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1、第二章第二章 微生物制药微生物制药1一、微生物药物的几个相关基本概念一、微生物药物的几个相关基本概念二、微生物药物的分类二、微生物药物的分类三、微生物药物的应用三、微生物药物的应用四、药源微生物及微生物药物的筛选技术四、药源微生物及微生物药物的筛选技术五、微生物药物的发酵生产技术五、微生物药物的发酵生产技术六、微生物药物的分离、精制和鉴别六、微生物药物的分离、精制和鉴别七、废弃物的综合利用和环境保护七、废弃物的综合利用和环境保护2四、药源微生物及微生物药物的筛选技术四、药源微生物及微生物药物的筛选技术（一）药物的产生菌（一）药物的产生菌（二）新药产生菌的分离（二）新药产生菌的分离（三）新微生物
2、药物的筛选（三）新微生物药物的筛选（四）微生物药物产生菌的菌种改良（四）微生物药物产生菌的菌种改良（五）微生物药物产生菌的保藏（五）微生物药物产生菌的保藏3（二）新药产生菌的分离（二）新药产生菌的分离1、土壤微生物的分离、土壤微生物的分离土壤是微生物的重要栖息地。土壤是微生物的重要栖息地。（1）采集样品）采集样品（2）分离微生物）分离微生物（3）选留菌种及保存）选留菌种及保存v分离放线菌的样品除土壤以外，还有河（湖、海）泥分离放线菌的样品除土壤以外，还有河（湖、海）泥和水、枯树叶、堆肥、动物粪便等。和水、枯树叶、堆肥、动物粪便等。v土壤样品通常采表层土（土壤样品通常采表层土（5cm5cm以下）
3、，样品以未开垦以下），样品以未开垦过的土壤为佳，要尽可能选择不同地理和生态环境的过的土壤为佳，要尽可能选择不同地理和生态环境的土壤。土壤。41、土壤微生物的分离、土壤微生物的分离（1）采集样品）采集样品（2）分离微生物）分离微生物（3）选留菌种及保存）选留菌种及保存A.样品的处理样品的处理样品的处理样品的处理B.分离培养基分离培养基分离培养基分离培养基C.抑制剂的使用抑制剂的使用抑制剂的使用抑制剂的使用D.分离方法分离方法分离方法分离方法E.培养条件培养条件培养条件培养条件F.稀有放线菌的选择性分离稀有放线菌的选择性分离稀有放线菌的选择性分离稀有放线菌的选择性分离G.其他微生物的分离其他微生物
4、的分离其他微生物的分离其他微生物的分离5利用放线菌孢子和细菌营养细胞及不同属间放线菌孢子间的利用放线菌孢子和细菌营养细胞及不同属间放线菌孢子间的耐性差异，用物理或化学的方法除去细菌及目的外放线菌，耐性差异，用物理或化学的方法除去细菌及目的外放线菌，或者用花粉作为诱饵，增加某些特定放线菌的分出率。或者用花粉作为诱饵，增加某些特定放线菌的分出率。分离前样品加热处理分离前样品加热处理处理条件处理条件样品样品分离的放线菌分离的放线菌40，216 h土壤、植物根土壤、植物根链霉菌链霉菌55，6 min水、土壤、粪便水、土壤、粪便小单孢菌、链霉菌、红球菌、小单孢菌、链霉菌、红球菌、嗜酸放线菌和嗜碱放线菌等
5、嗜酸放线菌和嗜碱放线菌等55干热，干热，10 d土壤土壤高温放线菌高温放线菌100干热，干热，15 min土壤土壤马杜拉放线菌马杜拉放线菌100120干热，干热，1 h土壤土壤马杜拉放线菌、小双孢菌，马杜拉放线菌、小双孢菌，小四孢菌，孢囊链霉菌小四孢菌，孢囊链霉菌样品的处理样品的处理A）温度）温度6B）化学试剂的处理）化学试剂的处理SDS-SDS-酵母膏处理法，酵母膏处理法，SDSSDS对放线菌孢子基本无害，酵母浸膏对放线菌孢子基本无害，酵母浸膏以及温和的热休克可以促进放线菌孢子的出芽，使细菌数明以及温和的热休克可以促进放线菌孢子的出芽，使细菌数明显减少。显减少。风干的土壤与风干的土壤与CaC
