层析技术duPPT课件

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1、第三章第三章 层析技术层析技术 chromatography technology层析法又称色层分析法或色谱法层析法又称色层分析法或色谱法层析法又称色层分析法或色谱法层析法又称色层分析法或色谱法1903-19061903-1906年，俄国植物学家年，俄国植物学家年，俄国植物学家年，俄国植物学家M. M. TswettTswett首先系统提出来的。首先系统提出来的。首先系统提出来的。首先系统提出来的。将叶绿素的石油醚溶液通过将叶绿素的石油醚溶液通过将叶绿素的石油醚溶液通过将叶绿素的石油醚溶液通过CaCOCaCO3 3管柱，并继续以石油醚淋管柱，并继续以石油醚淋管柱，并继续以石油醚淋管柱，并继续以

2、石油醚淋洗，由于洗，由于洗，由于洗，由于CaCOCaCO3 3对叶绿素中各种对叶绿素中各种对叶绿素中各种对叶绿素中各种色素的吸附能力不同，色素被逐色素的吸附能力不同，色素被逐色素的吸附能力不同，色素被逐色素的吸附能力不同，色素被逐渐分离，在管柱中出现了不同颜渐分离，在管柱中出现了不同颜渐分离，在管柱中出现了不同颜渐分离，在管柱中出现了不同颜色的谱带或称色谱图色的谱带或称色谱图色的谱带或称色谱图色的谱带或称色谱图（ChromatogramChromatogram）。）。）。）。 19311931年将该方法应用到分离复杂的有机混合物，年将该方法应用到分离复杂的有机混合物，年将该方法应用到分离复杂的

3、有机混合物，年将该方法应用到分离复杂的有机混合物，人们才发现了它的广泛用途。人们才发现了它的广泛用途。人们才发现了它的广泛用途。人们才发现了它的广泛用途。英国生物学家英国生物学家英国生物学家英国生物学家MartinMartin和和和和SyngeSynge，首先提出了色谱塔，首先提出了色谱塔，首先提出了色谱塔，首先提出了色谱塔板理论。并根据液板理论。并根据液板理论。并根据液板理论。并根据液- -液逆流萃取的原理，发明了液液逆流萃取的原理，发明了液液逆流萃取的原理，发明了液液逆流萃取的原理，发明了液- -液分配色谱。液分配色谱。液分配色谱。液分配色谱。他们预言：一、流动相可用气体代替液体，与液他们

4、预言：一、流动相可用气体代替液体，与液他们预言：一、流动相可用气体代替液体，与液他们预言：一、流动相可用气体代替液体，与液体相比，物质间的作用力减小了，这对分离更有体相比，物质间的作用力减小了，这对分离更有体相比，物质间的作用力减小了，这对分离更有体相比，物质间的作用力减小了，这对分离更有好处；二、使用非常细的颗粒填料并在柱两端施好处；二、使用非常细的颗粒填料并在柱两端施好处；二、使用非常细的颗粒填料并在柱两端施好处；二、使用非常细的颗粒填料并在柱两端施加较大的压差，应能得到最小的理论塔板高加较大的压差，应能得到最小的理论塔板高加较大的压差，应能得到最小的理论塔板高加较大的压差，应能得到最小的

5、理论塔板高( (即增即增即增即增加了理论塔板数加了理论塔板数加了理论塔板数加了理论塔板数) )，这将会大大提高分离效率。，这将会大大提高分离效率。，这将会大大提高分离效率。，这将会大大提高分离效率。前者预见了气相色谱的产生，并在前者预见了气相色谱的产生，并在前者预见了气相色谱的产生，并在前者预见了气相色谱的产生，并在19521952年诞生了年诞生了年诞生了年诞生了气相色谱仪，它给挥发性的化合物的分离测定带气相色谱仪，它给挥发性的化合物的分离测定带气相色谱仪，它给挥发性的化合物的分离测定带气相色谱仪，它给挥发性的化合物的分离测定带来了划时代的变革；来了划时代的变革；来了划时代的变革；来了划时代的

6、变革；后者预见了高效液相色谱（后者预见了高效液相色谱（后者预见了高效液相色谱（后者预见了高效液相色谱（HPLCHPLC）的产生，在）的产生，在）的产生，在）的产生，在6060年代末也为人们所实现。年代末也为人们所实现。年代末也为人们所实现。年代末也为人们所实现。MartinMartin和和和和SyngeSynge于于于于19521952年被授予诺贝尔化学奖。年被授予诺贝尔化学奖。年被授予诺贝尔化学奖。年被授予诺贝尔化学奖。如今的色层分析法经常用于分离无色的物质，已如今的色层分析法经常用于分离无色的物质，已如今的色层分析法经常用于分离无色的物质，已如今的色层分析法经常用于分离无色的物质，已没有颜

7、色这个特殊的含义。但色谱法或色层分析没有颜色这个特殊的含义。但色谱法或色层分析没有颜色这个特殊的含义。但色谱法或色层分析没有颜色这个特殊的含义。但色谱法或色层分析法这个名字仍保留下来沿用。现在我们简称为层法这个名字仍保留下来沿用。现在我们简称为层法这个名字仍保留下来沿用。现在我们简称为层法这个名字仍保留下来沿用。现在我们简称为层析法或层析技术。析法或层析技术。析法或层析技术。析法或层析技术。第三章第三章 层析技术层析技术第一节第一节 层析的原理层析的原理第二节第二节 层析法的分类层析法的分类 第三节第三节 层析法常用实验技术层析法常用实验技术 第四节第四节 柱层析的基本装置及基本操作柱层析的基

8、本装置及基本操作 第五节第五节 凝胶层析凝胶层析第六节第六节 离子交换层析离子交换层析第七节第七节 亲和层析亲和层析1.1 固定相固定相固定相是层析的一个基质。它可以是固体物固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂、凝胶、离子交换剂等），质（如吸附剂、凝胶、离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、交换等作用。合物进行可逆的吸附、溶解、交换等作用。固定相固定相对层析的效果起着关键的作用。对层析的效果起着关键的作用。第一节第一节 层析的原理层析

9、的原理1.2 流动相流动相在层析过程中，推动固定相上待分离的物质在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。流动相。柱层析中一般称为洗脱剂柱层析中一般称为洗脱剂薄层层析时称为展层剂。薄层层析时称为展层剂。1.3 分配系数分配系数分配系数是指在一定的条件下，某种组分在分配系数是指在一定的条件下，某种组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比值，常固定相和流动相中含量（浓度）的比值，常用用K来表示。来表示。 K=Cs/Cm Cs: 固定相中的浓度固定相中的浓度 Cm: 流动相中的浓度。流动相中的浓度。K为热力学常数：与组分性

10、质、固定相性质、为热力学常数：与组分性质、固定相性质、流动相性质及温度有关。实验条件固定，流动相性质及温度有关。实验条件固定，K仅与组分性质有关仅与组分性质有关，是层析中分离纯化物质，是层析中分离纯化物质的主要依据的主要依据分配系数与温度的关系：分配系数与温度的关系：分配系数与温度的关系：分配系数与温度的关系： lnKlnK = = ( ( GG0 0/RT) /RT) K K为分配系数（或平衡常数），为分配系数（或平衡常数），为分配系数（或平衡常数），为分配系数（或平衡常数）， GG0 0为标准自由能为标准自由能为标准自由能为标准自由能变化，变化，变化，变化，R R为气体常数，为气体常数，为

11、气体常数，为气体常数，T T为绝对温度为绝对温度为绝对温度为绝对温度这是层析分离的热力学基础。一般情况下，层析这是层析分离的热力学基础。一般情况下，层析这是层析分离的热力学基础。一般情况下，层析这是层析分离的热力学基础。一般情况下，层析时组分的时组分的时组分的时组分的 GG0 0为负值，则温度与分配系数成反比为负值，则温度与分配系数成反比为负值，则温度与分配系数成反比为负值，则温度与分配系数成反比关系。关系。关系。关系。通常温度上升通常温度上升通常温度上升通常温度上升2020，KK值下降一半，它将导致组值下降一半，它将导致组值下降一半，它将导致组值下降一半，它将导致组分移动速率增加。这也是为什

12、么在层析时最好采分移动速率增加。这也是为什么在层析时最好采分移动速率增加。这也是为什么在层析时最好采分移动速率增加。这也是为什么在层析时最好采用恒温柱的原因。用恒温柱的原因。用恒温柱的原因。用恒温柱的原因。对于对于对于对于KK值相近的不同物质，可通过改变温度的方值相近的不同物质，可通过改变温度的方值相近的不同物质，可通过改变温度的方值相近的不同物质，可通过改变温度的方法，增大法，增大法，增大法，增大KK值之间的差异，达到分离的目的。值之间的差异，达到分离的目的。值之间的差异，达到分离的目的。值之间的差异，达到分离的目的。 1.4 保留时间保留时间tR从进样开始到某组分色谱峰顶（浓度极大点）从进

13、样开始到某组分色谱峰顶（浓度极大点）的时间，即组分在色谱柱中的停留时间或组的时间，即组分在色谱柱中的停留时间或组分流经色谱柱所需要的时间。分流经色谱柱所需要的时间。 1.5 死时间死时间t0或或tm分配系数为零的组分的保留时间，即组分在分配系数为零的组分的保留时间，即组分在流动相中的停留时间或流动相流经色谱柱所流动相中的停留时间或流动相流经色谱柱所需要的时间（又称流动相保留时间）。需要的时间（又称流动相保留时间）。 1.6 迁移率（或比移值）迁移率（或比移值）在一定条件下，在相同的时间内某一组分在一定条件下，在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相本身移动的在固定相移动的距离与流动相本

14、身移动的距离之比值。常用距离之比值。常用Rf来表示。来表示。Rf小于或等于小于或等于1。K增加，增加，Rf减少；反之，减少；反之， K减少，减少，Rf增加。增加。1.7 相对迁移率相对迁移率在一定条件下，在相同时间内，某一组分在在一定条件下，在相同时间内，某一组分在固定相中移动的距离与某一标准物质在固固定相中移动的距离与某一标准物质在固定相中移动的距离之比值。定相中移动的距离之比值。可以小于等于可以小于等于1，也可以大于，也可以大于1。用用Rx来表示。不同物质的分配系数或迁移来表示。不同物质的分配系数或迁移率是不同的。分配系数或迁移率的差异程率是不同的。分配系数或迁移率的差异程度是决定几种物质

15、采用层析方法能否分离度是决定几种物质采用层析方法能否分离的先决条件。很显然，差异越大，分离效的先决条件。很显然，差异越大，分离效果越理想。果越理想。 1.8 1.8 分辨率（或分离度）分辨率（或分离度）分辨率（或分离度）分辨率（或分离度）相邻两个峰的分开程度。用相邻两个峰的分开程度。用相邻两个峰的分开程度。用相邻两个峰的分开程度。用R Rs s来表示。来表示。来表示。来表示。 Rs值越大，值越大，两种组分分两种组分分离的越好。离的越好。Rs值越大，两种组分分离的越好。值越大，两种组分分离的越好。当当Rs = 1时，两组分具有较好的分离，互时，两组分具有较好的分离，互相沾染约相沾染约2%，即每种

16、组分的纯度约为，即每种组分的纯度约为98%。当当Rs=1.5时，两组分基本完全分开，每种时，两组分基本完全分开，每种组分的纯度可达到组分的纯度可达到99.8%。如果两种组分的浓度相差较大时，尤其如果两种组分的浓度相差较大时，尤其要求较高的分辨率。要求较高的分辨率。 1.9 1.9 操作容量（或交换容量）操作容量（或交换容量）操作容量（或交换容量）操作容量（或交换容量）在一定条件下，某种组分与基质（固定相）反应在一定条件下，某种组分与基质（固定相）反应在一定条件下，某种组分与基质（固定相）反应在一定条件下，某种组分与基质（固定相）反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量，我们称达到平衡时，存在于基

17、质上的饱和容量，我们称达到平衡时，存在于基质上的饱和容量，我们称达到平衡时，存在于基质上的饱和容量，我们称为操作容量（或交换容量）。为操作容量（或交换容量）。为操作容量（或交换容量）。为操作容量（或交换容量）。数值越大，表明基质对该物质的亲合力越强。数值越大，表明基质对该物质的亲合力越强。数值越大，表明基质对该物质的亲合力越强。数值越大，表明基质对该物质的亲合力越强。同一种基质对不同种类分子的操作容量是不相同同一种基质对不同种类分子的操作容量是不相同同一种基质对不同种类分子的操作容量是不相同同一种基质对不同种类分子的操作容量是不相同的，这主要是由于分子大小（空间效应）、带电的，这主要是由于分子

18、大小（空间效应）、带电的，这主要是由于分子大小（空间效应）、带电的，这主要是由于分子大小（空间效应）、带电荷的多少、溶剂的性质等多种因素的影响。荷的多少、溶剂的性质等多种因素的影响。荷的多少、溶剂的性质等多种因素的影响。荷的多少、溶剂的性质等多种因素的影响。实际操作时，加入的样品量要尽量少些，特别是实际操作时，加入的样品量要尽量少些，特别是实际操作时，加入的样品量要尽量少些，特别是实际操作时，加入的样品量要尽量少些，特别是生物大分子，样品的加入量更要进行控制，否则生物大分子，样品的加入量更要进行控制，否则生物大分子，样品的加入量更要进行控制，否则生物大分子，样品的加入量更要进行控制，否则用层析

19、办法不能得到有效的分离。用层析办法不能得到有效的分离。用层析办法不能得到有效的分离。用层析办法不能得到有效的分离。第二节第二节 层析法的分类层析法的分类 2.1 按两相所处状态分类按两相所处状态分类流动相流动相液体液体气体气体固固定定相相液体液体液液-液层析法液层析法气气-液层析法液层析法固体固体液液-固层析法固层析法气气-固层析法固层析法2.2 按层析原理分类按层析原理分类 名称名称名称名称分离原理分离原理分离原理分离原理 吸附层析法吸附层析法吸附层析法吸附层析法组份在吸附剂表面吸附固定相是固体吸附剂，组份在吸附剂表面吸附固定相是固体吸附剂，组份在吸附剂表面吸附固定相是固体吸附剂，组份在吸附

