度标示值得的影响 鲎试剂的质量：抗干扰才干，稳定性；鲎试剂的质量：抗干扰才干，稳定性；鲎试剂灵敏度标示值的准确性鲎试剂灵敏度标示值的准确性 。1、鲎试剂灵敏度的

3、误差 能否用细菌内毒素国家规范品标定？标示值能否准确？ 不同厂家的鲎试剂虽然标示值一样，但依然存在较大的误差。比如，标示值为0.5EU/ml的鲎试剂，有的真实灵敏度能够是0.65EU/ml；而另一个厂家的鲎试剂能够是0.30EU/ml时，按0.5-2误差规范都是合格产品，但对同一检品在一样的稀释倍数下，这两个厂家的鲎试剂产品对内毒素的检出程度却不同。 我本公司对鲎试剂质量得控制：原料；工艺用水；消费环节；灵敏度标定。标示灵敏度国家标准企业标准0.50EU/ml0.26EU/ml0.50EU/ml0.42EU/ml0.50EU/ml0.25EU/ml0.126EU/ml0.25EU/ml0.21

4、EU/ml0.25EU/ml鲎试剂的活性只能控制在某一个范围内，不能够控制在一个点，我们要求允许动摇的范围尽能够的小减少批间误差。2、细菌内毒素规范品引起的误差细菌内毒素规范品种类细菌内毒素规范品效价误差细菌内毒素规范品操作误差细菌内毒素单位表示误差 细菌内毒素规范品的错误运用 1、细菌内毒素规范品种类细菌内毒素国际规范品细菌内毒素国家规范品细菌内毒素任务规范品 细菌内毒素国家规范品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素任务规范品的效价。 细菌内毒素任务规范品系以细菌内毒素国家规范品为基准标定其效价，用于实验中鲎试剂灵敏度复核、干扰实验及各种阳性对照。20

5、05年版2、细菌内毒素规范品效价误差 细菌内毒素国家规范品与细菌内毒素任务规范品之间或细菌内毒素任务规范品与细菌内毒素任务规范品之间的生物效价存在一定的误差，用不同细菌内毒素规范品复核同一批鲎试剂灵敏度时能够存在一定的误差。中国药典要求“当c在0.5-2(包括0.5和2)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度为该批鲎试剂的灵敏度。实验结果只需在这合格范围内表示鲎试剂标示灵敏度准确。3、内毒素规范品操作误差 取细菌内毒素任务规范一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，再用砂轮在瓶颈上部悄然划痕，用75%酒精棉球擦拭后启开，防止玻璃屑落入瓶内。正确正确易折点错误易折点错误留意：只能在安瓿的易折点上部开

6、启内毒素，不能沿易折点开启，防止振荡过程中内毒素粘在封口膜上。 只能取1ml的细菌内毒素检查用水复溶细菌内毒素任务规范品。 假设运用的为细菌内毒素国家规范品，可按其运用阐明书中的方法将其稀释至规定浓度后分装保管。假设为细菌内毒素任务规范品，为一次性运用。 4、错误运用 有部分客户运用厂家消费的细菌内毒素来复核鲎试剂的灵敏度，这是一种错误行为，更有甚者运用厂家消费的细菌内毒素来交叉复核鲎试剂的灵敏度，这是一种严重错误行为。 3、实验器皿的影响器皿的计量管理校正器皿的选择规范器皿的正确处置1、器皿的选择规范 鲎实验对器皿的要求：刻度准确；内外表光滑；易于清理。细菌内毒素检查实验不宜选用注射器，最好

7、运用经过校正的刻度玻璃吸管或吸嘴。注射器刻度不准确，内壁磨沙面吸附内毒素，而且要特别留意注射器针头引入的铁离子对实验结果的干扰，故不宜选用注射器。 假设用量不大，运用频率不高，建议大家选用本公司提供的一次性耗材。无热原耗材是一种在此行业中被鉴定为无内毒素和-葡聚糖污染的产品，其中包括, 无热原试管、无热原移液器吸头。这些产品可以给您的任务带来很大方便,另外，当实验出现误差时可首先排除器皿方面的要素,很快分析判别出误差缘由。 2、器皿的正确处置2005年版278页细菌内毒素检查法“实验预备规定：“将被洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并烘干水分后，置洗液中浸泡4小时，取出将洗液沥干，用自来水将剩

8、余的洗液洗净，再用蒸馏水冲洗枯燥后置适宜的密闭金属容器中，迅速置烤箱中，除去玻璃器皿外表能够存在的外源性内毒素。应该特别留意，该规程明确规定最后冲洗玻璃器皿必需“用蒸馏水冲洗，禁用纯化水冲洗。有的客户运用反浸透制备的纯化水冲洗实验用玻璃器皿，结果实验中一切的阳性对照都为阴性，复核鲎试剂灵敏度时实验结果误差较大，这主要是由于纯化水和蒸馏水的质量不同所呵斥的。因纯化水中存在的阴阳离子经250高温干烤不能完全被破坏，这时不同的离子就产生对鲎试剂酶反响抑制或加强的反响，为了保证实验结果的准确性和检验报告的权威性，我们应该严厉遵守操作规程，用多效蒸馏水冲洗鲎实验用玻璃器皿。移液管浸泡洗液时，应如何放置移