6、OCaCO3 3混合混合后在后在2626培养培养7 79 d9 d，然后分离放然后分离放线菌。风干的土壤减少了细菌的数量，线菌。风干的土壤减少了细菌的数量，CaCOCaCO3 3有利于放线菌生有利于放线菌生长而不利于绝大多数真菌的生长。长而不利于绝大多数真菌的生长。用用0.01 mol/L 0.01 mol/L NaOHNaOH处理处理土壤土壤5 510 min10 min（1515）可减少细可减少细菌的数量，有利于分离小单孢菌。菌的数量，有利于分离小单孢菌。用用1.4%1.4%酚处理酚处理土样土样10 min10 min或用或用1.4%1.4%酚酚130130处理处理30 min30 min
7、，分分别有利于获得链霉菌或小单孢菌。别有利于获得链霉菌或小单孢菌。用乙酸乙酯或氯仿和苯处理用乙酸乙酯或氯仿和苯处理样品，过滤风干后用来分离微样品，过滤风干后用来分离微生物，可以除去样品中的真菌。生物，可以除去样品中的真菌。7C）物理方法的处理）物理方法的处理离心，离心，1600 g1600 g离心离心20 min20 min，上清液主要有放线菌孢子，上清液主要有放线菌孢子，沉淀含有细菌和真菌孢子。沉淀含有细菌和真菌孢子。超声波处理，超声波处理，分离小单孢菌和链霉菌。分离小单孢菌和链霉菌。特殊器具捕集特殊器具捕集空气中的游离孢子，分离糖多孢菌。空气中的游离孢子，分离糖多孢菌。搅动，搅动，使干草上
8、孢子脱落，用于从干草中分离高温放线使干草上孢子脱落，用于从干草中分离高温放线菌。菌。膜过滤，膜过滤，将水经膜（孔径将水经膜（孔径0.450.45滤膜）过滤，浓缩水中微滤膜）过滤，浓缩水中微生物，再将膜直接贴在琼脂平板上培养。生物，再将膜直接贴在琼脂平板上培养。诱饵法，诱饵法，在培养基中添加特殊物质，如花粉、蛇皮、头在培养基中添加特殊物质，如花粉、蛇皮、头发等，可分离小瓶菌和发仙菌。发等，可分离小瓶菌和发仙菌。8分离培养基分离培养基q合成培养基合成培养基精氨酸培养基，高氏合成一号培养基，天精氨酸培养基，高氏合成一号培养基，天门冬素培养基，察氏培养基等门冬素培养基，察氏培养基等q有机培养基有机培养
9、基Waksman培养基，培养基，Bennett培养基培养基q几丁质培养基几丁质培养基只有放线菌能够利用几丁质，生长的菌只有放线菌能够利用几丁质，生长的菌落小，白色，需转接到产可溶性色素的适当培养基上加以区落小，白色，需转接到产可溶性色素的适当培养基上加以区分分qHV培养基培养基以土壤腐殖质为唯一碳源和氮源的培养基以土壤腐殖质为唯一碳源和氮源的培养基总的要求：尽量使样品中的全部放线菌都生长出来，总的要求：尽量使样品中的全部放线菌都生长出来，总的要求：尽量使样品中的全部放线菌都生长出来，总的要求：尽量使样品中的全部放线菌都生长出来，而其他微生物（细菌和真菌）又尽可能不长。而其他微生物（细菌和真菌）
10、又尽可能不长。而其他微生物（细菌和真菌）又尽可能不长。而其他微生物（细菌和真菌）又尽可能不长。9选择性分离放线菌所使用的培养基选择性分离放线菌所使用的培养基待分离的放线菌待分离的放线菌待分离的放线菌待分离的放线菌所用固体培养基中的主要成分所用固体培养基中的主要成分所用固体培养基中的主要成分所用固体培养基中的主要成分马杜拉放线菌属马杜拉放线菌属葡萄糖，甘油，葡萄糖，甘油，L-天冬酰胺，微量盐，维天冬酰胺，微量盐，维生素（生素（AV培养基）培养基）小双孢菌属小双孢菌属AV培养基培养基小单孢菌属小单孢菌属微量盐，丙酸钠，硫胺素（微量盐，丙酸钠，硫胺素（M3培养基）培养基）小四孢菌属小四孢菌属下层：葡
11、萄糖，下层：葡萄糖，L-天冬酰胺，微量盐天冬酰胺，微量盐上层上层：（水解）酪蛋白氨基酸水解）酪蛋白氨基酸诺卡菌属诺卡菌属微量盐，丙酸钠，硫胺素（微量盐，丙酸钠，硫胺素（M3培养基）培养基）嗜高温放线菌属嗜高温放线菌属半浓度营养琼脂半浓度营养琼脂链孢囊菌属链孢囊菌属葡萄糖，葡萄糖，L-天冬胺酰，微量盐（天冬胺酰，微量盐（NH2），），维生素，土壤浸出液维生素，土壤浸出液各种菌属各种菌属胶体几丁质，微量盐胶体几丁质，微量盐10抑制剂的使用抑制剂的使用加入抗真菌试剂（制霉菌素、两性霉素加入抗真菌试剂（制霉菌素、两性霉素B B、放线菌酮、丙酸钠放线菌酮、丙酸钠以及使真菌形成较小菌落的以及使真菌形成较小