20、剂表面吸附固定相是固体吸附剂，各能力不同各能力不同各能力不同各能力不同分配层析法分配层析法分配层析法分配层析法各组份在流动相和静止液相（固相）中的分各组份在流动相和静止液相（固相）中的分各组份在流动相和静止液相（固相）中的分各组份在流动相和静止液相（固相）中的分配系数不同配系数不同配系数不同配系数不同离子交换层析离子交换层析离子交换层析离子交换层析法法法法固定相是离子交换剂，各组份与离子交换剂固定相是离子交换剂，各组份与离子交换剂固定相是离子交换剂，各组份与离子交换剂固定相是离子交换剂，各组份与离子交换剂亲和力不同亲和力不同亲和力不同亲和力不同凝胶层析法凝胶层析法凝胶层析法凝胶层析法固定相是多

21、孔凝胶，各组份的分子大小不同，固定相是多孔凝胶，各组份的分子大小不同，固定相是多孔凝胶，各组份的分子大小不同，固定相是多孔凝胶，各组份的分子大小不同，因而在凝胶上受阻滞的程度不同因而在凝胶上受阻滞的程度不同因而在凝胶上受阻滞的程度不同因而在凝胶上受阻滞的程度不同亲和层析法亲和层析法亲和层析法亲和层析法固定相只能与一种待分离组份专一结合，以固定相只能与一种待分离组份专一结合，以固定相只能与一种待分离组份专一结合，以固定相只能与一种待分离组份专一结合，以此和无亲和力的其它组份分离此和无亲和力的其它组份分离此和无亲和力的其它组份分离此和无亲和力的其它组份分离2.3 按操作形式不同分类按操作形式不同分

22、类名称名称名称名称操作形式操作形式操作形式操作形式纸层析法纸层析法纸层析法纸层析法用滤纸作液体的载体，点样后用流动相展开，用滤纸作液体的载体，点样后用流动相展开，用滤纸作液体的载体，点样后用流动相展开，用滤纸作液体的载体，点样后用流动相展开，使各组份分离使各组份分离使各组份分离使各组份分离薄膜层析法薄膜层析法薄膜层析法薄膜层析法将适当的高分子有机吸附剂制成薄膜，以类将适当的高分子有机吸附剂制成薄膜，以类将适当的高分子有机吸附剂制成薄膜，以类将适当的高分子有机吸附剂制成薄膜，以类似纸层析方法进行物质的分离似纸层析方法进行物质的分离似纸层析方法进行物质的分离似纸层析方法进行物质的分离薄层层析法薄层

23、层析法薄层层析法薄层层析法将适当粘度的固定相均匀涂铺在薄板上，点将适当粘度的固定相均匀涂铺在薄板上，点将适当粘度的固定相均匀涂铺在薄板上，点将适当粘度的固定相均匀涂铺在薄板上，点样后用流动相展开，使各组份分离样后用流动相展开，使各组份分离样后用流动相展开，使各组份分离样后用流动相展开，使各组份分离柱层析法柱层析法柱层析法柱层析法固定相装于柱内，使样品沿着一个方向前移固定相装于柱内，使样品沿着一个方向前移固定相装于柱内，使样品沿着一个方向前移固定相装于柱内，使样品沿着一个方向前移而达分离而达分离而达分离而达分离2.4 2.4 正相色谱与反相色谱正相色谱与反相色谱正相色谱与反相色谱正相色谱与反相色

24、谱正相色谱是指固定相的极性高于流动相的极性，正相色谱是指固定相的极性高于流动相的极性，正相色谱是指固定相的极性高于流动相的极性，正相色谱是指固定相的极性高于流动相的极性，因此，在这种层析过程中非极性分子或极性小的因此，在这种层析过程中非极性分子或极性小的因此，在这种层析过程中非极性分子或极性小的因此，在这种层析过程中非极性分子或极性小的分子比极性大的分子移动的速度快，先从柱中流分子比极性大的分子移动的速度快，先从柱中流分子比极性大的分子移动的速度快，先从柱中流分子比极性大的分子移动的速度快，先从柱中流出来。出来。出来。出来。反相色谱是指固定相的极性低于流动相的极性，反相色谱是指固定相的极性低于

25、流动相的极性，反相色谱是指固定相的极性低于流动相的极性，反相色谱是指固定相的极性低于流动相的极性，在这种层析过程中，极性大的分子比极性小的分在这种层析过程中，极性大的分子比极性小的分在这种层析过程中，极性大的分子比极性小的分在这种层析过程中，极性大的分子比极性小的分子移动的速度快而先从柱中流出。子移动的速度快而先从柱中流出。子移动的速度快而先从柱中流出。子移动的速度快而先从柱中流出。一般来说，分离纯化极性大的分子（带电离子等）一般来说，分离纯化极性大的分子（带电离子等）一般来说，分离纯化极性大的分子（带电离子等）一般来说，分离纯化极性大的分子（带电离子等）采用正相色谱（或正相柱），而分离纯化极

26、性小采用正相色谱（或正相柱），而分离纯化极性小采用正相色谱（或正相柱），而分离纯化极性小采用正相色谱（或正相柱），而分离纯化极性小的有机分子（有机酸、醇、酚等）多采用反相色的有机分子（有机酸、醇、酚等）多采用反相色的有机分子（有机酸、醇、酚等）多采用反相色的有机分子（有机酸、醇、酚等）多采用反相色谱（或反相柱）。谱（或反相柱）。谱（或反相柱）。谱（或反相柱）。 第三节第三节 层析法常用实验技术层析法常用实验技术 3.1 3.1 纸层析（纸层析（纸层析（纸层析（paper chromatographypaper chromatography）3.2 3.2 薄层层析（薄层层析（薄层层析（薄层层析

27、（thin-layer chromatographythin-layer chromatography，TLCTLC）3.3 3.3 离子交换层析（离子交换层析（离子交换层析（离子交换层析（ion exchange chromatographyion exchange chromatography）3.4 3.4 亲和层析（亲和层析（亲和层析（亲和层析（affinity chromatographyaffinity chromatography）3.5 3.5 凝胶层析法（凝胶层析法（凝胶层析法（凝胶层析法（gel chromatographygel chromatography）3.6 3.

28、6 高效液相色谱（高效液相色谱（高效液相色谱（高效液相色谱（high performance liquid high performance liquid chromatographychromatography，HPLCHPLC）：）：）：）：3.7 3.7 气相色谱（气相色谱（气相色谱（气相色谱（gas chromatographygas chromatography，GCGC）3.1 纸层析（纸层析（paper chromatography）纸层析是以滤纸作为支持物的分配层析。纸层析是以滤纸作为支持物的分配层析。滤纸纤维与水有较强的亲和力，能吸收滤纸纤维与水有较强的亲和力，能吸收22%左

29、右的水，其中左右的水，其中6%7%的水是以氢的水是以氢键形式与纤维素的羟基结合。键形式与纤维素的羟基结合。滤纸纤维与有机溶剂左右的亲和力很弱。滤纸纤维与有机溶剂左右的亲和力很弱。滤纸纤维及其结合的水作为固定相，有机溶滤纸纤维及其结合的水作为固定相，有机溶剂作为流动相。剂作为流动相。纸层析对混合物进行分离时，发生两种作用，纸层析对混合物进行分离时，发生两种作用，混合物的彼此分离是这两种因素共同作用混合物的彼此分离是这两种因素共同作用的结果。的结果。第一种是溶质在结合于纤维上的水与流过滤第一种是溶质在结合于纤维上的水与流过滤纸的有机相进行分配（即液纸的有机相进行分配（即液-液分离）液分离）第二种是

30、滤纸纤维对溶质的吸附及溶质溶解第二种是滤纸纤维对溶质的吸附及溶质溶解于流动相的不同分配比进行分配（即固于流动相的不同分配比进行分配（即固-液液分配）。分配）。双向纸层析法双向纸层析法双向纸层析法双向纸层析法在样品所含溶质较多或某些组分在单相纸层析中在样品所含溶质较多或某些组分在单相纸层析中在样品所含溶质较多或某些组分在单相纸层析中在样品所含溶质较多或某些组分在单相纸层析中的的的的R Rf f比较接近，不易明显分离时采用此法。比较接近，不易明显分离时采用此法。比较接近，不易明显分离时采用此法。比较接近，不易明显分离时采用此法。该法是将滤纸在某一特殊的溶剂系统中按一个方该法是将滤纸在某一特殊的溶剂

31、系统中按一个方该法是将滤纸在某一特殊的溶剂系统中按一个方该法是将滤纸在某一特殊的溶剂系统中按一个方向展层以后，即予以干燥。向展层以后，即予以干燥。向展层以后，即予以干燥。向展层以后，即予以干燥。转向转向转向转向9090度，在另一溶剂系统中进行展层，待溶剂度，在另一溶剂系统中进行展层，待溶剂度，在另一溶剂系统中进行展层，待溶剂度，在另一溶剂系统中进行展层，待溶剂到达所要求的距离后，取出滤纸，干燥显色，从到达所要求的距离后，取出滤纸，干燥显色，从到达所要求的距离后，取出滤纸，干燥显色，从到达所要求的距离后，取出滤纸，干燥显色，从而获得双向层析谱。而获得双向层析谱。而获得双向层析谱。而获得双向层析谱

32、。纸层析还可以与区带电泳法结合，能获得更有效纸层析还可以与区带电泳法结合，能获得更有效纸层析还可以与区带电泳法结合，能获得更有效纸层析还可以与区带电泳法结合，能获得更有效的分离方法，这种方法称为指纹谱法。的分离方法，这种方法称为指纹谱法。的分离方法，这种方法称为指纹谱法。的分离方法，这种方法称为指纹谱法。3.2 3.2 薄层层析（薄层层析（薄层层析（薄层层析（thin-layer chromatographythin-layer chromatography，TLCTLC）薄层层析是在玻璃板上涂布一层支持剂，待分离薄层层析是在玻璃板上涂布一层支持剂，待分离薄层层析是在玻璃板上涂布一层支持剂，待

33、分离薄层层析是在玻璃板上涂布一层支持剂，待分离样品点在薄层板一端，然后让推动剂从上流动，样品点在薄层板一端，然后让推动剂从上流动，样品点在薄层板一端，然后让推动剂从上流动，样品点在薄层板一端，然后让推动剂从上流动，从而使各组分得到分离的物理方法。从而使各组分得到分离的物理方法。从而使各组分得到分离的物理方法。从而使各组分得到分离的物理方法。常用的支持剂有：硅胶常用的支持剂有：硅胶常用的支持剂有：硅胶常用的支持剂有：硅胶GG、硅胶、硅胶、硅胶、硅胶GFGF、氧化铝、纤、氧化铝、纤、氧化铝、纤、氧化铝、纤维素、硅藻土、硅胶维素、硅藻土、硅胶维素、硅藻土、硅胶维素、硅藻土、硅胶GG硅藻土、纤维素硅藻

34、土、纤维素硅藻土、纤维素硅藻土、纤维素GG、DEAE-DEAE-纤维素、交联葡聚糖凝胶等。纤维素、交联葡聚糖凝胶等。纤维素、交联葡聚糖凝胶等。纤维素、交联葡聚糖凝胶等。使用的支持剂种类不同，其分离原理也不尽相同，使用的支持剂种类不同，其分离原理也不尽相同，使用的支持剂种类不同，其分离原理也不尽相同，使用的支持剂种类不同，其分离原理也不尽相同，有分配层析、吸附层析、离子交换层析、凝胶层有分配层析、吸附层析、离子交换层析、凝胶层有分配层析、吸附层析、离子交换层析、凝胶层有分配层析、吸附层析、离子交换层析、凝胶层析等多种。析等多种。析等多种。析等多种。薄层层析设备简单，操作简单，快速灵敏。薄层层析设

35、备简单，操作简单，快速灵敏。改变薄层厚度，既能作分析鉴定，又能做少改变薄层厚度，既能作分析鉴定，又能做少量制备。量制备。配合薄层扫描仪，可以同时做到定性定量分配合薄层扫描仪，可以同时做到定性定量分析，在生物化学、植物化学等领域是一类析，在生物化学、植物化学等领域是一类广泛应用的物质分离方法。广泛应用的物质分离方法。3.3 3.3 离子交换层析（离子交换层析（离子交换层析（离子交换层析（ion exchange chromatographyion exchange chromatography）离子交换层析是利用离子交换剂上的可交换离子与离子交换层析是利用离子交换剂上的可交换离子与离子交换层析是

36、利用离子交换剂上的可交换离子与离子交换层析是利用离子交换剂上的可交换离子与周围介质中被分离的各种离子间的亲和力不同，经周围介质中被分离的各种离子间的亲和力不同，经周围介质中被分离的各种离子间的亲和力不同，经周围介质中被分离的各种离子间的亲和力不同，经过交换平衡达到分离的目的的一种柱层析法。过交换平衡达到分离的目的的一种柱层析法。过交换平衡达到分离的目的的一种柱层析法。过交换平衡达到分离的目的的一种柱层析法。该法可以同时分析多种离子化合物，具有灵敏度高，该法可以同时分析多种离子化合物，具有灵敏度高，该法可以同时分析多种离子化合物，具有灵敏度高，该法可以同时分析多种离子化合物，具有灵敏度高，重复性

37、、选择性好，分离速度快等优点，是当前最重复性、选择性好，分离速度快等优点，是当前最重复性、选择性好，分离速度快等优点，是当前最重复性、选择性好，分离速度快等优点，是当前最常用的层析法之一。常用的层析法之一。常用的层析法之一。常用的层析法之一。常用于多种离子型生物分子的分离，包括蛋白质、常用于多种离子型生物分子的分离，包括蛋白质、常用于多种离子型生物分子的分离，包括蛋白质、常用于多种离子型生物分子的分离，包括蛋白质、氨基酸、多肽及核酸等。氨基酸、多肽及核酸等。氨基酸、多肽及核酸等。氨基酸、多肽及核酸等。3.4 3.4 亲和层析亲和层析亲和层析亲和层析（affinity chromatograph

38、yaffinity chromatography）亲和层析是利用某些生物分子之间专一可逆结合特亲和层析是利用某些生物分子之间专一可逆结合特亲和层析是利用某些生物分子之间专一可逆结合特亲和层析是利用某些生物分子之间专一可逆结合特性、高度专一的吸附层析类型。性、高度专一的吸附层析类型。性、高度专一的吸附层析类型。性、高度专一的吸附层析类型。固体基质具有一个与之共价相连的特殊结合分子固体基质具有一个与之共价相连的特殊结合分子固体基质具有一个与之共价相连的特殊结合分子固体基质具有一个与之共价相连的特殊结合分子（如配位体），连接后的配体对互补分子的亲和力（如配位体），连接后的配体对互补分子的亲和力（如配

