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1、 色谱分析法色谱分析法 概述概述 色谱有关术语色谱有关术语 色谱法基本原理色谱法基本原理 基本色谱分离方程式基本色谱分离方程式1历史历史 俄国植物学家茨维特在俄国植物学家茨维特在19061906年使用的色谱原型装置年使用的色谱原型装置分离对象分离对象 - 植物色素植物色素色谱柱色谱柱 - 玻璃管玻璃管 固定相固定相 - 碳酸钙碳酸钙 流动相流动相 - 石油醚石油醚色谱法起源色谱法起源21931年年 胡萝卜素植物色素分离1936年年 离子交换色谱建立1940年年 吸附色谱与电泳相结合1941年年 分配色谱创立1952年年 气相色谱法建立1967年年 高效液相色谱法建立80年代后年代后 离子色谱、
2、超临界流色谱、高效毛细管电泳色谱法发展历史色谱法发展历史3 Tiselius, A.W.K. Martin, A.J.P. Synge, R.L.M. 19481948年年 Nobel Nobel 化学奖化学奖 19521952年年 Nobel Nobel 化学奖化学奖 吸附色谱与电泳吸附色谱与电泳 分配色谱分配色谱色谱法发展历史色谱法发展历史4色谱法概述色谱法概述 色谱法是一种物理化学色谱法是一种物理化学分离方法，利用不同物质在分离方法，利用不同物质在两相（固定相和流动相）中两相（固定相和流动相）中具有不同的分配系数（或吸具有不同的分配系数（或吸收系数，渗透性等），当两收系数，渗透性等），当
3、两相做相对运动时，这种物质相做相对运动时，这种物质在两相中在两相中反复多次反复多次分配，从分配，从而使各物质得到完全的分离。而使各物质得到完全的分离。5色谱法的分类色谱法的分类 按流动相与固定相的分子聚集状态分类按流动相与固定相的分子聚集状态分类气相色谱法气相色谱法液相色谱法液相色谱法超临界流体色谱法超临界流体色谱法气固色谱法气固色谱法气液色谱法气液色谱法液固色谱法液固色谱法液液色谱法液液色谱法6 按操作形式分类按操作形式分类柱色谱法柱色谱法平面色谱法平面色谱法纸色谱法纸色谱法薄层色谱法薄层色谱法 按分离机制分类按分离机制分类吸附色谱法吸附色谱法分配色谱法分配色谱法离子交换色谱离子交换色谱法法
4、空间排阻色谱空间排阻色谱法法7色谱法简单分类色谱法简单分类气相色谱法气相色谱法气相色谱法气相色谱法(GC)(GC)液相色谱法液相色谱法液相色谱法液相色谱法(LC)(LC)超临界流体色谱法超临界流体色谱法超临界流体色谱法超临界流体色谱法(SFC)(SFC)填充柱气相色谱法填充柱气相色谱法填充柱气相色谱法填充柱气相色谱法毛细管柱气相色谱法毛细管柱气相色谱法毛细管柱气相色谱法毛细管柱气相色谱法柱色谱法柱色谱法柱色谱法柱色谱法平面色谱法平面色谱法平面色谱法平面色谱法经典液相柱色谱法经典液相柱色谱法经典液相柱色谱法经典液相柱色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法(HPLC)(HP
5、LC)薄层色谱法薄层色谱法薄层色谱法薄层色谱法(TLC)(TLC)纸色谱法纸色谱法纸色谱法纸色谱法(PC)(PC)8分类分类 一般分类一般分类分离方法分离方法固定相固定相所用平衡所用平衡液相色谱液相色谱LCL-L分离分离吸附在固定相表面的液体吸附在固定相表面的液体不不同同溶溶液液之之间间分分配平衡配平衡液液 相相 -固固 定定相相固定相表面键合的有机相固定相表面键合的有机相在在液液体体与与固固定定相相表面的分布表面的分布液固或吸附液固或吸附固体固体吸附吸附离子交换离子交换离子交换树脂离子交换树脂离子交换离子交换尺寸排阻尺寸排阻聚合物中间隙聚合物中间隙分布分布/筛分筛分气气相相色色谱谱GC（流流
6、动动相相为为气气体）体）气、液气、液吸附在固定相表面的液体吸附在固定相表面的液体气配气配/气气-液液气气-键相键相固体表面键合的有机物固体表面键合的有机物气配气配/气气-液液气气-固定体固定体固体固体吸附吸附超超临临界界流流体体色色谱谱SFC（流流动动相超临界流体）相超临界流体）固体表面键合的有机物固体表面键合的有机物超超临临界界流流体体与与键键合表面的分配合表面的分配 色谱法分类色谱法分类9气相色谱气相色谱( Gas chromatography ) 填充柱气相色谱填充柱气相色谱（Packed column gas chromatography) 毛细管气相色谱毛细管气相色谱 (Capill
