酶工程3酶的分离纯化

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1、第三章第三章 酶的分离纯化酶的分离纯化 酶分离纯化的目的是使酶制剂酶分离纯化的目的是使酶制剂产品达到应用所需的纯度。产品达到应用所需的纯度。分离纯化过程包括分离纯化过程包括3 3个基本步骤：个基本步骤：1 1 抽提抽提2 2 纯化纯化3 3 制剂制剂Crudeproductconcentrationversussellingprice(Dwyer,1984)某些生化物质在原料液中的某些生化物质在原料液中的浓度与价格的关系浓度与价格的关系(1984年年) 物质名浓度(C)价格(P，)尿激酶51053108荧光素酶81032106胰岛素41019104头孢菌素10102乙醇11023101在分离纯

2、化中必须注意：在分离纯化中必须注意：1 1 防止酶的变性失活；防止酶的变性失活；2 2 在分离纯化过程中的每一步都在分离纯化过程中的每一步都 应检测酶的活性，以确定酶的应检测酶的活性，以确定酶的 纯化程度和回收率。纯化程度和回收率。第一节第一节 酶活力的测定酶活力的测定几个名词几个名词1酶活力或酶活性酶活力或酶活性2酶活力单位酶活力单位3mol催化活性（分子活性）和转换催化活性（分子活性）和转换数（催化中心活力数（催化中心活力)4酶的比活力酶的比活力酶活力（又称酶活性）酶活力（又称酶活性）(enzymeactivity)（IU/g或或IU/mL)指酶催化一定化学反应的能力；用在指酶催化一定化学

3、反应的能力；用在一定条件下，所催化的反应初速度来表示；一定条件下，所催化的反应初速度来表示；是研究酶的特性，酶制剂生产应用以及分是研究酶的特性，酶制剂生产应用以及分离纯化时的一项必不可少的指标。离纯化时的一项必不可少的指标。酶活力单位酶活力单位(enzymeactivityunit)表示酶活力大小的尺度；表示酶活力大小的尺度；一个国际单位（一个国际单位（IU）是指在特定条件是指在特定条件下（下（250C），），每分钟内转化每分钟内转化1 mol底物或底物或催化形成催化形成1 mol产物所需的酶量产物所需的酶量一个一个Kat是指每秒钟内转化是指每秒钟内转化1mol底物底物所需的酶量，所需的酶量，

4、1Kat=6 107IU。mol催化活性（分子活性）和催化活性（分子活性）和转换数（催化中心活力）转换数（催化中心活力）mol催化活性是指单位时间内，每个酶催化活性是指单位时间内，每个酶分子所转换的底物分子数目；转换数（分子所转换的底物分子数目；转换数（Kcat)是指酶分子中每个活性中心所转换的底物分是指酶分子中每个活性中心所转换的底物分子数目。如果酶分子中只有一个活性中心，子数目。如果酶分子中只有一个活性中心，那么那么mol催化活性与转换数相等，如果酶分催化活性与转换数相等，如果酶分子中含有子中含有n个活性中心，那么转换数则为个活性中心，那么转换数则为mol催化活性除以催化活性除以n。酶的比

5、活力酶的比活力（specificactivity)酶的比活力酶的比活力是酶纯度的量度，是是酶纯度的量度，是指单位重量酶蛋白所具有的酶活力，指单位重量酶蛋白所具有的酶活力，单位为单位为IU/mg。比活力越大，酶纯度。比活力越大，酶纯度越高。越高。=酶活力的测定方法：酶活力的测定方法：终止反应法终止反应法和连续反应法。和连续反应法。终止反应法终止反应法在恒温反应系统中，每隔一定时间，在恒温反应系统中，每隔一定时间，取出一定体积的反应液，用强酸强碱或取出一定体积的反应液，用强酸强碱或SDSSDS以及加热等使反应立即停止，然后用以及加热等使反应立即停止，然后用化学法、放射性化学法或酶偶联法分析产化学法

6、、放射性化学法或酶偶联法分析产物的形成量或底物的消耗量。这是最经典物的形成量或底物的消耗量。这是最经典的酶活力测定方法，几乎所有的酶都可以的酶活力测定方法，几乎所有的酶都可以根据这一原理设计出具体的测定方法。根据这一原理设计出具体的测定方法。连续反应法连续反应法无须终止反应，而是在酶反应过无须终止反应，而是在酶反应过程中用光化学仪器或电化学仪器等来程中用光化学仪器或电化学仪器等来监测反应的进行情况，对记录结果进监测反应的进行情况，对记录结果进行分析，然后计算出酶活力。行分析，然后计算出酶活力。酶不可逆失活的原因和机理蛋白质（酶）的失活机理蛋白质不可逆失活的原因蛋白酶水解蛋白酶水解或自溶作用或自

7、溶作用表面活性剂表面活性剂和去垢剂和去垢剂聚合作用聚合作用氧化作用氧化作用机械力机械力变性剂变性剂重金属离子重金属离子和巯基试剂和巯基试剂冷冻和脱水冷冻和脱水热热极端极端pH蛋白质蛋白质不可逆失活不可逆失活脲和胍脲和胍高浓度盐高浓度盐螯合螯合有机溶剂有机溶剂辐射作用辐射作用 蛋白质的稳定化蛋白质的稳定化蛋白质稳定化蛋白质稳定化蛋白质稳定化途径蛋白质稳定化途径如何防止蛋白质的可逆伸展如何防止蛋白质不可逆失活反应发生稳定蛋白质（酶）的方法稳定蛋白质（酶）的方法酶分离的一般流程酶分离的一般流程原料液细胞分离(离心，过滤)细胞胞内产物路线一路线二细胞破碎碎片分离路线一A路线一B清液胞外产物粗分离(盐析