39、位体），连接后的配体对互补分子的亲和力（如配位体），连接后的配体对互补分子的亲和力不会改变。不会改变。不会改变。不会改变。配体是发生亲和反应的功能部位，也是载体和被亲配体是发生亲和反应的功能部位，也是载体和被亲配体是发生亲和反应的功能部位，也是载体和被亲配体是发生亲和反应的功能部位，也是载体和被亲和分子之间的桥梁。配体本身必须有两个基团：一和分子之间的桥梁。配体本身必须有两个基团：一和分子之间的桥梁。配体本身必须有两个基团：一和分子之间的桥梁。配体本身必须有两个基团：一个能与载体共价结合，一个能与被亲和分子结合。个能与载体共价结合，一个能与被亲和分子结合。个能与载体共价结合，一个能与被亲和分子

40、结合。个能与载体共价结合，一个能与被亲和分子结合。配基的固定化方法有载体结合法、物理吸附法、交配基的固定化方法有载体结合法、物理吸附法、交配基的固定化方法有载体结合法、物理吸附法、交配基的固定化方法有载体结合法、物理吸附法、交联法和包埋法等四类方法。联法和包埋法等四类方法。联法和包埋法等四类方法。联法和包埋法等四类方法。3.5 3.5 凝胶层析法（凝胶层析法（凝胶层析法（凝胶层析法（gel chromatographygel chromatography）凝胶层析法也称分子筛层析法，是指混合物随流凝胶层析法也称分子筛层析法，是指混合物随流凝胶层析法也称分子筛层析法，是指混合物随流凝胶层析法也称

41、分子筛层析法，是指混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。小不同而被分离的技术。小不同而被分离的技术。小不同而被分离的技术。该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高，除常用于分离纯化蛋白质、核酸、多糖、率高，除常用于分离纯化蛋白质、核酸、多糖、率高，除常用于分离纯化蛋白质、核酸、多糖、率高，除常用于分离纯化

42、蛋白质、核酸、多糖、激素等物质外，还可以用于测定蛋白质的相对分激素等物质外，还可以用于测定蛋白质的相对分激素等物质外，还可以用于测定蛋白质的相对分激素等物质外，还可以用于测定蛋白质的相对分子质量，以及样品的脱盐和浓缩等。子质量，以及样品的脱盐和浓缩等。子质量，以及样品的脱盐和浓缩等。子质量，以及样品的脱盐和浓缩等。常用的凝胶类型有：交联葡聚糖凝胶，琼脂糖凝常用的凝胶类型有：交联葡聚糖凝胶，琼脂糖凝常用的凝胶类型有：交联葡聚糖凝胶，琼脂糖凝常用的凝胶类型有：交联葡聚糖凝胶，琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶等。胶，聚丙烯酰胺凝胶等。胶，聚丙烯酰胺凝胶等。胶，聚丙烯酰胺凝胶等。3.6 高效液相色谱（高效液

43、相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）：）：高效液相色谱是一种多用途的层析方法，高效液相色谱是一种多用途的层析方法，可以使用多种固定相和流动相，并可以根可以使用多种固定相和流动相，并可以根据特定类型分子的大小、极性、可溶性或据特定类型分子的大小、极性、可溶性或吸收特性的不同将其分离开来。吸收特性的不同将其分离开来。核心部件是耐高压的色谱柱。通常由不锈核心部件是耐高压的色谱柱。通常由不锈钢制成，并且所有的组成元件、阀门等都钢制成，并且所有的组成元件、阀门等都是用可耐高压的材料制成。是用可耐高压的材料制成。溶剂运送系统的选择取决于：溶剂运送

44、系统的选择取决于：等度（无梯等度（无梯度）分离：在整个分析过程中只使用一种度）分离：在整个分析过程中只使用一种溶剂（或混合溶剂）；溶剂（或混合溶剂）；梯度洗脱分离：梯度洗脱分离：使用一种微处理机控制的梯度程序来改变使用一种微处理机控制的梯度程序来改变流动相的组分，该程序可通过混合适量的流动相的组分，该程序可通过混合适量的两种不同物质来产生所需要的梯度。两种不同物质来产生所需要的梯度。由于由于HPLC的高速、灵敏和多用途等优点，的高速、灵敏和多用途等优点，它成为许多生物小分子分离所选择的方法，它成为许多生物小分子分离所选择的方法，常用的是反相分配层析法。常用的是反相分配层析法。3.7 3.7 气

45、相色谱（气相色谱（气相色谱（气相色谱（gas chromatographygas chromatography，GCGC）现代的气相色谱使用长达现代的气相色谱使用长达现代的气相色谱使用长达现代的气相色谱使用长达50m50m的毛细管层析柱（内径的毛细管层析柱（内径的毛细管层析柱（内径的毛细管层析柱（内径为为为为0.10.5mm0.10.5mm）。）。）。）。固定相通常为一种交联的硅多体，附着在毛细管内壁固定相通常为一种交联的硅多体，附着在毛细管内壁固定相通常为一种交联的硅多体，附着在毛细管内壁固定相通常为一种交联的硅多体，附着在毛细管内壁成一层膜。在正常操作温度下，其性质类似于液体膜，成一层膜。

46、在正常操作温度下，其性质类似于液体膜，成一层膜。在正常操作温度下，其性质类似于液体膜，成一层膜。在正常操作温度下，其性质类似于液体膜，但要结实的多。但要结实的多。但要结实的多。但要结实的多。流动相（载气）通常为氮气或氢气。流动相（载气）通常为氮气或氢气。流动相（载气）通常为氮气或氢气。流动相（载气）通常为氮气或氢气。大多数生物大分子的分离受柱温的影响。柱温有时在大多数生物大分子的分离受柱温的影响。柱温有时在大多数生物大分子的分离受柱温的影响。柱温有时在大多数生物大分子的分离受柱温的影响。柱温有时在分析过程中维持恒定（通常分析过程中维持恒定（通常分析过程中维持恒定（通常分析过程中维持恒定（通常5

47、025050250），更常见的），更常见的），更常见的），更常见的为设定一个增温的程序（如以每分钟为设定一个增温的程序（如以每分钟为设定一个增温的程序（如以每分钟为设定一个增温的程序（如以每分钟1010的速度从的速度从的速度从的速度从5050升高到升高到升高到升高到250250）。）。）。）。样品通过一个包含有气紧阀门的注射孔注入柱顶部。样品通过一个包含有气紧阀门的注射孔注入柱顶部。样品通过一个包含有气紧阀门的注射孔注入柱顶部。样品通过一个包含有气紧阀门的注射孔注入柱顶部。柱中的产物可用下列方法检测出：柱中的产物可用下列方法检测出：柱中的产物可用下列方法检测出：柱中的产物可用下列方法检测出：1

48、) 1) 火焰离子检测法：流出气体通过一种可使任何有机复火焰离子检测法：流出气体通过一种可使任何有机复火焰离子检测法：流出气体通过一种可使任何有机复火焰离子检测法：流出气体通过一种可使任何有机复合物离子化的火焰，被固定在火焰顶部附近的电极所合物离子化的火焰，被固定在火焰顶部附近的电极所合物离子化的火焰，被固定在火焰顶部附近的电极所合物离子化的火焰，被固定在火焰顶部附近的电极所检测。检测。检测。检测。2) 2) 电子捕获法：使用一种发射电子捕获法：使用一种发射电子捕获法：使用一种发射电子捕获法：使用一种发射 射线的放射性同位素作射线的放射性同位素作射线的放射性同位素作射线的放射性同位素作为离子化

49、的方式。可以检测极微量（为离子化的方式。可以检测极微量（为离子化的方式。可以检测极微量（为离子化的方式。可以检测极微量（pmolpmol）的亲电复）的亲电复）的亲电复）的亲电复合物。合物。合物。合物。3) 3) 分光光度计法：包括质谱分析法（分光光度计法：包括质谱分析法（分光光度计法：包括质谱分析法（分光光度计法：包括质谱分析法（GC-MSGC-MS）和远红）和远红）和远红）和远红光谱分析法（光谱分析法（光谱分析法（光谱分析法（GC-IRGC-IR）。）。）。）。4) 4) 电导法：流出气体中的组成成分的改变会引起铂电缆电导法：流出气体中的组成成分的改变会引起铂电缆电导法：流出气体中的组成成分

50、的改变会引起铂电缆电导法：流出气体中的组成成分的改变会引起铂电缆电阻的变化。电阻的变化。电阻的变化。电阻的变化。第四节第四节 柱层析的基本装置及基本操作柱层析的基本装置及基本操作 柱柱层层析析的的基基本本装装置置4.14.2 柱层析的基本操作柱层析的基本操作 装柱装柱 平衡平衡 加样加样 洗脱洗脱 收集、鉴定及保存收集、鉴定及保存 基质（吸附剂、交换树脂或凝胶等）基质（吸附剂、交换树脂或凝胶等）的再生的再生 装柱装柱装柱装柱根据层析的基质和分离目的选好柱子。一般柱子根据层析的基质和分离目的选好柱子。一般柱子根据层析的基质和分离目的选好柱子。一般柱子根据层析的基质和分离目的选好柱子。一般柱子的直

51、径与长度比为的直径与长度比为的直径与长度比为的直径与长度比为1:10501:1050；凝胶柱可以选；凝胶柱可以选；凝胶柱可以选；凝胶柱可以选1:1002001:100200，同时将柱子洗涤干净。，同时将柱子洗涤干净。，同时将柱子洗涤干净。，同时将柱子洗涤干净。将层析用的基质（如吸附剂、树脂、凝胶等）在将层析用的基质（如吸附剂、树脂、凝胶等）在将层析用的基质（如吸附剂、树脂、凝胶等）在将层析用的基质（如吸附剂、树脂、凝胶等）在适当的溶剂或缓冲液中溶胀，并用适当浓度的酸适当的溶剂或缓冲液中溶胀，并用适当浓度的酸适当的溶剂或缓冲液中溶胀，并用适当浓度的酸适当的溶剂或缓冲液中溶胀，并用适当浓度的酸（0

52、.5N1N0.5N1N）、碱（）、碱（）、碱（）、碱（0.5N1N0.5N1N）、盐）、盐）、盐）、盐（0.5M1M0.5M1M）溶液洗涤处理，以除去其表面可能）溶液洗涤处理，以除去其表面可能）溶液洗涤处理，以除去其表面可能）溶液洗涤处理，以除去其表面可能吸附的杂质。吸附的杂质。吸附的杂质。吸附的杂质。然后用去离子水（或蒸馏水）洗涤干净并真空抽然后用去离子水（或蒸馏水）洗涤干净并真空抽然后用去离子水（或蒸馏水）洗涤干净并真空抽然后用去离子水（或蒸馏水）洗涤干净并真空抽气（吸附剂等与溶液混合在一起），以除去其内气（吸附剂等与溶液混合在一起），以除去其内气（吸附剂等与溶液混合在一起），以除去其内气

53、（吸附剂等与溶液混合在一起），以除去其内部的气泡。部的气泡。部的气泡。部的气泡。关闭层析柱出水口，并装入关闭层析柱出水口，并装入关闭层析柱出水口，并装入关闭层析柱出水口，并装入1/31/3柱高的缓冲液，并柱高的缓冲液，并柱高的缓冲液，并柱高的缓冲液，并将处理好的吸附剂等缓慢地倒入柱中，使其沉降将处理好的吸附剂等缓慢地倒入柱中，使其沉降将处理好的吸附剂等缓慢地倒入柱中，使其沉降将处理好的吸附剂等缓慢地倒入柱中，使其沉降约约约约3cm3cm高。高。高。高。打开出水口，控制适当流速，使吸附剂等均匀沉打开出水口，控制适当流速，使吸附剂等均匀沉打开出水口，控制适当流速，使吸附剂等均匀沉打开出水口，控制适

54、当流速，使吸附剂等均匀沉降，并不断加入吸附剂溶液。（吸附剂的多少根降，并不断加入吸附剂溶液。（吸附剂的多少根降，并不断加入吸附剂溶液。（吸附剂的多少根降，并不断加入吸附剂溶液。（吸附剂的多少根据分离样品的多少而定。）注意不能干柱、分层，据分离样品的多少而定。）注意不能干柱、分层，据分离样品的多少而定。）注意不能干柱、分层，据分离样品的多少而定。）注意不能干柱、分层，否则必须重新装柱。否则必须重新装柱。否则必须重新装柱。否则必须重新装柱。最后使柱中基质表面平坦并在表面上留有最后使柱中基质表面平坦并在表面上留有最后使柱中基质表面平坦并在表面上留有最后使柱中基质表面平坦并在表面上留有23cm23cm

55、高的缓冲液，同时关闭出水口。（采用机械化装高的缓冲液，同时关闭出水口。（采用机械化装高的缓冲液，同时关闭出水口。（采用机械化装高的缓冲液，同时关闭出水口。（采用机械化装柱法在此省略。）柱法在此省略。）柱法在此省略。）柱法在此省略。） 平衡平衡平衡平衡柱子装好后，要用所需的缓冲液（有一定的柱子装好后，要用所需的缓冲液（有一定的柱子装好后，要用所需的缓冲液（有一定的柱子装好后，要用所需的缓冲液（有一定的pHpH和和和和离子强度）平衡柱子。离子强度）平衡柱子。离子强度）平衡柱子。离子强度）平衡柱子。用恒流泵在恒定压力下走柱子（平衡与洗脱时的用恒流泵在恒定压力下走柱子（平衡与洗脱时的用恒流泵在恒定压力

56、下走柱子（平衡与洗脱时的用恒流泵在恒定压力下走柱子（平衡与洗脱时的压力尽可能保持相同）。压力尽可能保持相同）。压力尽可能保持相同）。压力尽可能保持相同）。平衡液体积一般为平衡液体积一般为平衡液体积一般为平衡液体积一般为3535倍柱床体积，以保证平衡后倍柱床体积，以保证平衡后倍柱床体积，以保证平衡后倍柱床体积，以保证平衡后柱床体积稳定及基质充分平衡。柱床体积稳定及基质充分平衡。柱床体积稳定及基质充分平衡。柱床体积稳定及基质充分平衡。如果需要，可用兰色葡聚糖如果需要，可用兰色葡聚糖如果需要，可用兰色葡聚糖如果需要，可用兰色葡聚糖20002000在恒压下走柱，在恒压下走柱，在恒压下走柱，在恒压下走柱