7、ary column gas chromatography) 裂解气相色谱裂解气相色谱(Pyrolysis gas chromatography ) 顶空气相色谱顶空气相色谱 ( Headspace gas chromatography) 气相质谱联用气相质谱联用技术技术（Gas chromatography-Mass spectrometry)液相色谱液相色谱( Liquid chromatography ) 高效液相色谱高效液相色谱( High performance liquid chromatography) 超临界流体色谱超临界流体色谱( Supercritical fluid ch
8、romatography) 高效毛细管电泳高效毛细管电泳(High performance capillary electrophoresis) 毛细管电色谱毛细管电色谱(Capillary electrochromatography) 液相质谱联用技术液相质谱联用技术（Liquid chromatography- Mass spectrometry 色谱法分类色谱法分类10平面色谱法平面色谱法（Planar chromatography） 薄层色薄层色谱谱 ( Thin layer chromatography) 薄层电泳色谱薄层电泳色谱 (Thin layer electrophoresi
9、s ) 纸色谱纸色谱( Paper chromatography) 色谱法分类色谱法分类11色谱法的特点色谱法的特点与其它分析方法相比，具有的优点：与其它分析方法相比，具有的优点：分离效能高分离效能高灵敏度高？灵敏度高？分析速度快分析速度快应用范围广应用范围广缺点：对未知物的定性比较困难缺点：对未知物的定性比较困难解决方法：与其它分析方法联用（质谱、红外和解决方法：与其它分析方法联用（质谱、红外和电化学等）电化学等）12高分离效能高分离效能高灵敏度高灵敏度?在较短的时间内能同时分离和测定极为复杂的混在较短的时间内能同时分离和测定极为复杂的混在较短的时间内能同时分离和测定极为复杂的混在较短的时间
10、内能同时分离和测定极为复杂的混合物，如采用毛细管气相色谱柱分析合物，如采用毛细管气相色谱柱分析合物，如采用毛细管气相色谱柱分析合物，如采用毛细管气相色谱柱分析4040 150150汽油，汽油，汽油，汽油，168 168 种组分可以在种组分可以在种组分可以在种组分可以在110 min110 min内一次进行分离内一次进行分离内一次进行分离内一次进行分离测定。测定。测定。测定。可以分析微量或痕量组分，如在大气污染物分析可以分析微量或痕量组分，如在大气污染物分析可以分析微量或痕量组分，如在大气污染物分析可以分析微量或痕量组分，如在大气污染物分析中，甚至可测出中，甚至可测出中，甚至可测出中，甚至可测出
11、pptppt级的微量毒物。级的微量毒物。级的微量毒物。级的微量毒物。13分析速度快分析速度快一般分析一次样品的时间为几分至几十分钟，一般分析一次样品的时间为几分至几十分钟，一般分析一次样品的时间为几分至几十分钟，一般分析一次样品的时间为几分至几十分钟，某些快速分析，某些快速分析，某些快速分析，某些快速分析，1 1 1 1秒可以分析秒可以分析秒可以分析秒可以分析7 7 7 7个组分。个组分。个组分。个组分。应用对象：气体和液体、有机物和无机物、应用对象：气体和液体、有机物和无机物、 小分子和大分子等小分子和大分子等应用领域：医药、化工、环保、食品、农药、应用领域：医药、化工、环保、食品、农药、