8、、萃取、超过滤等)纯化(层析、电泳)脱盐(凝胶过滤、超过滤)浓缩(超过滤)精制(结晶、干燥)包含体溶解(加盐酸胍、脲)复性第二节第二节 酶溶液的制备酶溶液的制备酶溶液的制备：酶溶液的制备： 把酶从生物原料中抽提出来，作把酶从生物原料中抽提出来，作成酶溶液成酶溶液 酶溶液的制备包括：材料预处理酶溶液的制备包括：材料预处理及细胞破碎、抽提、净化脱色、抽体及细胞破碎、抽提、净化脱色、抽体液的浓缩等几个步骤。液的浓缩等几个步骤。一、材料预处理及细胞破碎一、材料预处理及细胞破碎材料预处理：材料预处理：酶蛋白在细胞内外的分酶蛋白在细胞内外的分布有三种情况：胞外酶，胞内酶（溶布有三种情况：胞外酶，胞内酶（溶

9、酶和晶酶）。酶和晶酶）。微生物胞外酶微生物胞外酶 可以用盐析或有机溶剂沉可以用盐析或有机溶剂沉淀等从发酵液中沉淀成酶泥淀等从发酵液中沉淀成酶泥胞内酶胞内酶 要先收集菌体，经细胞破要先收集菌体，经细胞破碎后提取碎后提取动物材料动物材料 应先剔除结缔组织和脂肪应先剔除结缔组织和脂肪组织等组织等植物材料植物材料 应去皮等以免单宁等物质应去皮等以免单宁等物质着色污染着色污染细胞破碎：细胞破碎：物理和化学两大类方法物理和化学两大类方法1 1、物理破碎：、物理破碎： 研磨（手磨，球磨和石磨），研磨（手磨，球磨和石磨）， 机械捣碎（匀浆器和高速组织机械捣碎（匀浆器和高速组织捣碎器等），捣碎器等）， 高压法，

10、高压法， 爆破性减压法，爆破性减压法， 专用波振荡，专用波振荡， 快速冷冻融化法等。快速冷冻融化法等。2 2、化学破碎：、化学破碎： 渗透作用渗透作用 自溶：自溶： 酶处理酶处理 表面活性剂表面活性剂（I I）渗透作用渗透作用 将指数生长期的菌体用缓冲液洗将指数生长期的菌体用缓冲液洗净，并悬浮于含蔗糖和净，并悬浮于含蔗糖和EDTAEDTA的稀的稀TrisTris缓冲液中，离心，加入缓冲液中，离心，加入 MgClMgCl2 2剧烈搅剧烈搅拌，可使一些水解酶从细胞内释放出拌，可使一些水解酶从细胞内释放出来。来。（IIII）自溶自溶 向菌体中加入醋酸乙酯，甲向菌体中加入醋酸乙酯，甲苯，乙醚以及氯仿，

11、使细胞渗透苯，乙醚以及氯仿，使细胞渗透性改变保持一定时间后可以使细性改变保持一定时间后可以使细胞自溶；胞自溶；（IIIIII）酶处理酶处理 用溶菌酶专一性地分解原核微生用溶菌酶专一性地分解原核微生物细胞壁，使胞内酶释放物细胞壁，使胞内酶释放（IVIV）表面活性剂表面活性剂 膜结合的晶酶在细胞破碎后膜结合的晶酶在细胞破碎后很难溶解，常借助于表面活性剂很难溶解，常借助于表面活性剂与脂蛋白形成微泡，使之溶解。与脂蛋白形成微泡，使之溶解。二、抽 提大多数酶蛋白是属于球蛋白，因此，大多数酶蛋白是属于球蛋白，因此，可用稀盐、稀碱或稀酸的水溶液进行可用稀盐、稀碱或稀酸的水溶液进行抽提；抽提；抽提液的具体组成

12、和抽提条件的选抽提液的具体组成和抽提条件的选择取决于酶的溶解性、稳定性以及有择取决于酶的溶解性、稳定性以及有利于切断酶与其它物质的连结。利于切断酶与其它物质的连结。1 1、提取的主要方法：、提取的主要方法：（1 1）盐溶液提取）盐溶液提取（2 2）酸溶液提取）酸溶液提取（3 3）碱溶液提取）碱溶液提取（4 4）有机溶剂提取）有机溶剂提取2 2、酶提取过程的注意事项、酶提取过程的注意事项 pHpH的选择的选择 盐的选择盐的选择 温度的选择温度的选择 抽提液用量抽提液用量 其它其它pH的选择的选择首先考虑酶的稳定性；其次应首先考虑酶的稳定性；其次应 远离等电点；一般选择远离等电点；一般选择pH4-

13、6pH4-6 为宜。为宜。盐的选择盐的选择大多数酶在低浓度的盐溶液大多数酶在低浓度的盐溶液中有较大的溶解度，一般选中有较大的溶解度，一般选择等渗盐溶液，如择等渗盐溶液，如0.02-0.05mol/L的磷酸缓冲液或的磷酸缓冲液或0.15mol/L的的NaCl等。等。温度的选择温度的选择一般控制在一般控制在0-40C，如果酶如果酶比较稳定可以例外。比较稳定可以例外。抽提液用量抽提液用量常采用材料量的常采用材料量的1-5倍倍其它加入蛋白酶抑制剂、半胱氨酸或细胞色素C等，来稳定抽提系统。三、酶溶液的絮凝、净化与脱色三、酶溶液的絮凝、净化与脱色絮凝絮凝由于发酵液黏度较大，细胞表面电荷排由于发酵液黏度较大