57、，如色带均匀下降，则说明柱子是均匀的。如色带均匀下降，则说明柱子是均匀的。如色带均匀下降，则说明柱子是均匀的。如色带均匀下降，则说明柱子是均匀的。有时柱子平衡好后，还要进行转型处理。如离子有时柱子平衡好后，还要进行转型处理。如离子有时柱子平衡好后，还要进行转型处理。如离子有时柱子平衡好后，还要进行转型处理。如离子交换层析。交换层析。交换层析。交换层析。 加样加样加样加样加样量的多少直接影响分离的效果。加样量的多少直接影响分离的效果。加样量的多少直接影响分离的效果。加样量的多少直接影响分离的效果。加样时应缓慢小心地将样品溶液加到固定相表面，加样时应缓慢小心地将样品溶液加到固定相表面，加样时应缓慢

58、小心地将样品溶液加到固定相表面，加样时应缓慢小心地将样品溶液加到固定相表面，尽量避免冲击基质，以保持基质表面平坦。尽量避免冲击基质，以保持基质表面平坦。尽量避免冲击基质，以保持基质表面平坦。尽量避免冲击基质，以保持基质表面平坦。一般讲，加样量尽量少些，分离效果比较好。一般讲，加样量尽量少些，分离效果比较好。一般讲，加样量尽量少些，分离效果比较好。一般讲，加样量尽量少些，分离效果比较好。通常加样量应少于通常加样量应少于通常加样量应少于通常加样量应少于20%20%的操作容量，体积应低于的操作容量，体积应低于的操作容量，体积应低于的操作容量，体积应低于5%5%的床体积，对于分析性柱层析，一般不超过床

59、的床体积，对于分析性柱层析，一般不超过床的床体积，对于分析性柱层析，一般不超过床的床体积，对于分析性柱层析，一般不超过床体积的体积的体积的体积的1%1%。最大加样量必须在具体条件下多次试验后决定。最大加样量必须在具体条件下多次试验后决定。最大加样量必须在具体条件下多次试验后决定。最大加样量必须在具体条件下多次试验后决定。 洗脱洗脱洗脱洗脱洗脱的方式可分为简单洗脱、分步洗脱和梯度洗脱洗脱的方式可分为简单洗脱、分步洗脱和梯度洗脱洗脱的方式可分为简单洗脱、分步洗脱和梯度洗脱洗脱的方式可分为简单洗脱、分步洗脱和梯度洗脱三种。三种。三种。三种。简单洗脱：柱子始终用同样的一种溶剂洗脱，直到简单洗脱：柱子始

60、终用同样的一种溶剂洗脱，直到简单洗脱：柱子始终用同样的一种溶剂洗脱，直到简单洗脱：柱子始终用同样的一种溶剂洗脱，直到层析分离过程结束为止。如果被分离物质对固定相层析分离过程结束为止。如果被分离物质对固定相层析分离过程结束为止。如果被分离物质对固定相层析分离过程结束为止。如果被分离物质对固定相的亲合力差异不大，其区带的洗脱时间间隔（或洗的亲合力差异不大，其区带的洗脱时间间隔（或洗的亲合力差异不大，其区带的洗脱时间间隔（或洗的亲合力差异不大，其区带的洗脱时间间隔（或洗脱体积间隔）也不长，采用这种方法是适宜的。脱体积间隔）也不长，采用这种方法是适宜的。脱体积间隔）也不长，采用这种方法是适宜的。脱体积

61、间隔）也不长，采用这种方法是适宜的。分步洗脱：这种方法按照递增洗脱能力顺序排列的分步洗脱：这种方法按照递增洗脱能力顺序排列的分步洗脱：这种方法按照递增洗脱能力顺序排列的分步洗脱：这种方法按照递增洗脱能力顺序排列的几种洗脱液，进行逐级洗脱。它主要对混合物组成几种洗脱液，进行逐级洗脱。它主要对混合物组成几种洗脱液，进行逐级洗脱。它主要对混合物组成几种洗脱液，进行逐级洗脱。它主要对混合物组成简单、各组分性质差异较大或需快速分离时适用。简单、各组分性质差异较大或需快速分离时适用。简单、各组分性质差异较大或需快速分离时适用。简单、各组分性质差异较大或需快速分离时适用。每次用一种洗脱液将其中一种组分快速洗

62、脱下来。每次用一种洗脱液将其中一种组分快速洗脱下来。每次用一种洗脱液将其中一种组分快速洗脱下来。每次用一种洗脱液将其中一种组分快速洗脱下来。梯度洗脱：当混合物中组分复杂且性质差异较小梯度洗脱：当混合物中组分复杂且性质差异较小梯度洗脱：当混合物中组分复杂且性质差异较小梯度洗脱：当混合物中组分复杂且性质差异较小时，一般采用梯度洗脱。它的洗脱能力是逐步连时，一般采用梯度洗脱。它的洗脱能力是逐步连时，一般采用梯度洗脱。它的洗脱能力是逐步连时，一般采用梯度洗脱。它的洗脱能力是逐步连续增加的，梯度可以指浓度、极性、离子强度或续增加的，梯度可以指浓度、极性、离子强度或续增加的，梯度可以指浓度、极性、离子强度

63、或续增加的，梯度可以指浓度、极性、离子强度或pHpH值等。最常用的是浓度梯度。值等。最常用的是浓度梯度。值等。最常用的是浓度梯度。值等。最常用的是浓度梯度。在水溶液中，亦即离子强度梯度。可形成梯度的在水溶液中，亦即离子强度梯度。可形成梯度的在水溶液中，亦即离子强度梯度。可形成梯度的在水溶液中，亦即离子强度梯度。可形成梯度的形式有三种，如下页图所示。形式有三种，如下页图所示。形式有三种，如下页图所示。形式有三种，如下页图所示。洗脱条件的选择，也是影响层析效果的重要因素。当对所分离的混合物的性质了解较少时，一般先采用线性梯度洗脱的方式去尝试，但梯度的斜率要小一些，尽管洗脱时间较长，但对性质相近的组

64、分分离更为有利。同时还应注意洗脱时的速率。 流速的快慢将影响理论塔板高度，从而影响分辨率。事实上，速度太快，各组分在固液两相中平衡时间短，相互分不开，仍以混合组分流出。速度太慢，将增大物质的扩散，同样达不到理想的分离效果。只有多次试验才会得到合适的流速。 总之，我们必须经过反复的试验与调整（可以用正交试验或优选法），才能得到最佳的洗脱条件。还应强调的一点是，在整个洗脱过程中，千万不能干柱，否则分离纯化将会前功尽弃。 收集、鉴定及保存收集、鉴定及保存在生化实验中，基本上我们都是采用部分收在生化实验中，基本上我们都是采用部分收集器来收集分离纯化的样品。集器来收集分离纯化的样品。由于检测系统的分辨率

65、有限，洗脱峰不一定由于检测系统的分辨率有限，洗脱峰不一定能代表一个纯净的组分。因此，每管的收能代表一个纯净的组分。因此，每管的收集量不能太多，一般集量不能太多，一般1ml-5ml / 管。如果分管。如果分离的物质性质很相近，可低至离的物质性质很相近，可低至0.5ml / 管。管。在合并一个峰的各管溶液之前，还要进行鉴定。在合并一个峰的各管溶液之前，还要进行鉴定。在合并一个峰的各管溶液之前，还要进行鉴定。在合并一个峰的各管溶液之前，还要进行鉴定。例如，一个蛋白峰的各管溶液，我们要先用电泳法例如，一个蛋白峰的各管溶液，我们要先用电泳法例如，一个蛋白峰的各管溶液，我们要先用电泳法例如，一个蛋白峰的各

66、管溶液，我们要先用电泳法对各管进行鉴定。对各管进行鉴定。对各管进行鉴定。对各管进行鉴定。对于是单条带的，认为已达电泳纯，合并在一起。对于是单条带的，认为已达电泳纯，合并在一起。对于是单条带的，认为已达电泳纯，合并在一起。对于是单条带的，认为已达电泳纯，合并在一起。其他的另行处理。其他的另行处理。其他的另行处理。其他的另行处理。对于不同种类的物质采用相应的鉴定方法。对于不同种类的物质采用相应的鉴定方法。对于不同种类的物质采用相应的鉴定方法。对于不同种类的物质采用相应的鉴定方法。为了保持所得产品的稳定性与生物活性，我们一般为了保持所得产品的稳定性与生物活性，我们一般为了保持所得产品的稳定性与生物活

67、性，我们一般为了保持所得产品的稳定性与生物活性，我们一般采用透析除盐、超滤或减压薄膜浓缩，再冰冻干燥，采用透析除盐、超滤或减压薄膜浓缩，再冰冻干燥，采用透析除盐、超滤或减压薄膜浓缩，再冰冻干燥，采用透析除盐、超滤或减压薄膜浓缩，再冰冻干燥，得到干粉，在低温下保存备用。得到干粉，在低温下保存备用。得到干粉，在低温下保存备用。得到干粉，在低温下保存备用。 基质的再生基质的再生许多基质（吸附剂、交换树脂或凝胶等）价许多基质（吸附剂、交换树脂或凝胶等）价格昂贵，可以反复使用多次，所以层析后格昂贵，可以反复使用多次，所以层析后要回收处理，以备再用，严禁乱倒乱扔。要回收处理，以备再用，严禁乱倒乱扔。这也是

68、一个科研工作者的科学作风问题。这也是一个科研工作者的科学作风问题。各种基质的再生方法可参阅具体层析实验及各种基质的再生方法可参阅具体层析实验及有关文献。有关文献。 第五节第五节 凝胶层析凝胶层析5.1 凝胶层析简介凝胶层析简介5.2 凝胶层析的基本原理凝胶层析的基本原理5.4 凝胶的种类和性质凝胶的种类和性质5.3 凝胶层析的基本概念凝胶层析的基本概念5.5 凝胶的选择、处理和保存凝胶的选择、处理和保存5.6 凝胶层析操作中应注意的问题凝胶层析操作中应注意的问题 5.7 凝胶层析的应用凝胶层析的应用5.1 5.1 凝胶层析简介凝胶层析简介凝胶层析简介凝胶层析简介凝胶层析（凝胶层析（凝胶层析（凝

69、胶层析（gel chromatographygel chromatography）又称为凝胶排阻）又称为凝胶排阻）又称为凝胶排阻）又称为凝胶排阻层析（层析（层析（层析（gel exclusion chromatographygel exclusion chromatography）、分子筛）、分子筛）、分子筛）、分子筛层析（层析（层析（层析（molecular sieve chromatographymolecular sieve chromatography）、凝胶）、凝胶）、凝胶）、凝胶过滤（过滤（过滤（过滤（gel filtrationgel filtration）、凝胶渗透层析（）、凝

70、胶渗透层析（）、凝胶渗透层析（）、凝胶渗透层析（gel gel permeation chromatographypermeation chromatography）等。）等。）等。）等。它是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺它是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺它是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺它是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色谱方法。序分离样品中各个组分的液相色谱方法。序分离样品中各个组分的液相色谱方法。序分离样品中各个组分的液相色谱方法。19591959年，年，年，年，PorathPorath和和和和FlodinFlodin首次用一种多

71、孔聚合物首次用一种多孔聚合物首次用一种多孔聚合物首次用一种多孔聚合物交联葡聚糖凝胶作为柱填料，分离水溶液中不交联葡聚糖凝胶作为柱填料，分离水溶液中不交联葡聚糖凝胶作为柱填料，分离水溶液中不交联葡聚糖凝胶作为柱填料，分离水溶液中不同分子量的样品，称为凝胶过滤。同分子量的样品，称为凝胶过滤。同分子量的样品，称为凝胶过滤。同分子量的样品，称为凝胶过滤。19641964年，年，年，年，MooreMoore制备了具有不同孔径的交联聚苯制备了具有不同孔径的交联聚苯制备了具有不同孔径的交联聚苯制备了具有不同孔径的交联聚苯乙烯凝胶，能够进行有机溶剂中的分离，称为凝乙烯凝胶，能够进行有机溶剂中的分离，称为凝乙烯

72、凝胶，能够进行有机溶剂中的分离，称为凝乙烯凝胶，能够进行有机溶剂中的分离，称为凝胶渗透层析（流动相为有机溶剂的凝胶层析一般胶渗透层析（流动相为有机溶剂的凝胶层析一般胶渗透层析（流动相为有机溶剂的凝胶层析一般胶渗透层析（流动相为有机溶剂的凝胶层析一般称为凝胶渗透层析）。称为凝胶渗透层析）。称为凝胶渗透层析）。称为凝胶渗透层析）。随后这一技术得到不断的完善和发展，目前广泛随后这一技术得到不断的完善和发展，目前广泛随后这一技术得到不断的完善和发展，目前广泛随后这一技术得到不断的完善和发展，目前广泛的应用于生物化学、高分子化学等很多领域。的应用于生物化学、高分子化学等很多领域。的应用于生物化学、高分子

73、化学等很多领域。的应用于生物化学、高分子化学等很多领域。凝胶层析广泛用于蛋白质（包括酶）、核酸、多凝胶层析广泛用于蛋白质（包括酶）、核酸、多凝胶层析广泛用于蛋白质（包括酶）、核酸、多凝胶层析广泛用于蛋白质（包括酶）、核酸、多糖等生物分子的分离纯化，同时还应用于蛋白质糖等生物分子的分离纯化，同时还应用于蛋白质糖等生物分子的分离纯化，同时还应用于蛋白质糖等生物分子的分离纯化，同时还应用于蛋白质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。5.2 凝胶层析的基本原理凝胶层析的基本原理凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进

74、行分离纯化的。层析过程如图 所示。凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；而分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，分子越大的组分越先流出

75、，分子越小的组分越后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。 Gel structureAGAROSEA good gel for gel filtration contains about95% waterGel structureAgaroseDextranA hypothetical structure for SuperdexSteric exclusionMolecules are excluded from the gel bead to different extents according to their sizesGel

76、beadVery large molecules are completely excludedVery small ones get everywhere5.3 凝胶层析的基本概念凝胶层析的基本概念5.3.1 外水体积、内水体积、基质体积、柱外水体积、内水体积、基质体积、柱床体积、洗脱体积床体积、洗脱体积5.3.2 分配系数分配系数5.3.3 排阻极限排阻极限5.3.4 分级分离范围分级分离范围5.3.5 吸水率和床体积吸水率和床体积5.3.6 凝胶颗粒大小凝胶颗粒大小 V Vt tV Vo oV Vi iV Vg g 由于由于由于由于V Vg g相对很小，可以忽略不计，则有：相对很小，可以