12、体育等体育等应用范围广应用范围广14色谱流出曲线色谱流出曲线根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组分的根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组分的最少最少个数；个数；根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析；根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析；根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析；根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析；根据色根据色谱峰的保留值及其区域宽度，可以评价色谱柱分离效能；谱峰的保留值及其区域宽度，可以评价色谱柱分离效能；根据色谱峰两峰间的距离，可以评价固定相（或流动相）选择是根据色谱峰两峰间的距离，可以评价固定相（或流动相）选择是否合适。否合适。15保留时间tR 进样到出现色谱峰顶
13、点的时间保留体积VR 进样到出现色谱峰最大时消耗 的流动相体积死时间t0 流动相流过色谱柱的时间死体积V0 色谱柱的空隙体积校正保留时间校正保留体积保留值保留值16基线：基线：无组分通过色谱柱时，检测器的噪音随时间变化 的曲线。峰宽峰宽Wb：色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距半峰宽半峰宽W1/2：峰高一半处对应的峰宽标准偏差标准偏差 ：正常色谱峰的两个拐点间距离的一半17相对保留值，选择性因子相对保留值，选择性因子( ( )色谱法基本概念色谱法基本概念- 固定相固定相对对两种组分两种组分的选择性的选择性18色谱法基本理论色谱法基本理论不能分离不能分离不能完全分离不能完全分离能完全分离能完全分
14、离峰峰之间的距离之间的距离-分配系数分配系数（热力学）（热力学）峰峰的宽窄的宽窄-柱效率柱效率（动力学）（动力学）19分配系数分配系数 K（热力学性质）（热力学性质） 一定温度下，组分在一定温度下，组分在固定相固定相和和流动相流动相之间之间分配达平衡时的浓度比。分配达平衡时的浓度比。K K只与固定相和被分离物质的性质有关只与固定相和被分离物质的性质有关K K值的值的差别是分离的先决条件，差别是分离的先决条件，差别越大，分离的可能性越大差别越大，分离的可能性越大K K值大的组分后出峰值大的组分后出峰20分配比（容量因子）： 一定温度与压力下两相达平衡后，组分在固定相和流动相量的比值固定相重量流动
15、相重量K与k的关系：容量因子k与保留值的关系:21塔板理论塔板理论 - 柱效能指标柱效能指标塔板理论塔板理论是色谱学中的热力学平是色谱学中的热力学平衡理论。它是把样品组分在色谱衡理论。它是把样品组分在色谱柱中的分离过程，视为组分在分柱中的分离过程，视为组分在分馏塔里的分馏过程，把色谱柱看馏塔里的分馏过程，把色谱柱看成一个分馏塔。成一个分馏塔。分馏塔分馏塔利用各组分的沸点不同，利用各组分的沸点不同，在塔板上经过多次气在塔板上经过多次气- -液平衡后，液平衡后，最终低沸点组分在塔顶流液的含最终低沸点组分在塔顶流液的含量高，高沸点组分在塔低层含量量高，高沸点组分在塔低层含量高，而达到分离目的。高，而
16、达到分离目的。石油裂解产物石油裂解产物22塔板理论的基本假设(1) 色谱中也存在类似分馏装置的塔板。样品中的某组分色谱中也存在类似分馏装置的塔板。样品中的某组分在色谱柱在色谱柱“H”的高度区间内可以很快达到分配平衡。的高度区间内可以很快达到分配平衡。H称为理论塔板高度，且组分在称为理论塔板高度，且组分在H高度内服从分配定律。高度内服从分配定律。(2) 样品各组分开始时存在于第样品各组分开始时存在于第0号塔板上，且试样沿色号塔板上，且试样沿色谱柱轴谱柱轴(纵纵)向的扩散可以忽略不计。向的扩散可以忽略不计。(3) 流动相进入色谱柱（洗脱过程）不是连续的，而是流动相进入色谱柱（洗脱过程）不是连续的，