14、，细胞表面电荷排 斥以及多糖蛋白质等大分子物质形成的斥以及多糖蛋白质等大分子物质形成的 水化层等给酶溶液的离心或过滤带来困水化层等给酶溶液的离心或过滤带来困 难；因此要用絮凝剂进行处理。难；因此要用絮凝剂进行处理。絮凝剂：多种类型絮凝剂：多种类型 无机：如醋酸钙和磷酸钙等无机：如醋酸钙和磷酸钙等 有机：如聚丙烯酰胺等有机：如聚丙烯酰胺等 天然高分子：如壳多糖等天然高分子：如壳多糖等过滤或离心净化过滤或离心净化通过絮凝剂处理后的酶溶液通过絮凝剂处理后的酶溶液经过离心或过滤将细胞碎片等固经过离心或过滤将细胞碎片等固性物和杂蛋白，粘多糖，核酸以性物和杂蛋白，粘多糖，核酸以及脂类等大分子物质去除。及脂

15、类等大分子物质去除。脱色脱色酶的工业生产中，常用的脱酶的工业生产中，常用的脱色剂为活性炭，活性炭通过吸附色剂为活性炭，活性炭通过吸附色素而脱色；活性炭用量一般为色素而脱色；活性炭用量一般为0.1%-1.5%。四、酶溶液的浓缩四、酶溶液的浓缩 冷冻干燥法冷冻干燥法 蒸发法：蒸发法： 超过滤法：超过滤法： 胶过滤法：胶过滤法： 干燥冷冻干燥法冷冻干燥法先将酶溶液冻成固体，然先将酶溶液冻成固体，然后在真空状态下使水分子从固后在真空状态下使水分子从固体表面直接升华。体表面直接升华。蒸发法蒸发法目前工业上采用较多的是薄目前工业上采用较多的是薄膜蒸发法，在高度真空状态下使膜蒸发法，在高度真空状态下使酶溶液

16、转变为极薄的液膜，通过酶溶液转变为极薄的液膜，通过加热而迅速汽化，经旋风式汽液加热而迅速汽化，经旋风式汽液分离器达到浓缩的目的。分离器达到浓缩的目的。超过滤法超过滤法将酶溶液通过只允许小将酶溶液通过只允许小分子物质通过的微孔滤膜，分子物质通过的微孔滤膜，大分子的酶蛋白被截留而达大分子的酶蛋白被截留而达到浓缩的目的。到浓缩的目的。胶过滤法胶过滤法利用利用SephadexG-250或或G-50吸水膨胀，而酶蛋白被吸水膨胀，而酶蛋白被排阻在胶的外面。排阻在胶的外面。其它方法其它方法吸水剂如用聚乙二醇吸水剂如用聚乙二醇( (PEG)PEG)处理小量样品。处理小量样品。干燥将固体、半固体或浓缩液中水分（

17、或其他溶剂）除去一部分，以获得含水量较少的固体过程。方法：真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥、吸附干燥第三节第三节 酶分离纯化的基本过程酶分离纯化的基本过程一、酶分离纯化方法的选择一、酶分离纯化方法的选择 目前酶的分离纯化方法都是根据酶与杂蛋目前酶的分离纯化方法都是根据酶与杂蛋白的性质差异而建立的，在选择分离纯化方白的性质差异而建立的，在选择分离纯化方法时，要考虑以下几个方面：法时，要考虑以下几个方面：4首先对待纯化的酶的理化性质有比较全面首先对待纯化的酶的理化性质有比较全面的了解；的了解；4以酶活力和比活力为标准，判断所选择的以酶活力和比活力为标准，判断所选择的方法是否得当；方法是否得当

18、；4严格控制操作条件，防止酶的变性失活。严格控制操作条件，防止酶的变性失活。选择生物分离方法的依据选择生物分离方法的依据1物理化学性质物理化学性质2生物体系的特性生物体系的特性3能用作分离和纯化依据的蛋白质性质能用作分离和纯化依据的蛋白质性质1.物理化学性质物理化学性质分分子子大大小小、分分子子量量、分分子子体体积积、极极性性、偶偶极极矩矩、熔熔点点、沸沸点点、汽汽化化热热、离离子子电电荷荷、溶溶解解度度参参数数、折折射射率率、表表面面张张力力、介介电电常常数数、密密度度、粘粘度度、酸酸碱碱强强度度、pK值值、等等电电点点(pI)等等等等。物物质质之之间间得得以以分分离离的的主主要要依依据据就

19、就是是组组分间的物化性质的差异。分间的物化性质的差异。在在涉涉及及具具有有生生物物活活性性物物质质的的体体系系中中，有有关关这这方方面面的的数数据据与与化化工工产产品品相相比比要要少少得得多多，严严重重影影响响了了生生物物分分离离过过程程的的有有效效进进行行。因因此此，生物体系的物化性质的研究应成为一个重点。生物体系的物化性质的研究应成为一个重点。2.生物体系的特性生物体系的特性对对一一些些有有生生物物活活性性的的物物质质，不不是是能能够够用用一一般般的的物物化化性性质质来来表表达达的的，这这就就需需要要了了解解这这些些物物质质的的生生物物特特性性，特特别别要要知知道道影影响响生生物物特特性性