77、忽略不计，则有：相对很小，可以忽略不计，则有：相对很小，可以忽略不计，则有：V Vt tV Vo oV Vi i 洗脱体积（洗脱体积（洗脱体积（洗脱体积（V Ve e）是指将样品中某一组分洗脱下来）是指将样品中某一组分洗脱下来）是指将样品中某一组分洗脱下来）是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。所需洗脱液的体积。所需洗脱液的体积。所需洗脱液的体积。5.3.1 洗脱体积及其他洗脱体积及其他外水体积是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积。内水体积是指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是指内水体积。基质体积是指凝胶颗粒实际骨架体积。而柱床体积就是指凝胶

78、柱所能容纳的总体积。洗脱体积是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。我们设柱床体积为Vt，外水体积为Vo，内水体积为Vi，基质体积为Vg，则有：VtVoViVg 由于Vg相对很小，可以忽略不计，则有：VtVoVi 设洗脱体积为Ve，Ve一般是介于Vo 和Vt之间的。对于完全排阻的大分子，由于其不进入凝胶颗粒内部，而只存在于流动相中，故其洗脱体积VeVo；对于完全渗透的小分子，由于它可以存在于凝胶柱整个体积内（忽略凝胶本身体积Vg），故其洗脱体积VeVt。分子量介于二者之间的分子，它们的洗脱体积也介于二者之间。有时可能会出现Ve Vt，这是由于这种分子与凝胶有吸附作用造成的。凝胶层析中的几

79、种洗脱峰如图 所示： Ve e:洗脱体积洗脱体积柱床体积柱床体积Vt可以通过加入一定量的水至层析可以通过加入一定量的水至层析柱预定标记处，然后测量水的体积来测定。柱预定标记处，然后测量水的体积来测定。外水体积外水体积Vo可以通过测定完全排阻的大分子可以通过测定完全排阻的大分子物质的洗脱体积来测定，一般常用蓝色葡聚物质的洗脱体积来测定，一般常用蓝色葡聚糖糖-2000作为测定外水体积的物质。因为它作为测定外水体积的物质。因为它的分子量大（为的分子量大（为200万），在各种型号的凝万），在各种型号的凝胶中都被排阻，并且它呈蓝色，易于观察和胶中都被排阻，并且它呈蓝色，易于观察和检测。检测。 5.3.2

80、 5.3.2 分配系数分配系数分配系数分配系数分配系数是指某个组分在固定相和流动相中的浓度分配系数是指某个组分在固定相和流动相中的浓度分配系数是指某个组分在固定相和流动相中的浓度分配系数是指某个组分在固定相和流动相中的浓度比。比。比。比。对于凝胶层析，分配系数实质上表示某个组分在内对于凝胶层析，分配系数实质上表示某个组分在内对于凝胶层析，分配系数实质上表示某个组分在内对于凝胶层析，分配系数实质上表示某个组分在内水体积和在外水体积中的浓度分配关系。在凝胶层水体积和在外水体积中的浓度分配关系。在凝胶层水体积和在外水体积中的浓度分配关系。在凝胶层水体积和在外水体积中的浓度分配关系。在凝胶层析中，分配

81、系数通常表示为：析中，分配系数通常表示为：析中，分配系数通常表示为：析中，分配系数通常表示为：KKavav=(V=(Ve e-V-V0 0)/(V)/(Vt t-V-V0 0) )完全排阻的大分子，完全排阻的大分子，完全排阻的大分子，完全排阻的大分子，V Ve eV Vo o，故，故，故，故KKavav0 0。完全渗透的大分子，完全渗透的大分子，完全渗透的大分子，完全渗透的大分子，V Ve eV Vt t，故，故，故，故KKavav1 1。一般一般一般一般KKavav值在值在值在值在0 01 1之间。如果之间。如果之间。如果之间。如果KKavav值大于值大于值大于值大于1 1，则表示这，则表示

82、这，则表示这，则表示这种物质与凝胶有吸附作用。种物质与凝胶有吸附作用。种物质与凝胶有吸附作用。种物质与凝胶有吸附作用。对于某一型号的凝胶，在一定的分子量范围内，各对于某一型号的凝胶，在一定的分子量范围内，各对于某一型号的凝胶，在一定的分子量范围内，各对于某一型号的凝胶，在一定的分子量范围内，各个组分的个组分的个组分的个组分的KKavav与其分子量的对数成线性关系：与其分子量的对数成线性关系：与其分子量的对数成线性关系：与其分子量的对数成线性关系： KKavavb b lglg MW MWc c 其中其中其中其中b b、c c为常数，为常数，为常数，为常数，MWMW表示物质的分子量。表示物质的分

83、子量。表示物质的分子量。表示物质的分子量。由于由于由于由于V Ve e和和和和KKavav也成线性关系，所以同样有：也成线性关系，所以同样有：也成线性关系，所以同样有：也成线性关系，所以同样有： V Ve eb b lglg MW MWc c 其中其中其中其中b b 、c c 为常数。为常数。为常数。为常数。用已知分子量的标准物质进行洗脱，分别测定用已知分子量的标准物质进行洗脱，分别测定用已知分子量的标准物质进行洗脱，分别测定用已知分子量的标准物质进行洗脱，分别测定V Ve e或或或或KKavav，并根据上述的线性关系绘出标准曲线，然后，并根据上述的线性关系绘出标准曲线，然后，并根据上述的线性

84、关系绘出标准曲线，然后，并根据上述的线性关系绘出标准曲线，然后在相同的条件下测定未知物的在相同的条件下测定未知物的在相同的条件下测定未知物的在相同的条件下测定未知物的V Ve e或或或或KKavav，通过标准，通过标准，通过标准，通过标准曲线即可求出其分子量。曲线即可求出其分子量。曲线即可求出其分子量。曲线即可求出其分子量。5.3.3 5.3.3 排阻极限排阻极限排阻极限排阻极限排阻极限是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小排阻极限是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小排阻极限是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小排阻极限是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量。所有大于排阻极限的分子都不能分子的分

85、子量。所有大于排阻极限的分子都不能分子的分子量。所有大于排阻极限的分子都不能分子的分子量。所有大于排阻极限的分子都不能进入凝胶颗粒内部，直接从凝胶颗粒外流出，所进入凝胶颗粒内部，直接从凝胶颗粒外流出，所进入凝胶颗粒内部，直接从凝胶颗粒外流出，所进入凝胶颗粒内部，直接从凝胶颗粒外流出，所以它们同时被最先洗脱出来。以它们同时被最先洗脱出来。以它们同时被最先洗脱出来。以它们同时被最先洗脱出来。排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分子量，排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分子量，排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分子量，排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分子量，大于这种凝胶的排阻极限的分子用这种

86、凝胶不能大于这种凝胶的排阻极限的分子用这种凝胶不能大于这种凝胶的排阻极限的分子用这种凝胶不能大于这种凝胶的排阻极限的分子用这种凝胶不能得到分离。得到分离。得到分离。得到分离。例如例如例如例如SephadexSephadex G-50 G-50的排阻极限为的排阻极限为的排阻极限为的排阻极限为30,00030,000，它表示，它表示，它表示，它表示分子量大于分子量大于分子量大于分子量大于30,00030,000的分子都将直接从凝胶颗粒之的分子都将直接从凝胶颗粒之的分子都将直接从凝胶颗粒之的分子都将直接从凝胶颗粒之外被洗脱出来。外被洗脱出来。外被洗脱出来。外被洗脱出来。 5.3.4 分级分离范围分级

87、分离范围表示一种凝胶适用的分离范围，对于分子量表示一种凝胶适用的分离范围，对于分子量在这个范围内的分子，用这种凝胶可以得在这个范围内的分子，用这种凝胶可以得到较好的线性分离。到较好的线性分离。例如例如Sephadex G-75对球形蛋白的分级分离对球形蛋白的分级分离范围为范围为3,00070,000，它表示分子量在这，它表示分子量在这个范围内的球形蛋白可以通过个范围内的球形蛋白可以通过Sephadex G-75得到较好的分离。得到较好的分离。对于同一型号的凝胶，球形蛋白与线形蛋白对于同一型号的凝胶，球形蛋白与线形蛋白的分级分离范围是不同的。的分级分离范围是不同的。 5.3.5 吸水率和床体积吸

88、水率和床体积吸水率是指吸水率是指1g干的凝胶吸收水的体积或者干的凝胶吸收水的体积或者重量，但它不包括颗粒间吸附的水份。所重量，但它不包括颗粒间吸附的水份。所以它不能表示凝胶装柱后的体积。以它不能表示凝胶装柱后的体积。床体积是指床体积是指1g干的凝胶吸水后的最终体积。干的凝胶吸水后的最终体积。 5.3.6 凝胶颗粒大小凝胶颗粒大小层析用的凝胶一般都成球形，颗粒的大小层析用的凝胶一般都成球形，颗粒的大小通常以目数（通常以目数（mesh）或者颗粒直径）或者颗粒直径（mm）来表示。）来表示。柱子的分辨率和流速都与凝胶颗粒大小有柱子的分辨率和流速都与凝胶颗粒大小有关。关。颗粒大，流速快，但分离效果差；颗

89、粒小，颗粒大，流速快，但分离效果差；颗粒小，分离效果较好，但流速慢。一般比较常用分离效果较好，但流速慢。一般比较常用的是的是100200目。目。 5.4 凝胶的种类和性质凝胶的种类和性质凝胶的种类很多，常用的凝胶主要有：凝胶的种类很多，常用的凝胶主要有：葡聚糖凝胶（葡聚糖凝胶（dextran）聚丙烯酰胺凝胶（聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide）琼脂糖凝胶（琼脂糖凝胶（agarose）以及聚丙烯酰胺和琼脂糖之间的交联物。以及聚丙烯酰胺和琼脂糖之间的交联物。另外还有多孔玻璃珠、多孔硅胶、聚苯乙烯另外还有多孔玻璃珠、多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等等。凝胶等等。5.4.1 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶葡聚

90、糖凝胶是指由天然高分子（葡聚糖）与葡聚糖凝胶是指由天然高分子（葡聚糖）与其它交联剂交联而成的凝胶。葡聚糖凝胶主其它交联剂交联而成的凝胶。葡聚糖凝胶主要由要由Pharmacia Biotech生产。常见的有两大生产。常见的有两大类，商品名分别为类，商品名分别为Sephadex和和Sephacryl。葡聚糖凝胶中最常见的是葡聚糖凝胶中最常见的是Sephadex系列，它系列，它是葡聚糖与是葡聚糖与3-氯氯-1,2环氧丙烷（交联剂）相互环氧丙烷（交联剂）相互交联而成，交联度由环氧氯丙烷的百分比控交联而成，交联度由环氧氯丙烷的百分比控制。制。Sephadex 的主要型号是的主要型号是G-10 G-200

91、，后面，后面的数字是凝胶的吸水率（单位是的数字是凝胶的吸水率（单位是ml / g干胶）干胶）乘以乘以10。如。如Sephadex G-50，表示吸水率是，表示吸水率是5ml/g干胶。干胶。Sephadex的亲水性很好，在水中极易膨胀，的亲水性很好，在水中极易膨胀，不同型号的不同型号的Sephadex的吸水率不同，它们的的吸水率不同，它们的孔穴大小和分离范围也不同。数字越大的，孔穴大小和分离范围也不同。数字越大的，排阻极限越大，分离范围也越大。排阻极限越大，分离范围也越大。Sephadex中排阻极限最大的中排阻极限最大的G-200为为6105。Sephadex在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱在水溶液

92、、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液以及有机溶液中都是比较稳定的，酸溶液以及有机溶液中都是比较稳定的，可以多次重复使用。可以多次重复使用。Sephadex稳定工作的稳定工作的pH一般为一般为210。强酸。强酸溶液和氧化剂会使交联的糖苷键水解断裂，溶液和氧化剂会使交联的糖苷键水解断裂，所以要避免所以要避免Sephadex与强酸和氧化剂接触。与强酸和氧化剂接触。Sephadex在高温下稳定，可以煮沸消毒，在高温下稳定，可以煮沸消毒，在在100 下下40 min对凝胶的结构和性能都没对凝胶的结构和性能都没有明显的影响。有明显的影响。SephadexSephadex含有羟基基团，呈弱酸性，可与分离物中含有羟基基

93、团，呈弱酸性，可与分离物中含有羟基基团，呈弱酸性，可与分离物中含有羟基基团，呈弱酸性，可与分离物中的一些带电基团（尤其是碱性蛋白）发生吸附作用。的一些带电基团（尤其是碱性蛋白）发生吸附作用。的一些带电基团（尤其是碱性蛋白）发生吸附作用。的一些带电基团（尤其是碱性蛋白）发生吸附作用。但一般在离子强度大于但一般在离子强度大于但一般在离子强度大于但一般在离子强度大于0.050.05的条件下，几乎没有吸附的条件下，几乎没有吸附的条件下，几乎没有吸附的条件下，几乎没有吸附作用。作用。作用。作用。SephadexSephadex进行凝胶层析实验时常使用一定浓度的盐进行凝胶层析实验时常使用一定浓度的盐进行凝

94、胶层析实验时常使用一定浓度的盐进行凝胶层析实验时常使用一定浓度的盐溶液作为洗脱液，避免其与蛋白发生吸附。溶液作为洗脱液，避免其与蛋白发生吸附。溶液作为洗脱液，避免其与蛋白发生吸附。溶液作为洗脱液，避免其与蛋白发生吸附。盐浓度不宜过高，否则会引起凝胶柱床体积发生较盐浓度不宜过高，否则会引起凝胶柱床体积发生较盐浓度不宜过高，否则会引起凝胶柱床体积发生较盐浓度不宜过高，否则会引起凝胶柱床体积发生较大的变化。大的变化。大的变化。大的变化。SephadexSephadex G-25 G-25和和和和G-50G-50中分别加入羟丙基基团反应，中分别加入羟丙基基团反应，中分别加入羟丙基基团反应，中分别加入羟