12、菌落的rose rose bengalbengal等），抑制真菌生长；等），抑制真菌生长；加入抗细菌抗生素（青霉素、链霉素）抑制细菌生长，增加加入抗细菌抗生素（青霉素、链霉素）抑制细菌生长，增加放线菌的分出率；放线菌的分出率；加入某些抗生素也可抑制部分放线菌，有利于分离到一定种加入某些抗生素也可抑制部分放线菌，有利于分离到一定种类的放线菌。如新生霉素有利于分离北里孢菌属。类的放线菌。如新生霉素有利于分离北里孢菌属。11分离方法分离方法稀释法稀释法稀释法稀释法干土喷射法干土喷射法干土喷射法干土喷射法孢子飞扬法孢子飞扬法孢子飞扬法孢子飞扬法滤膜法滤膜法滤膜法滤膜法最常用，将土壤样品用无菌水（或生理
13、最常用，将土壤样品用无菌水（或生理盐水、磷酸缓冲液）制成悬液，倍比稀释，盐水、磷酸缓冲液）制成悬液，倍比稀释，涂布平板，恒温培养。涂布平板，恒温培养。用喷土机或其他方法将风干碾细的土样用喷土机或其他方法将风干碾细的土样直接喷在分离平板上。直接喷在分离平板上。将将0.220.45m的滤膜放在分离平板上，接种菌悬液或喷的滤膜放在分离平板上，接种菌悬液或喷撒干土，适温培养一段时间，放线菌菌丝可穿过滤膜小孔生撒干土，适温培养一段时间，放线菌菌丝可穿过滤膜小孔生长到培养基上，细菌只能在滤膜表面生长，去掉滤膜，深入长到培养基上，细菌只能在滤膜表面生长，去掉滤膜，深入培养基的放线菌经继续培养后长出菌落。培养
14、基的放线菌经继续培养后长出菌落。将样品置于特制瓶中，其瓶口刚好能倒置将样品置于特制瓶中，其瓶口刚好能倒置一个分离平板，剧烈振荡使孢子飞扬，撞到分一个分离平板，剧烈振荡使孢子飞扬，撞到分离平板上进行分离培养。离平板上进行分离培养。12培养条件培养条件一般培养温度为一般培养温度为2530，也有，也有3237，培养，培养714 d，生长慢的放线菌可延长培养生长慢的放线菌可延长培养1个月；个月；分离高温放线菌用分离高温放线菌用4550培养培养12 d；海水放线菌用海水放线菌用20培养培养6周左右。周左右。13稀有放线菌的选择性分离稀有放线菌的选择性分离稀有放线菌的特征：稀有放线菌的特征：q生长速度比较
15、缓慢；生长速度比较缓慢；q营养需求较为复杂；营养需求较为复杂；q比较缺乏孢子分化的能力；比较缺乏孢子分化的能力；q不能稳定保存。不能稳定保存。141516其他微生物的分离其他微生物的分离真菌的分离真菌的分离常用马铃薯葡萄糖琼脂培养基、常用马铃薯葡萄糖琼脂培养基、Martin培养基、培养基、察氏蔗糖（葡萄糖）琼脂培养基，察氏蔗糖（葡萄糖）琼脂培养基，pH偏酸性。偏酸性。为了抑制细菌的生长一般在分离培养基中加入为了抑制细菌的生长一般在分离培养基中加入-内酰胺类和氨基糖苷类等抗生素。内酰胺类和氨基糖苷类等抗生素。细菌的分离细菌的分离常用有机培养基，如牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、常用有机培养基，如牛肉膏蛋
16、白胨琼脂培养基、营养琼脂加氨基酸维生素的培养基等，营养琼脂加氨基酸维生素的培养基等，pH偏碱偏碱性。性。分离时一般加入一定量的抗真菌抗生素如制霉分离时一般加入一定量的抗真菌抗生素如制霉菌素、两性霉素、放线菌酮等，抑制真菌生长，菌素、两性霉素、放线菌酮等，抑制真菌生长，有利于细菌分离。有利于细菌分离。加入多粘菌素可大大减少加入多粘菌素可大大减少G细菌生长，使细菌生长，使G细菌得以富集。细菌得以富集。171、土壤微生物的分离、土壤微生物的分离（1）采集样品）采集样品（2）分离微生物）分离微生物（3）选留菌种及保存）选留菌种及保存将菌株的优良特性保存下来，将菌株的优良特性保存下来，将菌株的优良特性保