20、变变化化的的条条件件和和这这些些物物质质失失活活的的因因素素，包包括括溶溶剂剂、pH值值、温温度度等等等等。这这种种保保持持生生物物质质特特性性不不至至于于改改变变的措施就是所谓的稳定性维持。的措施就是所谓的稳定性维持。3.能用作分离和纯化依据的蛋白质性质能用作分离和纯化依据的蛋白质性质能能从从混混合合物物中中分分离离和和纯纯化化出出一一种种蛋蛋白白质质是是因因为为不不同同蛋蛋白白质质有有着着不不同同的的物物理理和和化化学学性性质质。这这些些性性质质是是由由于于蛋蛋白白质质的的氨氨基基酸酸数数目目和和序序列列不不同同造造成成的的。连连接接在在多多肽肽主主链链上上的的氨氨基基酸酸残残基基可可以以

21、是是带带正正电电荷荷的的或或带带负负电电荷荷的的、极极性性的的或或非非极极性性的的、亲亲水水性性的的或疏水性的或疏水性的。此此外外，多多肽肽可可折折叠叠成成非非常常确确定定的的二二级级结结构构( 螺螺旋旋、 折折叠叠和和各各种种转转角角)和和三三级级结结构构，形形成成独独特特的的大大小小、形形状状和和残残基基在在蛋蛋白白质质表表面面的的分分布布状状况况。利利用用待待分分离离蛋蛋白白质质与与混混合合物物中中其其它它蛋蛋白白质质之之间间在在性性质质上上的的差差异异，即即能能设设计计出出一一组组合合理理的的分分级级分分离离步步骤。骤。酶分离纯化方法酶分离纯化方法 根据分子大小建立的分离纯化方法根据分

22、子大小建立的分离纯化方法 根据溶解度建立的分离纯化方法根据溶解度建立的分离纯化方法 根据电荷性质建立的分离纯化方法根据电荷性质建立的分离纯化方法 根据亲和作用建立的分离纯化方法根据亲和作用建立的分离纯化方法 根据稳定性差异建立的分离纯化方法根据稳定性差异建立的分离纯化方法一、根据分子大小建立的分离纯化方法一、根据分子大小建立的分离纯化方法 透析透析 超过滤超过滤 离心离心 凝胶过滤等。凝胶过滤等。1 1、透、透 析析(Dialysis)(Dialysis)法：法：过程过程：将酶溶液装入透析袋中，放入蒸馏水或稀缓冲：将酶溶液装入透析袋中，放入蒸馏水或稀缓冲液中，小分子物质通过透析袋进入水或缓冲液

23、中，而液中，小分子物质通过透析袋进入水或缓冲液中，而蛋白质被截留在透析袋中；蛋白质被截留在透析袋中；透析袋类型透析袋类型：有两种，再生纤维素膜透析袋和纤维素：有两种，再生纤维素膜透析袋和纤维素酯透析袋。有多种型号和规格，主要参数是分子量截酯透析袋。有多种型号和规格，主要参数是分子量截留值（留值（ 1 1 10102 2D D）；商品名为）；商品名为spectraporspectrapor等。等。透析袋的预处理透析袋的预处理：干燥的透析袋在制备过程中曾用：干燥的透析袋在制备过程中曾用10%10%甘油处理过，只要浸泡湿润和蒸馏水洗涤即可使用；甘油处理过，只要浸泡湿润和蒸馏水洗涤即可使用；必要时可用

24、必要时可用10mmol/L 10mmol/L 碳酸氢钠，碳酸氢钠，50%50%乙醇和乙醇和10mmol/L 10mmol/L EDTAEDTA处理后，再用蒸馏水洗涤。处理后，再用蒸馏水洗涤。透析袋透析袋酶溶液酶溶液蒸馏水蒸馏水透析装置和过程透析装置和过程2 2、超过滤、超过滤 利用压力或离心力强行使溶质按利用压力或离心力强行使溶质按大小形状的差异分开，将所需的酶分大小形状的差异分开，将所需的酶分子被滤膜截留，而其它较小的分子随子被滤膜截留，而其它较小的分子随溶剂被压到膜的另一侧。溶剂被压到膜的另一侧。超滤膜超滤膜制备超滤膜的材料多是高分子制备超滤膜的材料多是高分子聚合物（如聚砜类，聚四氟乙烯等

25、；目前聚合物（如聚砜类，聚四氟乙烯等；目前有圆形和卷式等多种超滤膜类型；主要参有圆形和卷式等多种超滤膜类型；主要参数是截留分子量，耐受压力和滤速和有效数是截留分子量，耐受压力和滤速和有效过滤面积等；主要商品型号有过滤面积等；主要商品型号有Amicon Amicon DiafloDiaflo系列等。系列等。超滤器类型超滤器类型有管式，中空纤维式，螺有管式，中空纤维式，螺旋卷绕式和平板式四种类型。旋卷绕式和平板式四种类型。加压加压酶溶液酶溶液超滤膜超滤膜支持栅板支持栅板超滤液超滤液超滤装置超滤装置3、离心法、离心法离心是借助于离心机旋转所离心是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小和不产生的离

26、心力，使不同大小和不同密度的物质分开的技术。同密度的物质分开的技术。（1）离心机的种类和用途）离心机的种类和用途（2）沉降系数）沉降系数S（3）离心方法的选择）离心方法的选择差速离心差速离心密度梯度离心密度梯度离心等密度离心等密度离心（4）离心条件的确定）离心条件的确定离心力离心力离心时间离心时间离心温度和离心温度和pH值值梯度离心梯度离心密密度度梯梯度度在在离离心心管管内内的的分分布布是是管管底底的密度最大的密度最大,向上逐渐减小向上逐渐减小蔗蔗糖糖便便宜宜，纯纯度度高高，浓浓溶溶液液（60，w/w）密度可达）密度可达1.28g/cm3。聚聚蔗蔗糖糖的的商商品品名名是是Ficoll，它它是是