17、而是间歇进入，每次进入为一个塔板体积。间歇进入，每次进入为一个塔板体积。(4) 分配系数在所有塔板上都相同，与组分在塔板上的分配系数在所有塔板上都相同，与组分在塔板上的量无关。量无关。23塔板理论塔板理论 - 柱效能指标柱效能指标 色谱柱长：色谱柱长：L 虚拟的塔板间距离：虚拟的塔板间距离：H 色谱柱的理论塔板数：色谱柱的理论塔板数：n 则三者的关系为：则三者的关系为：24塔板理论塔板理论 - 柱效能指标柱效能指标理论塔板数与色谱参数之间的关系理论塔板数与色谱参数之间的关系 ( (重点重点) ) tR: 保留时间保留时间; W1/2：半峰宽；：半峰宽；Wb:峰底宽；峰底宽；H：理论塔板高度；：
18、理论塔板高度；L：色谱柱长度；：色谱柱长度；n: 理论塔板数；理论塔板数；n有效有效：有效理论塔板数；：有效理论塔板数； H有效有效：有效塔板高度：有效塔板高度25塔板数塔板数 n n是色谱柱的特征参数。当色谱柱长度一定时，塔板数是色谱柱的特征参数。当色谱柱长度一定时，塔板数 n n 越大越大( (塔板高度塔板高度 H H 越小越小) )，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指
19、明测定物质。柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径（实际用验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径（实际用用受到限制）。用受到限制）。塔板理论塔板理论 - 几点说明几点说明26塔板理论的不足塔板理论的不足塔板理论虽然指出了理论板数n或理论板高度H对色谱柱效率的
20、影响，但是没有指出影响塔板高度的因素，因此无法在理论指导下从实验上提高色谱柱的效率。27速率理论速率理论 - 影响柱效能的因素影响柱效能的因素速率方程（也称范速率方程（也称范. .弟姆特方程式）弟姆特方程式）: : H H = = A A + + B B/ /u u + + C Cu u H H：理论塔板高度，理论塔板高度，u u：载气的线速度载气的线速度(cm/s)(cm/s)A：涡流扩散涡流扩散系数；系数； B：分子扩散分子扩散系数；系数； C：传质阻力传质阻力系数系数28A = 2dp指 dp：固定相的平均颗粒直径固定相的平均颗粒直径 ：固定相的填充不均匀因子固定相的填充不均匀因子细而均
21、匀的颗粒，填充的越均匀，细而均匀的颗粒，填充的越均匀，A，H，柱效柱效nA 涡流扩散项涡流扩散项由于组分分子在色谱柱填充不均匀的固定相中移动由于组分分子在色谱柱填充不均匀的固定相中移动途径不同所造成的色谱峰展宽。途径不同所造成的色谱峰展宽。29 B = 2 Dg ：弯曲因子，指填充柱内流动相扩散路径弯曲的因弯曲因子，指填充柱内流动相扩散路径弯曲的因素。素。 Dg：试样组分分子在流动相的扩散系数（试样组分分子在流动相的扩散系数（cmcm2 2ss-1 -1） 流速流速，滞留时间，滞留时间，扩散，扩散B/u 分子扩散项（纵向扩散项）分子扩散项（纵向扩散项）由于组分在液相中的扩散系数只有气体中的由于
22、组分在液相中的扩散系数只有气体中的1/105，因此在液，因此在液相色谱中相色谱中B可以忽略。可以忽略。由于组分在色谱柱中沿着柱长方向的扩散所致的浓度差而引由于组分在色谱柱中沿着柱长方向的扩散所致的浓度差而引起的色谱峰展宽。起的色谱峰展宽。30 传质阻力包括气相传质阻力传质阻力包括气相传质阻力Cg和和液相传质阻力液相传质阻力CL C =（Cg + CL）扩散系数扩散系数D D ，C C , ,分配平衡时间长，峰变宽分配平衡时间长，峰变宽C u 传质阻力项传质阻力项指组分在色谱柱流动相和固定相之间的传递过程（溶解或指组分在色谱柱流动相和固定相之间的传递过程（溶解或吸附等）存在不同的阻力而形成的色谱
23、峰展宽。吸附等）存在不同的阻力而形成的色谱峰展宽。31固定相传质阻力流动相传质阻力q 和 为与两相的构型和性质有关的常数dp 和 df 为固定相颗粒直径和固定液膜的厚度Ds 为试样分子在固定液的扩散系数Dm为试样分子在流动相中的扩散系数。32 影影响谱带展宽柱外效应响谱带展宽柱外效应进样器死体积大、进样量大，进样速度慢；进样器死体积大、进样量大，进样速度慢； 柱前后连接管道死体积大；柱前后连接管道死体积大； 检测器死体积大。检测器死体积大。33分离度分离度 塔板理论塔板理论和和速率理论速率理论都难以描述难分离物质对的实际分都难以描述难分离物质对的实际分离程度。即柱效为多大时，相邻两组份能够被完