95、丙基基团反应，形成形成形成形成LHLH型烷基化葡聚糖凝胶，主要型号为型烷基化葡聚糖凝胶，主要型号为型烷基化葡聚糖凝胶，主要型号为型烷基化葡聚糖凝胶，主要型号为SephadexSephadex LH-20LH-20和和和和LH-60LH-60，适用于以有机溶剂为流动相，分离，适用于以有机溶剂为流动相，分离，适用于以有机溶剂为流动相，分离，适用于以有机溶剂为流动相，分离脂溶性物质，例如胆固醇、脂肪酸激素等。脂溶性物质，例如胆固醇、脂肪酸激素等。脂溶性物质，例如胆固醇、脂肪酸激素等。脂溶性物质，例如胆固醇、脂肪酸激素等。Sephadex有各种颗粒大小（一般有粗、中、有各种颗粒大小（一般有粗、中、细、

96、超细）可以选择，一般粗颗粒流速快，细、超细）可以选择，一般粗颗粒流速快，但分辨率较差；细颗粒流速慢，但分辨率高。但分辨率较差；细颗粒流速慢，但分辨率高。要根据分离要求来选择颗粒大小。要根据分离要求来选择颗粒大小。Sephadex的机械稳定性相对较差，它不耐压，的机械稳定性相对较差，它不耐压，分辨率高的细颗粒要求流速较慢，所以不能分辨率高的细颗粒要求流速较慢，所以不能实现快速而高效的分离。实现快速而高效的分离。SephacrylSephacryl是葡聚糖与甲叉双丙烯酰胺（是葡聚糖与甲叉双丙烯酰胺（是葡聚糖与甲叉双丙烯酰胺（是葡聚糖与甲叉双丙烯酰胺（N, N-N, N-methylenebisac

97、rylamidemethylenebisacrylamide）交联而成。是一种比较）交联而成。是一种比较）交联而成。是一种比较）交联而成。是一种比较新型的葡聚糖凝胶。新型的葡聚糖凝胶。新型的葡聚糖凝胶。新型的葡聚糖凝胶。SephacrylSephacryl的优点就是它的分离范围很大，排阻极的优点就是它的分离范围很大，排阻极的优点就是它的分离范围很大，排阻极的优点就是它的分离范围很大，排阻极限甚至可以达到限甚至可以达到限甚至可以达到限甚至可以达到10108 8，远远大于，远远大于，远远大于，远远大于SephadexSephadex的范围。的范围。的范围。的范围。不仅可以用于分离一般蛋白，也可以用

98、于分离蛋不仅可以用于分离一般蛋白，也可以用于分离蛋不仅可以用于分离一般蛋白，也可以用于分离蛋不仅可以用于分离一般蛋白，也可以用于分离蛋白多糖、质粒、甚至较大的病毒颗粒。白多糖、质粒、甚至较大的病毒颗粒。白多糖、质粒、甚至较大的病毒颗粒。白多糖、质粒、甚至较大的病毒颗粒。SephacrylSephacryl与与与与SephadexSephadex相比另一个优点就是它的化相比另一个优点就是它的化相比另一个优点就是它的化相比另一个优点就是它的化学和机械稳定性更高：学和机械稳定性更高：学和机械稳定性更高：学和机械稳定性更高：SephacrylSephacryl在各种溶剂中很在各种溶剂中很在各种溶剂中很

99、在各种溶剂中很少发生溶解或降解，可以用各种去污剂、胍、脲少发生溶解或降解，可以用各种去污剂、胍、脲少发生溶解或降解，可以用各种去污剂、胍、脲少发生溶解或降解，可以用各种去污剂、胍、脲等作为洗脱液，耐高温。等作为洗脱液，耐高温。等作为洗脱液，耐高温。等作为洗脱液，耐高温。SephacrylSephacryl稳定工作的稳定工作的稳定工作的稳定工作的pHpH一般为一般为一般为一般为311311。SephacrylSephacryl的机械性能较好，可以以较高的流速洗的机械性能较好，可以以较高的流速洗的机械性能较好，可以以较高的流速洗的机械性能较好，可以以较高的流速洗脱，比较耐压，分辨率也较高，所以脱，

100、比较耐压，分辨率也较高，所以脱，比较耐压，分辨率也较高，所以脱，比较耐压，分辨率也较高，所以SephacrylSephacryl相相相相比比比比SephadexSephadex可以实现相对比较快速而且较高分辨可以实现相对比较快速而且较高分辨可以实现相对比较快速而且较高分辨可以实现相对比较快速而且较高分辨率的分离。率的分离。率的分离。率的分离。 5.4.2 5.4.2 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶是丙烯酰胺（聚丙烯酰胺凝胶是丙烯酰胺（聚丙烯酰胺凝胶是丙烯酰胺（聚丙烯酰胺凝胶是丙烯酰胺（acrylamideacrylamide）与甲叉）与甲叉）与甲叉）与甲

101、叉双丙烯酰胺交联而成。改变丙烯酰胺的浓度，就可双丙烯酰胺交联而成。改变丙烯酰胺的浓度，就可双丙烯酰胺交联而成。改变丙烯酰胺的浓度，就可双丙烯酰胺交联而成。改变丙烯酰胺的浓度，就可以得到不同交联度的产物。以得到不同交联度的产物。以得到不同交联度的产物。以得到不同交联度的产物。主要由主要由主要由主要由Bio-Rad LaboratoriesBio-Rad Laboratories生产，商品名为生产，商品名为生产，商品名为生产，商品名为Bio-Bio-Gel PGel P，主要型号有，主要型号有，主要型号有，主要型号有Bio-Gel P-2 Bio-Gel P-300Bio-Gel P-2 Bio-

102、Gel P-300等等等等1010种，后面的数字基本代表它们的排阻极限的种，后面的数字基本代表它们的排阻极限的种，后面的数字基本代表它们的排阻极限的种，后面的数字基本代表它们的排阻极限的1010-3-3，所，所，所，所以数字越大，可分离的分子量也就越大。以数字越大，可分离的分子量也就越大。以数字越大，可分离的分子量也就越大。以数字越大，可分离的分子量也就越大。聚丙烯酰胺凝胶的分离范围、吸水率等性能基本近聚丙烯酰胺凝胶的分离范围、吸水率等性能基本近聚丙烯酰胺凝胶的分离范围、吸水率等性能基本近聚丙烯酰胺凝胶的分离范围、吸水率等性能基本近似于似于似于似于SephadexSephadex。排阻极限最大

103、的。排阻极限最大的。排阻极限最大的。排阻极限最大的Bio-Gel P-300Bio-Gel P-300为为为为4 4 10105 5。聚丙烯酰胺凝胶在水溶液、一般的有机溶液、盐溶聚丙烯酰胺凝胶在水溶液、一般的有机溶液、盐溶聚丙烯酰胺凝胶在水溶液、一般的有机溶液、盐溶聚丙烯酰胺凝胶在水溶液、一般的有机溶液、盐溶液中都比较稳定。液中都比较稳定。液中都比较稳定。液中都比较稳定。聚丙烯酰胺凝胶在酸中的稳定性较好，在聚丙烯酰胺凝胶在酸中的稳定性较好，在聚丙烯酰胺凝胶在酸中的稳定性较好，在聚丙烯酰胺凝胶在酸中的稳定性较好，在pHpH为为为为110110之间比较稳定。之间比较稳定。之间比较稳定。之间比较稳定

104、。在较强的碱性条件下或较高的温度下，聚丙烯酰胺在较强的碱性条件下或较高的温度下，聚丙烯酰胺在较强的碱性条件下或较高的温度下，聚丙烯酰胺在较强的碱性条件下或较高的温度下，聚丙烯酰胺凝胶易发生分解。凝胶易发生分解。凝胶易发生分解。凝胶易发生分解。聚丙烯酰胺凝胶非常亲水，基本不带电荷，吸附效聚丙烯酰胺凝胶非常亲水，基本不带电荷，吸附效聚丙烯酰胺凝胶非常亲水，基本不带电荷，吸附效聚丙烯酰胺凝胶非常亲水，基本不带电荷，吸附效应较小。对芳香族、酸性、碱性化合物可能略有吸应较小。对芳香族、酸性、碱性化合物可能略有吸应较小。对芳香族、酸性、碱性化合物可能略有吸应较小。对芳香族、酸性、碱性化合物可能略有吸附作用

105、，使用离子强度略高的洗脱液就可以避免。附作用，使用离子强度略高的洗脱液就可以避免。附作用，使用离子强度略高的洗脱液就可以避免。附作用，使用离子强度略高的洗脱液就可以避免。 聚丙烯酰胺凝胶不会象葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶那聚丙烯酰胺凝胶不会象葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶那聚丙烯酰胺凝胶不会象葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶那聚丙烯酰胺凝胶不会象葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶那样可能生长微生物。样可能生长微生物。样可能生长微生物。样可能生长微生物。5.4.3 5.4.3 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖是从琼脂中分离出来的天然线性多糖，它是琼脂糖是从琼脂中分离出来的天然线性多糖，它是琼脂糖是从琼脂中分离出来的天

106、然线性多糖，它是琼脂糖是从琼脂中分离出来的天然线性多糖，它是琼脂去掉其中带电荷的琼脂胶得到的。琼脂糖是由琼脂去掉其中带电荷的琼脂胶得到的。琼脂糖是由琼脂去掉其中带电荷的琼脂胶得到的。琼脂糖是由琼脂去掉其中带电荷的琼脂胶得到的。琼脂糖是由D D半乳糖（半乳糖（半乳糖（半乳糖（D-D-galactosegalactose）和）和）和）和3,63,6脱水半乳糖脱水半乳糖脱水半乳糖脱水半乳糖（anhydrogalactoseanhydrogalactose）交替构成的多糖链。）交替构成的多糖链。）交替构成的多糖链。）交替构成的多糖链。它在它在它在它在100100时呈液态，当温度降至时呈液态，当温度降至

107、时呈液态，当温度降至时呈液态，当温度降至4545以下时，多以下时，多以下时，多以下时，多糖链以氢键方式相互连接形成双链单环的琼脂糖，糖链以氢键方式相互连接形成双链单环的琼脂糖，糖链以氢键方式相互连接形成双链单环的琼脂糖，糖链以氢键方式相互连接形成双链单环的琼脂糖，经凝聚即成为束状的琼脂糖凝胶。经凝聚即成为束状的琼脂糖凝胶。经凝聚即成为束状的琼脂糖凝胶。经凝聚即成为束状的琼脂糖凝胶。琼脂糖凝胶的商品名因生产厂家不同而异，常见的琼脂糖凝胶的商品名因生产厂家不同而异，常见的琼脂糖凝胶的商品名因生产厂家不同而异，常见的琼脂糖凝胶的商品名因生产厂家不同而异，常见的主要有主要有主要有主要有Pharmaci

108、a BiotechPharmacia Biotech生产的生产的生产的生产的SepharoseSepharose（2B 2B 4B4B）和）和）和）和Bio-Rad LaboratoriesBio-Rad Laboratories生产的生产的生产的生产的Bio-gel ABio-gel A等。等。等。等。琼脂糖凝胶对样品的吸附作用很小。琼脂糖凝胶对样品的吸附作用很小。琼脂糖凝胶对样品的吸附作用很小。琼脂糖凝胶对样品的吸附作用很小。琼脂糖凝胶在琼脂糖凝胶在琼脂糖凝胶在琼脂糖凝胶在pHpH为为为为4 49 9之间是稳定的，它在室温之间是稳定的，它在室温之间是稳定的，它在室温之间是稳定的，它在室温下

109、很稳定，稳定性要超过一般的葡聚糖凝胶和聚下很稳定，稳定性要超过一般的葡聚糖凝胶和聚下很稳定，稳定性要超过一般的葡聚糖凝胶和聚下很稳定，稳定性要超过一般的葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。丙烯酰胺凝胶。丙烯酰胺凝胶。丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶的机械强度和孔穴的稳定性都很好，琼脂糖凝胶的机械强度和孔穴的稳定性都很好，琼脂糖凝胶的机械强度和孔穴的稳定性都很好，琼脂糖凝胶的机械强度和孔穴的稳定性都很好，一般好于前两种凝胶，在高盐浓度下，柱床体积一般好于前两种凝胶，在高盐浓度下，柱床体积一般好于前两种凝胶，在高盐浓度下，柱床体积一般好于前两种凝胶，在高盐浓度下，柱床体积一般不会发生明显变化，使用琼脂糖凝胶时洗脱

110、一般不会发生明显变化，使用琼脂糖凝胶时洗脱一般不会发生明显变化，使用琼脂糖凝胶时洗脱一般不会发生明显变化，使用琼脂糖凝胶时洗脱速度可以比较快。速度可以比较快。速度可以比较快。速度可以比较快。琼脂糖凝胶的排阻极限很大，分离范围很广，适琼脂糖凝胶的排阻极限很大，分离范围很广，适琼脂糖凝胶的排阻极限很大，分离范围很广，适琼脂糖凝胶的排阻极限很大，分离范围很广，适合于分离大分子物质，但分辨率较低。合于分离大分子物质，但分辨率较低。合于分离大分子物质，但分辨率较低。合于分离大分子物质，但分辨率较低。琼脂糖凝胶不耐高温，使用温度以琼脂糖凝胶不耐高温，使用温度以琼脂糖凝胶不耐高温，使用温度以琼脂糖凝胶不耐高

111、温，使用温度以0 03030为宜。为宜。为宜。为宜。 Sepharose与与2,3二溴丙醇反应，形成二溴丙醇反应，形成Sepharose CL型凝胶（型凝胶（CL-2B CL-4B）分离特性基本没有改变，但热稳定性和化学分离特性基本没有改变，但热稳定性和化学稳定性都有所提高，可以在更广泛的稳定性都有所提高，可以在更广泛的pH范范围内应用，稳定工作的围内应用，稳定工作的pH范围为范围为313。Sepharose CL型凝胶还特别适合于含有有型凝胶还特别适合于含有有机溶剂的分离。机溶剂的分离。 5.4.4 聚丙烯酰胺和琼脂糖交联凝胶聚丙烯酰胺和琼脂糖交联凝胶这类凝胶是由交联的聚丙烯酰胺和嵌入凝胶这