27、由由蔗蔗糖糖和和1-氯氯-2,3-环环氧氧丙丙烷烷合合成成的的高聚物，高聚物，Mr约约400000。需需要要高高密密度度和和低低渗渗透透压压的的梯梯度度时，可用时，可用Ficoll代替蔗糖。代替蔗糖。4、凝胶过滤法、凝胶过滤法原理原理：又称分子筛层析，在层析柱中填充：又称分子筛层析，在层析柱中填充凝胶介质，加入待分离的酶溶液，然后用凝胶介质，加入待分离的酶溶液，然后用适当的缓冲液洗脱，样品自上而下扩展，适当的缓冲液洗脱，样品自上而下扩展，大于凝胶孔径的分子不能进入胶粒内部而大于凝胶孔径的分子不能进入胶粒内部而从胶粒间空隙扩展，下移速度较快，而小从胶粒间空隙扩展，下移速度较快，而小于凝胶孔径的分

28、子进入胶粒内部，下移速于凝胶孔径的分子进入胶粒内部，下移速度较慢，经过一定时间后不同大小分子按度较慢，经过一定时间后不同大小分子按先大后小的顺序从层析柱中流出。先大后小的顺序从层析柱中流出。凝胶过滤凝胶过滤凝胶过滤凝胶过滤TubesmarchinfromleftA280Fraction#部分使用的担体部分使用的担体目前使用最广泛的担体材料：目前使用最广泛的担体材料：交联后的葡聚糖凝胶交联后的葡聚糖凝胶聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺琼脂琼脂其它物料其它物料二、根据溶解度建立的分离方法二、根据溶解度建立的分离方法1、盐析盐析(SaltingOut)法法2、降低介电常数法（有机溶剂沉淀降低介电常数法（有机溶剂

29、沉淀法）法）3、等电点沉淀法等电点沉淀法4、共沉淀法、共沉淀法5、选择性沉淀法：选择性沉淀法：1、盐析法盐析法最常用的是硫酸铵。盐浓度以饱和度表示，最常用的是硫酸铵。盐浓度以饱和度表示，饱和盐溶液的饱和度为饱和盐溶液的饱和度为100%。调整盐浓度有两。调整盐浓度有两种方法：加入饱和硫酸铵溶液（蛋白质溶液体种方法：加入饱和硫酸铵溶液（蛋白质溶液体积不大时）和直接加入固体硫酸铵（蛋白质溶积不大时）和直接加入固体硫酸铵（蛋白质溶液体积较大时）。液体积较大时）。加入饱和硫酸铵：加入饱和硫酸铵：100ml溶液中，由饱和度溶液中，由饱和度S1变为变为S2，应向其中加入的饱和硫酸铵溶液的，应向其中加入的饱和

30、硫酸铵溶液的ml数数V=V0（S1-S2）/（1-S2）。）。直接加入固体硫酸铵可以直接查直接加入固体硫酸铵可以直接查“调整硫酸调整硫酸铵溶液饱和度计算表铵溶液饱和度计算表”。2、降低介电常数法、降低介电常数法（有机溶剂沉淀法）（有机溶剂沉淀法）降低介电常数方法降低介电常数方法在酶溶液中加在酶溶液中加入与水互溶的有机溶剂，可以降低介入与水互溶的有机溶剂，可以降低介电常数，使酶分子间的静电引力增加电常数，使酶分子间的静电引力增加而发生沉淀。而发生沉淀。影响介电常数的主要因素：影响介电常数的主要因素： 温度温度 有机溶剂有机溶剂 离子强度离子强度 pH pH值：值：温度：温度：在在0下进行操作；有

31、机溶剂必下进行操作；有机溶剂必须冷至须冷至-15-20，边搅拌边缓慢加入，边搅拌边缓慢加入，沉淀析出后迅速离心分离，并用预冷沉淀析出后迅速离心分离，并用预冷缓冲液溶解沉淀。缓冲液溶解沉淀。有机溶剂：有机溶剂：常用的有机溶剂有丙酮，乙醇，常用的有机溶剂有丙酮，乙醇，甲醇，异丙醇等甲醇，异丙醇等离子强度离子强度大多数中性盐在低浓度时能增加大多数中性盐在低浓度时能增加酶蛋白的溶解并减少变性，在有机溶酶蛋白的溶解并减少变性，在有机溶剂沉淀中加入剂沉淀中加入510%（0.05mol）的硫酸铵有助于提高分辨率。的硫酸铵有助于提高分辨率。pHpH值值尽可能接近酶的等电点尽可能接近酶的等电点pIpI3、等电点

32、沉淀法等电点沉淀法酶在等电点处容易发生沉淀酶在等电点处容易发生沉淀4、共沉淀法、共沉淀法一些大分子非离子型聚合物如聚一些大分子非离子型聚合物如聚乙二醇（乙二醇（PEG）,聚乙烯亚胺（聚乙烯亚胺（PEI）单宁酸，硫酸链霉素以及表面活性剂单宁酸，硫酸链霉素以及表面活性剂（SDS）等在一定条件下可以直接或）等在一定条件下可以直接或间接与蛋白质形成络合物而沉淀析出间接与蛋白质形成络合物而沉淀析出,再用适当的方法使酶溶解出来。再用适当的方法使酶溶解出来。5、选择性沉淀法：选择性沉淀法：有些多聚电解质可以在极有些多聚电解质可以在极低浓度下选择性地与某些酶结合而形成沉低浓度下选择性地与某些酶结合而形成沉淀。