9、液管浸泡洗液时，应如何放置？A A、正、正 B B、反、反反放尖端向上的优点？反放尖端向上的优点？1 1、维护移液管刻度的准确性；、维护移液管刻度的准确性；2 2、防止标本缸底部结晶体堵塞移、防止标本缸底部结晶体堵塞移液管。液管。4 4、样品成份及理化性品成份及理化性质的影响的影响 -葡聚糖葡聚糖样物物质的影响的影响PHPH值的影响的影响金属离子和弱酸阴离子的影响金属离子和弱酸阴离子的影响药物物浓度的影响度的影响 1 1、 - -葡聚糖葡聚糖样物物质的影响的影响常常见景象：假阳性。景象：假阳性。鲎试剂的特异性系指在的特异性系指在药品、生物制品和血品、生物制品和血液制品中液制品中鲎试剂能准确能准

10、确测出被出被测物物质内毒素内毒素的才干，既不能呵斥的才干，既不能呵斥样品内毒素的漏品内毒素的漏检，也，也不能将其它物不能将其它物质错判判为内毒素。内毒素。目前我公司研讨证明，知能与鲎试剂发生反响的物质有细菌内毒素和-葡聚糖，而内毒素反响曲线为S型特征曲线，-葡聚糖反响曲线为经过0点的斜线。鲎试剂的特异性差的另一种表现，是将其它物质如-葡聚糖断定为内毒素，错误将合格药品判为不合格，呵斥制药厂直接经济损失。鲎试剂反响机理图判别假阳性的方法：1、特异性鲎试剂法；2、定量反响曲线分析法；3、家兔模拟实验法。假阳性事件：1、2003年山东省青州某制药厂，5%葡萄糖注射液规格：100ml 产品批号：030

11、7040101；2、2004年广东省湛江某制药公司，Vc注射液产品批号：；3、2006年上海市某制药公司，塑瓶装5%葡萄糖注射液产品批号：0501142；2 2、PHPH值对反响速度的影响反响速度的影响常常见景象：景象：样品阳性不成立。品阳性不成立。鲎试剂与内毒素反响的最适与内毒素反响的最适宜宜pHpH在在6.5-8.06.5-8.0；pH 3 pH 3 或或1010时，酶活性遭到抑制。活性遭到抑制。相对活力PH7.0PH对反响速度的影响:影响酶原的激活；影响酶分子的构象，过高过低的PH会改动酶的活性中心的构象，或甚至改动整个酶分子的机构使其变性失活。 故鲎实验时，供试品 pH 最好应预调和6

12、.5-8.0 为好，必要时可用无内毒素的 HCl 或NaOH 稀溶液调理 pH 值。美国、日本药局方以及中国药典故2005版规定检品必需调理PH值6.0-8.0。胜利案例：1、头孢吡肟2、盐酸土霉素、土霉素3、喹诺酮类输液4、血液保管液、红细胞保管液3 3、金属离子和弱酸阴离子、金属离子和弱酸阴离子 离子对细菌内毒素测定结果影响较离子对细菌内毒素测定结果影响较大，一方面阳离子如大，一方面阳离子如Fe3+Fe3+、Al3+Al3+强度较强度较大会引起内毒素的聚集呵斥内毒素部分大会引起内毒素的聚集呵斥内毒素部分浓度过高，同时还必需留意高价阳离子浓度过高，同时还必需留意高价阳离子如如Fe3+Fe3+

13、的氧化性对鲎试剂酶反响具的氧化性对鲎试剂酶反响具有强抑制造用；重金属离子如有强抑制造用；重金属离子如Ag+Ag+、Cu2+Cu2+、Pb2+Pb2+可以使蛋白量变性而使酶失活；另可以使蛋白量变性而使酶失活；另一方面鲎试剂必需在二价阳离子一方面鲎试剂必需在二价阳离子Ca2+Ca2+、Mg2+Mg2+的参与下才干被激活构成凝胶反响。的参与下才干被激活构成凝胶反响。许多药物因PH值10时，其中的阴离子会吸收鲎试剂中的 Ca2+、Mg2+离子，使实验呈假阴性。胜利案例：1、碳酸氢钠注射液2、乙肝疫苗3、注射用果糖二磷酸钠4 4、药物浓度、药物浓度1 1、10%10%葡萄糖注射液葡萄糖注射液2 2、白蛋