24、全分离。离程度。即柱效为多大时，相邻两组份能够被完全分离。 难难分分离离物物质质对对的的分分离离度度大大小小受受色色谱谱过过程程中中两两种种因因素素的的综综合合影响：保留值之差影响：保留值之差色谱过程的热力学因素；色谱过程的热力学因素； 区域宽度区域宽度色谱过程的动力学因素色谱过程的动力学因素。 色谱分离中的四种情况如图所示：色谱分离中的四种情况如图所示： 柱效较高，柱效较高，K K( (分配系数分配系数) )较大较大, ,完全分离；完全分离； K K不是很大，柱效较高，不是很大，柱效较高，峰较窄，基本上完全分离；峰较窄，基本上完全分离；柱效较低，柱效较低，K K较大较大, ,但分离但分离的不
25、好；的不好； K K小，小，柱效低，分离效果柱效低，分离效果更差。更差。34分离度的表达式分离度的表达式R R=0.8=0.8：两峰的分离程度可达两峰的分离程度可达89%89%；R R=1=1：分离程度分离程度98%98%；R R=1.5=1.5：达：达99.7%99.7%（相邻两峰完全分离的标准）。（相邻两峰完全分离的标准）。定义：相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱定义：相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰底宽总和之半的比值。峰底宽总和之半的比值。35分离度与基本色谱分离方程式分离度与基本色谱分离方程式分离度分离度R 的定义并没有反映影响分离度的各种因素。的定义并没有反映影响分离度的
26、各种因素。实际上，分离度是受柱效（实际上，分离度是受柱效（n）、选择因子）、选择因子( () )和容量和容量因子（因子（k）三个参数的控制。）三个参数的控制。上式即为基本色谱分离方程式上式即为基本色谱分离方程式, 也可表示为也可表示为:36同理同理, , 可得可得: :也可表示为也可表示为: :分离度与基本色谱分离方程式分离度与基本色谱分离方程式37提高分离度的途径提高分离度的途径(1)(1)1. 1. 提高柱效提高柱效(1)增加柱长增加柱长: n增加增加2倍时倍时R只增大只增大1.4倍倍(2)降低塔板高度降低塔板高度H: 是提高分离度的最好方法是提高分离度的最好方法38分离度与柱效的关系分离
27、度与柱效的关系当固定相确定，被分离物质对的当固定相确定，被分离物质对的确定后，分离度将取确定后，分离度将取决于决于n。这时，对于一定理论板高的柱子，分离度的平这时，对于一定理论板高的柱子，分离度的平方与柱长成正比，即方与柱长成正比，即为了提高柱效，可采用的途径：（为了提高柱效，可采用的途径：（1）采用直）采用直径较小、粒度均匀的固定相；（径较小、粒度均匀的固定相；（2）控制较薄）控制较薄的液膜厚度；（的液膜厚度；（3)选择适宜的流动相、流速和选择适宜的流动相、流速和温度等。温度等。39提高分离度的途径提高分离度的途径(2)(2)增大容量因子增大容量因子k R 随随 k 增大而增大，但是分析时间
28、也随之延长。增大而增大，但是分析时间也随之延长。为了增大为了增大k值，可采用的方法：（值，可采用的方法：（1）GC: 增加增加固定液的用量，适当降低柱温；（固定液的用量，适当降低柱温；（2）LC: 适适当采用极性较小一些的流动相。当采用极性较小一些的流动相。40提高分离度的途径提高分离度的途径(3)(3)增大选择性因子增大选择性因子 值值由于由于 的微小变化，都对的微小变化，都对R有很大的影响，有很大的影响，增大增大 值是改善分离度的最有力的手段。值是改善分离度的最有力的手段。为了增大为了增大 值，可采用的方法：（值，可采用的方法：（1）GC: 适当适当降低柱温；（降低柱温；（2）LC: 通过控制固定相和流动通过控制固定相和流动相的性质来调整相的性质来调整 。存在的问题：存在的问题： 的变化不像的变化不像n和和k有规律可循。有规律可循。41