33、如聚丙烯酸（淀。如聚丙烯酸（PAA）可以与某些蛋白）可以与某些蛋白酶，溶菌酶和磷酸酯酶等形成沉淀。分离酶，溶菌酶和磷酸酯酶等形成沉淀。分离过程如下：过程如下：PAA+酶酶酶酶PAA-酶酶+Ca2+PAA-Ca2+酶酶PAA-Ca2+SO42-CaSO4+PAA三、按蛋白质电荷性质设计的分离方法三、按蛋白质电荷性质设计的分离方法1、吸附法、吸附法（1）物理吸附法）物理吸附法（2）羟基磷灰石法）羟基磷灰石法（3）离子交换吸附法）离子交换吸附法-离子交换色谱法离子交换色谱法2 2 、电泳法电泳法（1 1）区带电泳）区带电泳（2 2）等点聚焦电泳）等点聚焦电泳（3 3）高效毛细管电泳）高效毛细管电泳（

34、4 4）聚焦层析）聚焦层析（1）物理吸附法）物理吸附法(不介绍不介绍)（2 2）羟基磷灰石法）羟基磷灰石法羟基磷灰石是一种微晶型磷酸钙；羟基磷灰石是一种微晶型磷酸钙；一般认为其表面的钙离子和磷酸根一般认为其表面的钙离子和磷酸根离子与蛋白质带相反电荷的基团发离子与蛋白质带相反电荷的基团发生相互作用；在低盐和弱酸或中性生相互作用；在低盐和弱酸或中性条件下进行吸附；洗脱时提高离子条件下进行吸附；洗脱时提高离子强度；多采用柱层析方式进行。强度；多采用柱层析方式进行。 （3 3）离子交换吸附法）离子交换吸附法离子交换色谱法离子交换色谱法利用带电荷的离子交换剂为载利用带电荷的离子交换剂为载体，将带相反电荷

35、的蛋白质吸附，体，将带相反电荷的蛋白质吸附，然后在一定条件下洗脱下来。然后在一定条件下洗脱下来。 离子交换层析过程：离子交换层析过程：离子交换剂的预处理离子交换剂的预处理平衡平衡装柱装柱加样吸附加样吸附洗脱洗脱洗脱液收集与相应检测洗脱液收集与相应检测离子交换剂的再生离子交换剂的再生离子交换剂离子交换剂一般由高分子支持介质（母体）一般由高分子支持介质（母体）和功能基团（离子交换基）两部分组和功能基团（离子交换基）两部分组成。成。离子交换剂应满足下列要求：离子交换剂应满足下列要求：（1 1）有高度的不溶性有高度的不溶性，即在各种溶剂中进行交换时，即在各种溶剂中进行交换时，交换剂不发生溶解交换剂不发

36、生溶解（2 2）有疏松的多孔结构或巨大的表面积有疏松的多孔结构或巨大的表面积，使交换离子，使交换离子能在交换剂中进行自由扩散和交换能在交换剂中进行自由扩散和交换（3 3）有较多的交换基团有较多的交换基团（4 4）有稳定的物理化学性质有稳定的物理化学性质，在使用过程中，交换剂，在使用过程中，交换剂不能因物理或化学因子的变化而发生分解和变形等不能因物理或化学因子的变化而发生分解和变形等现象。现象。离子交换剂的离子交换剂的3 3种类型种类型根据高分子支持介质的性质根据高分子支持介质的性质离子交换树脂离子交换树脂离子交换纤维素离子交换纤维素离子交换球型多糖离子交换球型多糖( (如葡聚糖凝胶如葡聚糖凝胶

37、和琼脂糖凝胶等和琼脂糖凝胶等) )。2、电泳法、电泳法在直流电场中，由于各种蛋白质分在直流电场中，由于各种蛋白质分子所带电荷不同，移动速度不同，形成子所带电荷不同，移动速度不同，形成各自的区带，用显色剂如各自的区带，用显色剂如CoomassieBlue染色后，可以在支持物上看到蛋白染色后，可以在支持物上看到蛋白质的颜色谱带，每条带代表一种蛋白质。质的颜色谱带，每条带代表一种蛋白质。基本原理蛋白质是两性电解质，在一定蛋白质是两性电解质，在一定pH下，可解下，可解离成带电荷的离子，在电场作用下可以向与其离成带电荷的离子，在电场作用下可以向与其电荷相反的方向的电极泳动，泳动速度主要取电荷相反的方向的

38、电极泳动，泳动速度主要取决于蛋白质分子所带电荷的性质、数量及颗粒决于蛋白质分子所带电荷的性质、数量及颗粒的大小和形状。的大小和形状。 由于各种蛋白质的等电点（由于各种蛋白质的等电点（pIpI）不同，分）不同，分子量不同，在同一个子量不同，在同一个pHpH缓冲溶液中所带电荷不缓冲溶液中所带电荷不同，故在电场中的泳动速度也不同，利用此性同，故在电场中的泳动速度也不同，利用此性质，可将混合物中不同蛋白质分离开，也可用质，可将混合物中不同蛋白质分离开，也可用其对样品的纯度进行鉴定。其对样品的纯度进行鉴定。双向电泳-1双向电泳-2双向电泳-3电泳法电泳法（1 1）区带电泳）区带电泳（2 2）等点聚焦电泳