112、类凝胶是由交联的聚丙烯酰胺和嵌入凝胶内部的琼脂糖组成。它们主要由内部的琼脂糖组成。它们主要由LKB提供，提供，商品名为商品名为Ultragel。由于含有聚丙烯酰胺，所以有较高分辨率；由于含有聚丙烯酰胺，所以有较高分辨率；而它又含有琼脂糖，这使得它又有较高的机而它又含有琼脂糖，这使得它又有较高的机械稳定性，可以使用较高的洗脱速度。械稳定性，可以使用较高的洗脱速度。调整聚丙烯酰胺和琼脂糖的浓度可以使调整聚丙烯酰胺和琼脂糖的浓度可以使Ultragel有不同的分离范围。有不同的分离范围。5.4.5 5.4.5 多孔硅胶、多孔玻璃珠多孔硅胶、多孔玻璃珠多孔硅胶、多孔玻璃珠多孔硅胶、多孔玻璃珠这类凝胶是由

113、硅胶或玻璃制成具有一定直径的网孔这类凝胶是由硅胶或玻璃制成具有一定直径的网孔这类凝胶是由硅胶或玻璃制成具有一定直径的网孔这类凝胶是由硅胶或玻璃制成具有一定直径的网孔状结构的球形颗粒。状结构的球形颗粒。状结构的球形颗粒。状结构的球形颗粒。属于硬质无机凝胶，最大的特点是机械强度很高、属于硬质无机凝胶，最大的特点是机械强度很高、属于硬质无机凝胶，最大的特点是机械强度很高、属于硬质无机凝胶，最大的特点是机械强度很高、化学稳定性好，使用方便而且寿命长。化学稳定性好，使用方便而且寿命长。化学稳定性好，使用方便而且寿命长。化学稳定性好，使用方便而且寿命长。无机胶一般柱效较低，但用微粒的多孔硅胶制成的无机胶一

114、般柱效较低，但用微粒的多孔硅胶制成的无机胶一般柱效较低，但用微粒的多孔硅胶制成的无机胶一般柱效较低，但用微粒的多孔硅胶制成的HPLCHPLC柱也可以有很高的柱效，可以达到柱也可以有很高的柱效，可以达到柱也可以有很高的柱效，可以达到柱也可以有很高的柱效，可以达到4 4 10104 4塔塔塔塔板板板板/ /米。米。米。米。多孔玻璃珠易破碎，不能填装紧密，柱效相对较低。多孔玻璃珠易破碎，不能填装紧密，柱效相对较低。多孔玻璃珠易破碎，不能填装紧密，柱效相对较低。多孔玻璃珠易破碎，不能填装紧密，柱效相对较低。多孔硅胶和多孔玻璃珠的分离范围都比较宽多孔硅胶和多孔玻璃珠的分离范围都比较宽多孔硅胶和多孔玻璃珠

115、的分离范围都比较宽多孔硅胶和多孔玻璃珠的分离范围都比较宽多孔硅胶一般为多孔硅胶一般为多孔硅胶一般为多孔硅胶一般为10102 255 10106 6多孔玻璃珠一般为多孔玻璃珠一般为多孔玻璃珠一般为多孔玻璃珠一般为3 3 10103 399 10106 6。最大缺点是吸附效应较强（尤其是多孔硅胶），最大缺点是吸附效应较强（尤其是多孔硅胶），最大缺点是吸附效应较强（尤其是多孔硅胶），最大缺点是吸附效应较强（尤其是多孔硅胶），可能会吸附比较多的蛋白，但可以通过表面处理可能会吸附比较多的蛋白，但可以通过表面处理可能会吸附比较多的蛋白，但可以通过表面处理可能会吸附比较多的蛋白，但可以通过表面处理和选择洗脱

116、液来降低吸附。和选择洗脱液来降低吸附。和选择洗脱液来降低吸附。和选择洗脱液来降低吸附。另一个缺点是它们也不能用于强碱性溶液，一般另一个缺点是它们也不能用于强碱性溶液，一般另一个缺点是它们也不能用于强碱性溶液，一般另一个缺点是它们也不能用于强碱性溶液，一般使用时使用时使用时使用时pHpH应小于应小于应小于应小于8.58.5。另外值得一提的是各类凝胶技术近年来发展另外值得一提的是各类凝胶技术近年来发展得很快，目前已研制出很多性能优越的新得很快，目前已研制出很多性能优越的新型凝胶。型凝胶。例如例如Pharmacia Biotech的的Superdex和和SuperroseSuperdex的分辨率非常

117、高，化学物理稳定的分辨率非常高，化学物理稳定性也很好，可以用于性也很好，可以用于FPLC、HPLC分析。分析。Superose的分离范围很广，分辨率较高，可的分离范围很广，分辨率较高，可以一次性的分离分子量差异较大的混合物。以一次性的分离分子量差异较大的混合物。同时它的机械稳定性也很好。同时它的机械稳定性也很好。5.5 凝胶的选择、处理和保存凝胶的选择、处理和保存5.5.1 凝胶的选择凝胶的选择分离范围分离范围凝胶颗粒的大小凝胶颗粒的大小实验条件实验条件一方面，根据分离范围来选择合适型号的凝胶一方面，根据分离范围来选择合适型号的凝胶一方面，根据分离范围来选择合适型号的凝胶一方面，根据分离范围来

118、选择合适型号的凝胶一般的凝胶层析实验可以分为两类：分组分离一般的凝胶层析实验可以分为两类：分组分离一般的凝胶层析实验可以分为两类：分组分离一般的凝胶层析实验可以分为两类：分组分离（group separationsgroup separations）和分级分离）和分级分离）和分级分离）和分级分离（fractionationsfractionations）分组分离是指将样品混合物按分子量大小分成两分组分离是指将样品混合物按分子量大小分成两分组分离是指将样品混合物按分子量大小分成两分组分离是指将样品混合物按分子量大小分成两组，一组分子量较大，另一组分子量较小。例如组，一组分子量较大，另一组分子量较

119、小。例如组，一组分子量较大，另一组分子量较小。例如组，一组分子量较大，另一组分子量较小。例如蛋白样品的脱盐或蛋白、核酸溶液去除小分子杂蛋白样品的脱盐或蛋白、核酸溶液去除小分子杂蛋白样品的脱盐或蛋白、核酸溶液去除小分子杂蛋白样品的脱盐或蛋白、核酸溶液去除小分子杂质以及一些注射剂去除大分子热源物质等等。质以及一些注射剂去除大分子热源物质等等。质以及一些注射剂去除大分子热源物质等等。质以及一些注射剂去除大分子热源物质等等。分级分离是指将一组分子量比较接近的组分分开。分级分离是指将一组分子量比较接近的组分分开。分级分离是指将一组分子量比较接近的组分分开。分级分离是指将一组分子量比较接近的组分分开。选择

120、凝胶另外一个方面就是凝胶颗粒的大小选择凝胶另外一个方面就是凝胶颗粒的大小选择凝胶另外一个方面就是凝胶颗粒的大小选择凝胶另外一个方面就是凝胶颗粒的大小颗粒小，分辨率高，但相对流速慢，实验时间长，颗粒小，分辨率高，但相对流速慢，实验时间长，颗粒小，分辨率高，但相对流速慢，实验时间长，颗粒小，分辨率高，但相对流速慢，实验时间长，有时会造成扩散现象严重。有时会造成扩散现象严重。有时会造成扩散现象严重。有时会造成扩散现象严重。颗粒大，流速快，分辨率较低但条件得当也可以颗粒大，流速快，分辨率较低但条件得当也可以颗粒大，流速快，分辨率较低但条件得当也可以颗粒大，流速快，分辨率较低但条件得当也可以得到满意的结

121、果。选择时要依据分离的具体情况得到满意的结果。选择时要依据分离的具体情况得到满意的结果。选择时要依据分离的具体情况得到满意的结果。选择时要依据分离的具体情况而定，而定，而定，而定，例如样品中各个组分差别较大，则可以选用大颗例如样品中各个组分差别较大，则可以选用大颗例如样品中各个组分差别较大，则可以选用大颗例如样品中各个组分差别较大，则可以选用大颗粒的凝胶，这样可以很快的达到分离的目的；如粒的凝胶，这样可以很快的达到分离的目的；如粒的凝胶，这样可以很快的达到分离的目的；如粒的凝胶，这样可以很快的达到分离的目的；如果有个别组分差别较小，则要考虑使用小颗粒凝果有个别组分差别较小，则要考虑使用小颗粒凝

122、果有个别组分差别较小，则要考虑使用小颗粒凝果有个别组分差别较小，则要考虑使用小颗粒凝胶以提高分辨率。胶以提高分辨率。胶以提高分辨率。胶以提高分辨率。由于凝胶一般都比较稳定，所以它在一般的实验由于凝胶一般都比较稳定，所以它在一般的实验由于凝胶一般都比较稳定，所以它在一般的实验由于凝胶一般都比较稳定，所以它在一般的实验条件下都可以正常的工作。条件下都可以正常的工作。条件下都可以正常的工作。条件下都可以正常的工作。如果实验条件比较特殊，如在较强的酸碱中进行如果实验条件比较特殊，如在较强的酸碱中进行如果实验条件比较特殊，如在较强的酸碱中进行如果实验条件比较特殊，如在较强的酸碱中进行或含有有机溶剂等等，

123、则要仔细查看凝胶的工作或含有有机溶剂等等，则要仔细查看凝胶的工作或含有有机溶剂等等，则要仔细查看凝胶的工作或含有有机溶剂等等，则要仔细查看凝胶的工作参数，选择合适的类型的凝胶。参数，选择合适的类型的凝胶。参数，选择合适的类型的凝胶。参数，选择合适的类型的凝胶。 5.5.2 5.5.2 凝胶的处理凝胶的处理凝胶的处理凝胶的处理1 1、估算出凝胶的用量、估算出凝胶的用量、估算出凝胶的用量、估算出凝胶的用量由于市售的葡聚糖凝胶和丙烯酰胺凝胶通常是无由于市售的葡聚糖凝胶和丙烯酰胺凝胶通常是无由于市售的葡聚糖凝胶和丙烯酰胺凝胶通常是无由于市售的葡聚糖凝胶和丙烯酰胺凝胶通常是无水的干胶，所以要计算干胶用量

124、：水的干胶，所以要计算干胶用量：水的干胶，所以要计算干胶用量：水的干胶，所以要计算干胶用量：由于凝胶处理过程以及实验过程可能有一定损由于凝胶处理过程以及实验过程可能有一定损由于凝胶处理过程以及实验过程可能有一定损由于凝胶处理过程以及实验过程可能有一定损失，所以一般凝胶用量在计算的基础上再增加失，所以一般凝胶用量在计算的基础上再增加失，所以一般凝胶用量在计算的基础上再增加失，所以一般凝胶用量在计算的基础上再增加10102020。2 2、干胶的膨化、干胶的膨化、干胶的膨化、干胶的膨化一般吸水率较小的凝胶（即型号较小、排阻极限一般吸水率较小的凝胶（即型号较小、排阻极限一般吸水率较小的凝胶（即型号较小

125、、排阻极限一般吸水率较小的凝胶（即型号较小、排阻极限较小的凝胶）膨化时间较短，在较小的凝胶）膨化时间较短，在较小的凝胶）膨化时间较短，在较小的凝胶）膨化时间较短，在2020条件下需条件下需条件下需条件下需3434小时小时小时小时吸水率较大的凝胶（即型号较大、排阻极限较大吸水率较大的凝胶（即型号较大、排阻极限较大吸水率较大的凝胶（即型号较大、排阻极限较大吸水率较大的凝胶（即型号较大、排阻极限较大的凝胶）膨化时间则较长，的凝胶）膨化时间则较长，的凝胶）膨化时间则较长，的凝胶）膨化时间则较长，2020条件下需十几个条件下需十几个条件下需十几个条件下需十几个到几十个小时。到几十个小时。到几十个小时。到

126、几十个小时。如如如如SephadexSephadex G-100 G-100以上的干胶膨化时间都要在以上的干胶膨化时间都要在以上的干胶膨化时间都要在以上的干胶膨化时间都要在7272小时以上。如果加热煮沸，则膨化时间会大大缩小时以上。如果加热煮沸，则膨化时间会大大缩小时以上。如果加热煮沸，则膨化时间会大大缩小时以上。如果加热煮沸，则膨化时间会大大缩短，一般在短，一般在短，一般在短，一般在1515小时即可完成，而且煮沸也可以去小时即可完成，而且煮沸也可以去小时即可完成，而且煮沸也可以去小时即可完成，而且煮沸也可以去除凝胶颗粒中的气泡。除凝胶颗粒中的气泡。除凝胶颗粒中的气泡。除凝胶颗粒中的气泡。琼脂

127、糖凝胶和有些市售凝胶是水悬浮的状态，所琼脂糖凝胶和有些市售凝胶是水悬浮的状态，所琼脂糖凝胶和有些市售凝胶是水悬浮的状态，所琼脂糖凝胶和有些市售凝胶是水悬浮的状态，所以不需膨化处理。以不需膨化处理。以不需膨化处理。以不需膨化处理。外多孔玻璃珠和多孔硅胶也不需膨化处理。外多孔玻璃珠和多孔硅胶也不需膨化处理。外多孔玻璃珠和多孔硅胶也不需膨化处理。外多孔玻璃珠和多孔硅胶也不需膨化处理。3 3、纯化和排除气泡、纯化和排除气泡、纯化和排除气泡、纯化和排除气泡纯化可以反复漂洗，倾泻去除表面的杂质和不均纯化可以反复漂洗，倾泻去除表面的杂质和不均纯化可以反复漂洗，倾泻去除表面的杂质和不均纯化可以反复漂洗，倾泻去

128、除表面的杂质和不均一的细小凝胶颗粒。也可以一定的酸或碱浸泡一一的细小凝胶颗粒。也可以一定的酸或碱浸泡一一的细小凝胶颗粒。也可以一定的酸或碱浸泡一一的细小凝胶颗粒。也可以一定的酸或碱浸泡一段时间，再用水洗至中性。段时间，再用水洗至中性。段时间，再用水洗至中性。段时间，再用水洗至中性。排除凝胶中的气泡可以通过抽气或加热煮沸的方排除凝胶中的气泡可以通过抽气或加热煮沸的方排除凝胶中的气泡可以通过抽气或加热煮沸的方排除凝胶中的气泡可以通过抽气或加热煮沸的方法排除气泡。法排除气泡。法排除气泡。法排除气泡。5.5.3 5.5.3 凝胶的保存凝胶的保存凝胶的保存凝胶的保存凝胶的保存一般是反复洗涤去除蛋白等杂质