14、白、小牛血清、白蛋白、小牛血清3 3、医用透明质酸钠、医用透明质酸钠4 4、中药类注射液、中药类注射液 5、实验员的影响操作时严厉按操作规程进展，安瓿开启前应先用酒精棉球擦拭曲颈部，用将颈部折断，防止碎玻屑掉入安瓿内。在鲎试剂的溶解、样品的稀释及加样时，取样均应准确。假设一人独立完成实验，可先稀释配制好内毒素规范溶液和样品溶液，然后开启复溶鲎试剂，最后加样，尽能够缩短鲎试剂溶液暴露在空气中的时间最好控制在15分钟内。6、环境的影响保温时间保温温度1、保温温度 将细菌内毒素任务规范品用细菌内毒素检查用水稀释成2，进展鲎实验，然后分别放置于25、28、31、34、37、41、43、46、49水浴保

15、温。实验中察看到凝胶构成的速度随着温度的升高而加快，但到达49保温90min也未出现凝胶。 从实验可以看出，温度对鲎试剂的灵敏度影响很大，保温温度在2541之间，随着温度的升高，反响速度也升高，41尚未到达反响速度峰值，25 时反响速度已相当快；在4146之间，温度对鲎试剂的灵敏度无明显影响；到达49或更高温度时，随温度升高而使酶蛋白逐渐变性，那么鲎试剂被破坏，反响速度反而降低。 2、保温时间 将细菌内毒素任务规范品用细菌内毒素检查用水稀释成2，进展鲎实验，37保温，分别在10、20、30、40、50、70min时察看，发现凝胶的构成形状随着时间的延伸而巩固。 因此夏天室温较高，假设实验操作时

16、间太长，细菌内毒素与鲎试剂混合液不等进入反响仪器反响已开场，实践反响时间超越1小时。由于室温不同，冬夏季节、南北地域之间的操作误差将会很大。即使在25准室温下操作，操作时间拖得过长，细菌内毒素含量较高时，测定误差也不会小。三、企业产品优势1、能准确判别假阳性用本企业研制消费的定量鲎试剂第一家准确无误地检测出了内毒素与葡聚糖二者之间的区别，并公布了内毒素与非内毒素反响曲线。截止目前，还没有第二个品牌的鲎试剂将假阳性区别出来，其他国内外研讨机构也未公布同类型曲线。对于假阳性的鉴别曾经远远走在了世界同行业的前面。2、对外交流历史悠久，全面掌握中美两国鲎试剂的区别1对外交流我公司历史最悠久、交流技术最

17、全面； 2我公司掌握了中国和美国鲎试剂的全面区别；3用美国和中国的内毒素规范品，我公司鲎试剂标示灵敏度都相当准确。 4经过十多年的技术交流结果显示，本公司的鲎试剂与美国同类产质量量相比没有任何差别，而且个别工程要优于美国产品。 三、售后技术效力专业，技术优势明显 细菌内毒素检查法在我国已开展了十多年，经过许许多多专家学者的努力，目前该行业曾经获得了非常重要的成果，但是该领域依然有许多我们无法处理问题的存在，它并不想我们想象的那么简单，这些问题的存在严重妨碍了该行业的进一步开展，我们将与客户的交流以及客户咨询的相关问题，进展一次归纳总结。经过任务中出现的问题有必要对以下情况进展交流，以加强对细菌

18、内毒素检查法的正确了解，同时纠正一些错误的观念。如何全面了解细菌内毒素检查法中污染物对实验结果的影响？如何正确认识器皿洗涤的重要性？如何正确了解鲎试剂的抗干扰才干和鲎试剂的特异性？ 许多客户对污染的认识是不全面或错误的，他们以为在细菌内毒素检查过程中，器皿被污染的结果必然导致阳性结果的出现，但实验结果正好与他们的认识有时正好相反，能够阳性对照全为阴性，对此亦有百思不得其解。要正确了解这个问题，首先要正确了解鲎试剂与内毒素的反响机理，鲎试剂与内毒素的反响为一系列酶反响，生物酶反响受许多要素的干扰。在日常任务中，我们要特别留意一些要素对实验结果的影响，如PH值、器皿的干净度以及环境要素等。 处理这些问题需求非常丰富的专业知识，我们公司在专业知识方面具有得天独厚的优势，其他鲎试剂消费企业望尘莫及。 下面我们将客户遇到的困难，其他鲎试剂消费企业无法处理的技术问题，最终由我们协助处理了的案例列举如下：1、输液塑瓶溶出物聚丙烯添加剂假阳性反响鉴别方法；2、盐酸土霉素细菌内毒素定量分析回收率偏低的技术问题；3、阳性对照为阴性结果的问题；4、头孢类抗生素细菌内毒素检测假阳性问题；5、乙肝疫苗细菌内毒素检测样品阳性对照为阴性问题。 经过处理以上技术问题，我们展现了企业的技术实力，加强了与客户之间的沟通，博得了客户的信任，博得了市场。