39、）等点聚焦电泳（3 3）高效毛细管电泳）高效毛细管电泳（1）区带电泳）区带电泳在惰性支持物上进行电泳时样品中在惰性支持物上进行电泳时样品中各组分迁移速度不同而分布成区带的一类各组分迁移速度不同而分布成区带的一类电泳分离方法电泳分离方法按支持物的物理性状可分为按支持物的物理性状可分为3种类种类型：型：膜电泳膜电泳粉末电泳粉末电泳凝胶电泳凝胶电泳膜电泳膜电泳以滤纸、聚酰胺薄膜，醋酸以滤纸、聚酰胺薄膜，醋酸纤维薄膜等为支持物的一类电泳纤维薄膜等为支持物的一类电泳分离方法。分离方法。粉末电泳粉末电泳以淀粉、纤维素粉或硅胶粉以淀粉、纤维素粉或硅胶粉等为支持物的分离方法。等为支持物的分离方法。凝胶电泳凝胶

40、电泳以聚丙烯酰胺为支持物，兼以聚丙烯酰胺为支持物，兼有分子筛效应。有分子筛效应。区带电泳的优点区带电泳的优点分辨率较好分辨率较好设备简单设备简单操作方便操作方便（2）等点聚焦电泳）等点聚焦电泳利用两性电解质在直流电场中形利用两性电解质在直流电场中形成一个连续的成一个连续的pH梯度，样品中各种蛋梯度，样品中各种蛋白质在各自的等电点在相应的白质在各自的等电点在相应的pH区段区段聚集而达到分离的目的。聚集而达到分离的目的。等电聚焦电泳高效毛细管电泳高效毛细管电泳毛细管电泳毛细管电泳是在内径为是在内径为25100 m的石英毛细的石英毛细管中进管中进行电泳，毛细管中填充了缓冲液或凝胶。行电泳，毛细管中填

41、充了缓冲液或凝胶。使用毛细管的一个使用毛细管的一个优点优点是是:它减少了由于热效应产它减少了由于热效应产生的许多问题，因为管的孔径小，面积与体积之比大，生的许多问题，因为管的孔径小，面积与体积之比大，这样可以提高热散失，有助于消除由于热引起的扩散这样可以提高热散失，有助于消除由于热引起的扩散增加而造成的对流和区带变宽，因此管中不需要加入增加而造成的对流和区带变宽，因此管中不需要加入稳定介质即可进行自由流动电泳。稳定介质即可进行自由流动电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）是以

42、聚丙烯酰胺作为支）是以聚丙烯酰胺作为支持物的一种电泳方法。持物的一种电泳方法。PAGE方法成了研究蛋白质和核酸等大分子物质方法成了研究蛋白质和核酸等大分子物质的重要工具之一的重要工具之一.实践中可根据不同目的选择所需的类型。实践中可根据不同目的选择所需的类型。一般单向一般单向PAGE多用于分离具有活性的生物物质，多用于分离具有活性的生物物质，而而双双向向或或梯梯度度PAGE则则宜宜用用于于较较难难分分离离鉴鉴别别的的生生物物大大分分子子物质。物质。如如果果在在PAGE时时加加入入适适量量十十二二烷烷基基磺磺酸酸钠钠（SDS）可可用用于于测定蛋白质的分子质量；测定蛋白质的分子质量；如如果果PAG

43、E与与等等电电聚聚焦焦相相结结合合时时，可可用用于于分分析析蛋蛋白白质质的的等等电点。电点。除除这这些些用用途途外外，PAGE还还可可用用于于制制备备少少量量的的纯纯度度高高、有活性的生物大分子物质有活性的生物大分子物质 聚丙烯酰胺凝胶具有三维网状结构，电泳颗粒通过网状结构的空隙时聚丙烯酰胺凝胶具有三维网状结构，电泳颗粒通过网状结构的空隙时受到摩擦力的作用，摩擦力的大小与样品颗粒的大小呈正相关。受到摩擦力的作用，摩擦力的大小与样品颗粒的大小呈正相关。基本原理基本原理聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶丙烯酰胺（丙烯酰胺（acrylamideAcr）单体（）单体（monomer）N，N-甲叉双丙烯酰胺（

44、甲叉双丙烯酰胺（N,N-methylene-bisacrylamide，Bis）交联剂（）交联剂（crosslinker）聚合聚合交联交联原理：原理：当向蛋白质溶液中加入足够量当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯和巯基乙醇基乙醇，SDS能破坏蛋白质分子中的氢键和疏能破坏蛋白质分子中的氢键和疏水作用，使蛋白质变性而改变原有的构象，特水作用，使蛋白质变性而改变原有的构象，特别是强还原剂硫基乙醇的存在，使蛋白质分子别是强还原剂硫基乙醇的存在，使蛋白质分子内的二硫键还原，从而保证蛋白质与内的二硫键还原，从而保证蛋白质与SDS结合结合形成带负电荷的形成带负电荷的蛋白质蛋白质-SDS复合物复合物。SDS聚

45、丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于 如果加入一种试剂消除电荷、形状等因素的影响，使电如果加入一种试剂消除电荷、形状等因素的影响，使电泳迁移率只取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白泳迁移率只取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。质的分子量。净电荷净电荷分子的大小分子的大小形状形状等因素等因素（SDS-PAGE）的主要用途是）的主要用途是蛋白质分子蛋白质分子量的测定量的测定蛋白质混合组分的分离蛋白质混合组分的分离蛋白质亚基组分的分析等蛋白质亚基组分的分析等四、根据亲和作用建立的纯化