17、存下来，将菌株的优良特性保存下来，保持微生物的活力。保持微生物的活力。保持微生物的活力。保持微生物的活力。低温保藏法低温保藏法低温保藏法低温保藏法传代培养保藏法传代培养保藏法传代培养保藏法传代培养保藏法液体石蜡保藏法液体石蜡保藏法液体石蜡保藏法液体石蜡保藏法沙土保藏法沙土保藏法沙土保藏法沙土保藏法冷冻干燥保藏法冷冻干燥保藏法冷冻干燥保藏法冷冻干燥保藏法182、海洋微生物的分离、海洋微生物的分离19Okami等从海洋中分离放线菌的程序等从海洋中分离放线菌的程序目的目的从海水和海底沉淀物中分离放线菌从海水和海底沉淀物中分离放线菌分离的样品分离的样品 用采样器采集海水和海底沉淀物用采样器采集海水和海
18、底沉淀物前处理前处理离心和过滤海水达到浓缩，沉淀物直接离心和过滤海水达到浓缩，沉淀物直接涂平板涂平板培养基培养基各种培养基，包括含人造海水的一些培各种培养基，包括含人造海水的一些培养基（淀粉水解酪蛋白海水）养基（淀粉水解酪蛋白海水）培养培养20 ，6 w挑选菌落挑选菌落挑出全部放线菌菌落挑出全部放线菌菌落结果结果有几株产生新抗生素的菌种，包括沉淀有几株产生新抗生素的菌种，包括沉淀物中得到的产生物中得到的产生aplasmomycin的的Str. griseus20分离海洋放线菌的培养基：分离海洋放线菌的培养基：（1 1）SCSC培养基：培养基：（2 2）Z Z培养基：培养基：（3 3）普通分离放
19、线菌培养基适当稀释，）普通分离放线菌培养基适当稀释，再加入人造海水再加入人造海水213、极端微生物的分离、极端微生物的分离极端微生物是在特殊环境（如高温、低温、高盐、高碱、极端微生物是在特殊环境（如高温、低温、高盐、高碱、高压等）中形成的一类特殊的微生物，因而在分离这类高压等）中形成的一类特殊的微生物，因而在分离这类微生物时，需考虑它们生长繁殖所需的特殊条件，以设微生物时，需考虑它们生长繁殖所需的特殊条件，以设计分离与培养条件。计分离与培养条件。v分离嗜热微生物，有些菌株的最适生长分离嗜热微生物，有些菌株的最适生长温度高达温度高达8080，pHpH在在1 16 6；v分离嗜盐微生物时培养基中的
20、盐浓度可分离嗜盐微生物时培养基中的盐浓度可高达高达2.5 mol/L2.5 mol/L。224、其他微生物资源、其他微生物资源粘粘细菌细菌基因重组微生物基因重组微生物利用基因工程技术构建产生新的次级代谢产物利用基因工程技术构建产生新的次级代谢产物的基因重组微生物，逐步创立的基因重组微生物，逐步创立组合生物合成组合生物合成。利用基因重组微生物提高已有抗生素的产量和利用基因重组微生物提高已有抗生素的产量和有效组分的含量。有效组分的含量。纤维素堆囊菌（纤维素堆囊菌（Sorangium cellulosum）大环内酯类抗生素堆囊大环内酯类抗生素堆囊菌素，菌素，琥苍菌素（抗真菌）琥苍菌素（抗真菌）23组
21、合生物合成组合生物合成将产生不同抗菌药物将产生不同抗菌药物或其他生理活性中间体的基因重组到一或其他生理活性中间体的基因重组到一种微生物中，使其生物合成途径重新组种微生物中，使其生物合成途径重新组合，生产迄今自然界还没有的新的抗生合，生产迄今自然界还没有的新的抗生素或生理活性化合物。素或生理活性化合物。245、难培养微生物的分离与培养研究、难培养微生物的分离与培养研究VBNCVBNC（viable but nonculturableviable but nonculturable）指那些可培养的不分化的微生物在受到外指那些可培养的不分化的微生物在受到外界压力刺激后，通过一系列的类似分化的界压力刺激后，通过一系列的类似分化的遗传程序而使遗传程序而使自身处于一种能抵抗饥饿和自身处于一种能抵抗饥饿和压力的状态压力的状态；尽管此后；尽管此后不能用常规的培养不能用常规的培养方法恢复其生长繁殖方法恢复其生长繁殖，但实验证明它们仍，但实验证明它们仍保持生存力与致病因子和保持生存力与致病因子和/ /或基因或基因。25