46、方法四、根据亲和作用建立的纯化方法根据亲和作用建立的纯化方法根据亲和作用建立的纯化方法由于酶对底物，竞争性抑制剂由于酶对底物，竞争性抑制剂, ,辅酶等配体具有较高的亲和力，而其辅酶等配体具有较高的亲和力，而其它杂蛋白对这些配体则没有或有很弱它杂蛋白对这些配体则没有或有很弱的亲和作用，因此，可以根据酶与杂的亲和作用，因此，可以根据酶与杂蛋白对配体亲和力的差异，很容易地蛋白对配体亲和力的差异，很容易地将酶分离出来。将酶分离出来。目前已经建立的方法有目前已经建立的方法有亲和层析亲和层析法法和和亲和电泳法亲和电泳法等。等。 1、亲和层析法亲和层析法亲和层析的核心是亲和层析的核心是亲和吸附剂亲和吸附剂，

47、它是，它是由固相载体和能与目的酶专一可逆结合的由固相载体和能与目的酶专一可逆结合的配体共价结合而成的。将亲和吸附剂填充配体共价结合而成的。将亲和吸附剂填充层析柱，让酶液流过层析柱，则目的酶就层析柱，让酶液流过层析柱，则目的酶就能迅速而选择性地吸附在亲和吸附剂上，能迅速而选择性地吸附在亲和吸附剂上，用适当的溶液进行洗涤，除去一些非专一用适当的溶液进行洗涤，除去一些非专一性的杂蛋白后，再用浓度高的或亲和力更性的杂蛋白后，再用浓度高的或亲和力更强的配体溶液进行亲和洗脱目的酶便可被强的配体溶液进行亲和洗脱目的酶便可被洗脱出来。洗脱出来。亲和层析中的配体构成示意图亲和层析中的配体构成示意图Matrix:

48、 for ligand attachment, should be chemically and physically inert. Spacer arm: improve binding between ligand and target molecule by overcoming any effects of steric hindrance.Ligand: molecule that binds reversibly to a specific target molecule or group of target molecules.亲和体系的种类亲和体系的种类体系体系类类型型高特异性

49、体系 抗原单克隆抗体荷尔蒙受体蛋白核酸互补碱基链段、核酸结合蛋白酶底物、产物、抑制剂群特异性体系 免疫球蛋白蛋白A、蛋白G酶辅酶凝集素糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体酶、蛋白质肝素、活性染料、过渡金属离子、氨基酸亲和配基亲和配基(1)酶的抑制剂酶的抑制剂(2)抗体抗体(3)蛋白蛋白A(4)凝集素凝集素(5)辅酶和磷酸腺苷辅酶和磷酸腺苷(6)三嗪类染料三嗪类染料(7)过渡金属离子过渡金属离子(8)组氨酸组氨酸(9)肝素肝素亲和层析-1亲和层析-2亲和层析-3亲和层析过程示意图亲和层析过程示意图1. 用缓冲液平衡亲和介质用缓冲液平衡亲和介质2. 样品中的目标分子被连接到亲样品中的目标分子被连接到亲和

50、介质上，它们具有特异性吸附，和介质上，它们具有特异性吸附，但吸附是可逆的，可被洗脱下来。但吸附是可逆的，可被洗脱下来。3. 改变洗脱液可将目标分子洗脱改变洗脱液可将目标分子洗脱下来，如通过改变下来，如通过改变pH值、离子值、离子强度、极性等。强度、极性等。4.亲和介质用缓冲液重新平衡亲和介质用缓冲液重新平衡亲和层析过程示意图亲和层析过程示意图Equilibrationadsorption of sample and elution of unbound materialWash away unbound materialelute bound protein(s)re-equilibratio

51、nColumn Volumes (cv)2、亲和电泳亲和电泳将亲和配体共价偶联于电泳凝胶上，将亲和配体共价偶联于电泳凝胶上，由于亲和作用，待分离的酶与配体结合由于亲和作用，待分离的酶与配体结合后，在电泳中不再移动，而其它杂蛋白后，在电泳中不再移动，而其它杂蛋白不与配体结合，使目的酶分离出来。不与配体结合，使目的酶分离出来。五、根据稳定性的差异建立的分五、根据稳定性的差异建立的分离纯化方法离纯化方法1、热变性法热变性法2、酸碱变性法酸碱变性法3、表面变性法表面变性法1、热变性法热变性法根据目的酶与杂蛋白热稳定性根据目的酶与杂蛋白热稳定性差异，可以在较高温度下，使杂蛋差异，可以在较高温度下，使杂蛋

52、白变性沉淀，而酶则保持可溶状态。白变性沉淀，而酶则保持可溶状态。2、酸碱变性法酸碱变性法与热变性原理类似，目的酶与热变性原理类似，目的酶与杂蛋白的酸碱稳定性不同，可以与杂蛋白的酸碱稳定性不同，可以调整不同的调整不同的pH使杂蛋白变性沉淀。使杂蛋白变性沉淀。3、表面变性法表面变性法可将酶溶液与惰性液体混合，振可将酶溶液与惰性液体混合，振荡造成表面变性；如在酶液中加入氯荡造成表面变性；如在酶液中加入氯仿，振荡后通常可分为仿，振荡后通常可分为3层：上面为层：上面为未变性的酶，中层为乳浊状的变性蛋未变性的酶，中层为乳浊状的变性蛋白，下层为氯仿。白，下层为氯仿。作业题：1. 名词解释：酶的抽提、膜分离技术、离子交换层析、凝胶层析、凝胶点泳、酶的结晶、酶的回收率和提纯倍数2. 酶分离纯化的基本环节有哪些？3. 酶液制备的过程有哪些？4. 细胞破碎的方法有哪些？5. 说明有机溶剂沉淀分离法的优缺点。6. 酶的结晶方法有哪些？7. 分析说明酶分离纯化的应用方法（概念、原理和过程）。