129、，然凝胶的保存一般是反复洗涤去除蛋白等杂质，然凝胶的保存一般是反复洗涤去除蛋白等杂质，然凝胶的保存一般是反复洗涤去除蛋白等杂质，然后加入适当的抗菌剂，通常加入后加入适当的抗菌剂，通常加入后加入适当的抗菌剂，通常加入后加入适当的抗菌剂，通常加入0.020.02的叠氮化钠，的叠氮化钠，的叠氮化钠，的叠氮化钠，4 4下保存。下保存。下保存。下保存。如果要较长时间的保存，则要将凝胶洗涤后脱水、如果要较长时间的保存，则要将凝胶洗涤后脱水、如果要较长时间的保存，则要将凝胶洗涤后脱水、如果要较长时间的保存，则要将凝胶洗涤后脱水、干燥，可以将凝胶过滤抽干后浸泡在干燥，可以将凝胶过滤抽干后浸泡在干燥，可以将凝胶

130、过滤抽干后浸泡在干燥，可以将凝胶过滤抽干后浸泡在5050的乙醇的乙醇的乙醇的乙醇中脱水，抽干后再逐步提高乙醇浓度反复浸泡脱中脱水，抽干后再逐步提高乙醇浓度反复浸泡脱中脱水，抽干后再逐步提高乙醇浓度反复浸泡脱中脱水，抽干后再逐步提高乙醇浓度反复浸泡脱水，至水，至水，至水，至9595乙醇脱水后将凝胶抽干。置于乙醇脱水后将凝胶抽干。置于乙醇脱水后将凝胶抽干。置于乙醇脱水后将凝胶抽干。置于6060烘烘烘烘箱中烘干，即可装瓶保存。箱中烘干，即可装瓶保存。箱中烘干，即可装瓶保存。箱中烘干，即可装瓶保存。膨化的凝胶不能直接高温烘干，否则可能会破坏膨化的凝胶不能直接高温烘干，否则可能会破坏膨化的凝胶不能直接高

131、温烘干，否则可能会破坏膨化的凝胶不能直接高温烘干，否则可能会破坏凝胶的结构。凝胶的结构。凝胶的结构。凝胶的结构。5.6 凝胶层析操作中应注意的问题凝胶层析操作中应注意的问题 5.6.1 层析柱的选择层析柱的选择5.6.2 凝胶柱的鉴定凝胶柱的鉴定5.6.3 洗脱液的选择洗脱液的选择5.6.4 加样量加样量5.6.5 洗脱速度洗脱速度5.6.1 5.6.1 层析柱的选择层析柱的选择层析柱的选择层析柱的选择层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要求来进行选择。

132、的要求来进行选择。的要求来进行选择。的要求来进行选择。一般来讲，主要是层析柱的长度对分辨率影响较大，一般来讲，主要是层析柱的长度对分辨率影响较大，一般来讲，主要是层析柱的长度对分辨率影响较大，一般来讲，主要是层析柱的长度对分辨率影响较大，长的层析柱分辨率要比短的高；但层析柱长度不能长的层析柱分辨率要比短的高；但层析柱长度不能长的层析柱分辨率要比短的高；但层析柱长度不能长的层析柱分辨率要比短的高；但层析柱长度不能过长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等实验上过长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等实验上过长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等实验上过长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等实验上的一些困难

133、。的一些困难。的一些困难。的一些困难。一般柱长度不超过一般柱长度不超过一般柱长度不超过一般柱长度不超过100cm100cm，为得到高分辨率，可以，为得到高分辨率，可以，为得到高分辨率，可以，为得到高分辨率，可以将柱子串联使用。将柱子串联使用。将柱子串联使用。将柱子串联使用。层析柱的直径和长度比一般在层析柱的直径和长度比一般在层析柱的直径和长度比一般在层析柱的直径和长度比一般在1:251:1001:251:100之间。之间。之间。之间。用于分组分离的凝胶柱，如脱盐柱由于对分辨率要用于分组分离的凝胶柱，如脱盐柱由于对分辨率要用于分组分离的凝胶柱，如脱盐柱由于对分辨率要用于分组分离的凝胶柱，如脱盐柱

134、由于对分辨率要求较低，所以一般比较短。求较低，所以一般比较短。求较低，所以一般比较短。求较低，所以一般比较短。5.6.2 5.6.2 凝胶柱的鉴定凝胶柱的鉴定凝胶柱的鉴定凝胶柱的鉴定柱填装后肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。柱填装后肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。柱填装后肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。柱填装后肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。通常可以采用一种有色的物质，如蓝色葡聚糖通常可以采用一种有色的物质，如蓝色葡聚糖通常可以采用一种有色的物质，如蓝色葡聚糖通常可以采用一种有色的物质，如蓝色葡聚糖- -20002000、血红蛋白等上柱，观察有色区带在柱中的、血红蛋白等上柱，观察有色区带在柱中的

135、、血红蛋白等上柱，观察有色区带在柱中的、血红蛋白等上柱，观察有色区带在柱中的洗脱行为以检测凝胶柱的均匀程度。洗脱行为以检测凝胶柱的均匀程度。洗脱行为以检测凝胶柱的均匀程度。洗脱行为以检测凝胶柱的均匀程度。如果色带狭窄、平整、均匀下降，则表明柱中的如果色带狭窄、平整、均匀下降，则表明柱中的如果色带狭窄、平整、均匀下降，则表明柱中的如果色带狭窄、平整、均匀下降，则表明柱中的凝胶填装情况较好，可以使用。凝胶填装情况较好，可以使用。凝胶填装情况较好，可以使用。凝胶填装情况较好，可以使用。如果色带弥散、歪曲，则需重新装柱。如果色带弥散、歪曲，则需重新装柱。如果色带弥散、歪曲，则需重新装柱。如果色带弥散、

136、歪曲，则需重新装柱。有时为了防止新凝胶柱对样品的吸附，可以用一有时为了防止新凝胶柱对样品的吸附，可以用一有时为了防止新凝胶柱对样品的吸附，可以用一有时为了防止新凝胶柱对样品的吸附，可以用一些物质预先过柱，以消除吸附。些物质预先过柱，以消除吸附。些物质预先过柱，以消除吸附。些物质预先过柱，以消除吸附。 5.6.3 洗脱液的选择洗脱液的选择由于凝胶层析的分离机理简单以及凝胶稳定由于凝胶层析的分离机理简单以及凝胶稳定工作的工作的pH范围较广，所以洗脱液的选择主范围较广，所以洗脱液的选择主要取决于待分离样品。要取决于待分离样品。一般来说只要能溶解被洗脱物质并不使其变一般来说只要能溶解被洗脱物质并不使其

137、变性的缓冲液都可以用于凝胶层析。性的缓冲液都可以用于凝胶层析。为了防止凝胶可能有吸附作用，一般洗脱液为了防止凝胶可能有吸附作用，一般洗脱液都含有一定浓度的盐。都含有一定浓度的盐。 5.6.4 加样量加样量加样要尽量快速、均匀。加样要尽量快速、均匀。加样过多，会造成洗脱峰的重叠，影响分离加样过多，会造成洗脱峰的重叠，影响分离效果。效果。加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低，加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低，实验效率低。实验效率低。分级分离时，加样体积约为凝胶柱床体积的分级分离时，加样体积约为凝胶柱床体积的15左右，而分组分离时加样体积约为左右，而分组分离时加样体积约为凝胶柱床体积的凝胶柱床体

138、积的1025。 5.6.5 5.6.5 洗脱速度洗脱速度洗脱速度洗脱速度一般洗脱速度要恒定而且合适。通常有两种方法：一般洗脱速度要恒定而且合适。通常有两种方法：一般洗脱速度要恒定而且合适。通常有两种方法：一般洗脱速度要恒定而且合适。通常有两种方法：恒流泵和恒压重力洗脱。恒流泵和恒压重力洗脱。恒流泵和恒压重力洗脱。恒流泵和恒压重力洗脱。洗脱速度取决于很多因素，包括柱长、凝胶种类、洗脱速度取决于很多因素，包括柱长、凝胶种类、洗脱速度取决于很多因素，包括柱长、凝胶种类、洗脱速度取决于很多因素，包括柱长、凝胶种类、颗粒大小等。颗粒大小等。颗粒大小等。颗粒大小等。一般来讲，洗脱速度慢一些样品可以与凝胶基

139、质一般来讲，洗脱速度慢一些样品可以与凝胶基质一般来讲，洗脱速度慢一些样品可以与凝胶基质一般来讲，洗脱速度慢一些样品可以与凝胶基质充分平衡，分离效果好。充分平衡，分离效果好。充分平衡，分离效果好。充分平衡，分离效果好。洗脱速度过慢会造成样品扩散加剧、区带变宽，洗脱速度过慢会造成样品扩散加剧、区带变宽，洗脱速度过慢会造成样品扩散加剧、区带变宽，洗脱速度过慢会造成样品扩散加剧、区带变宽，反而会降低分辨率，且实验时间会大大延长。反而会降低分辨率，且实验时间会大大延长。反而会降低分辨率，且实验时间会大大延长。反而会降低分辨率，且实验时间会大大延长。一般凝胶的流速是一般凝胶的流速是一般凝胶的流速是一般凝胶

140、的流速是210 cm / h210 cm / h，市售的凝胶一般，市售的凝胶一般，市售的凝胶一般，市售的凝胶一般会提供一个建议流速，可供参考。会提供一个建议流速，可供参考。会提供一个建议流速，可供参考。会提供一个建议流速，可供参考。 5.7 凝胶层析的应用凝胶层析的应用5.7.1 生物大分子的纯化生物大分子的纯化5.7.2 分子量测定分子量测定5.7.3 脱盐及去除小分子杂质脱盐及去除小分子杂质5.7.4 去热源物质去热源物质5.7.5 溶液的浓缩溶液的浓缩5.7.4 去热源物质去热源物质热源物质是指微生物产生的某些多糖蛋白复热源物质是指微生物产生的某些多糖蛋白复合物等使人体发热的物质。合物等

141、使人体发热的物质。它们是一类分子量很大的物质，所以可以利它们是一类分子量很大的物质，所以可以利用凝胶层析的排阻效应将这些大分子热源用凝胶层析的排阻效应将这些大分子热源物质与其它相对分子量较小的物质分开。物质与其它相对分子量较小的物质分开。例如对于去除水、氨基酸、一些注射液中的例如对于去除水、氨基酸、一些注射液中的热源物质，凝胶层析是一种简单而有效的热源物质，凝胶层析是一种简单而有效的方法。方法。 5.7.5 溶液的浓缩溶液的浓缩利用凝胶颗粒的吸水性可以对大分子样品溶利用凝胶颗粒的吸水性可以对大分子样品溶液进行浓缩。基本不改变溶液的离子强度和液进行浓缩。基本不改变溶液的离子强度和pH值。值。例如

142、将干燥的例如将干燥的Sephadex（粗颗粒）加入溶液（粗颗粒）加入溶液中，中，Sephadex可以吸收大量的水，溶液中的可以吸收大量的水，溶液中的小分子物质也会渗透进入凝胶孔穴内部，而小分子物质也会渗透进入凝胶孔穴内部，而大分子物质则被排阻在外。大分子物质则被排阻在外。通过离心或过滤去除凝胶颗粒，即可得到浓通过离心或过滤去除凝胶颗粒，即可得到浓缩的样品溶液。缩的样品溶液。凝凝胶胶过过滤滤原原理理6.1 离子交换层析简介离子交换层析简介6.2 基本原理基本原理6.3 离子交换剂的种类和性质离子交换剂的种类和性质6.4 离子交换剂的选择、处理和保存离子交换剂的选择、处理和保存6.5 离子交换层析

143、操作中应注意的问题离子交换层析操作中应注意的问题6.6 离子交换层析的应用离子交换层析的应用第六节第六节 离子交换层析离子交换层析6.1 离子交换层析简介离子交换层析简介离子交换层析（离子交换层析（离子交换层析（离子交换层析（Ion Exchange ChromatographyIon Exchange Chromatography，IECIEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换的组分离子与交换

144、剂上的平衡离子进行可逆交换的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。法。法。法。18481848年，年，年，年，ThompsonThompson等人在研究土壤碱性物质交换等人在研究土壤碱性物质交换等人在研究土壤碱性物质交换等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。过程中发现离子交换现象。过程中发现离子交换现象。过程中发现离子交换现象。上世纪上世纪上世纪上世纪4040年代，出现了具有稳定交换特性的聚苯年代，出现了具有稳

145、定交换特性的聚苯年代，出现了具有稳定交换特性的聚苯年代，出现了具有稳定交换特性的聚苯乙烯离子交换树脂。乙烯离子交换树脂。乙烯离子交换树脂。乙烯离子交换树脂。5050年代，离子交换层析进入生物化学领域，应用年代，离子交换层析进入生物化学领域，应用年代，离子交换层析进入生物化学领域，应用年代，离子交换层析进入生物化学领域，应用于氨基酸的分析。于氨基酸的分析。于氨基酸的分析。于氨基酸的分析。6.2 基本原理基本原理离子交换层析是依据各种离子或离子化合物离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。化的。固定相是离子交换剂，由一类不

146、溶于水的惰固定相是离子交换剂，由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。共价结合上某种电荷基团形成的。离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反

147、应。换反应。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称阳离子交换剂。离子基团发生交换作用，称阳离子交换剂。平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称阴离子交换剂。子基团发生交换作用，称阴离子交换剂。 各种离子与离子交换剂上的电荷基团的结合是由各种离子与离子交换剂上的电荷基团的结合是由各种离子与离子交换剂上的电荷基团的结合是由各种离子与离子交换剂上的电荷基团的结合是由静电力产生的，是一个可逆的过程。静电力产生的，是一个可逆的过程。静电力产生的，是一个可逆的过程。静电力产生的，是一个可

148、逆的过程。结合的强度与很多因素有关，包括离子交换剂的结合的强度与很多因素有关，包括离子交换剂的结合的强度与很多因素有关，包括离子交换剂的结合的强度与很多因素有关，包括离子交换剂的性质、离子本身的性质、离子强度、性质、离子本身的性质、离子强度、性质、离子本身的性质、离子强度、性质、离子本身的性质、离子强度、pHpH、温度、温度、温度、温度、溶剂组成等等。溶剂组成等等。溶剂组成等等。溶剂组成等等。离子交换层析就是利用各种离子本身与离子交换离子交换层析就是利用各种离子本身与离子交换离子交换层析就是利用各种离子本身与离子交换离子交换层析就是利用各种离子本身与离子交换剂结合力的差异，并通过改变离子强度、

149、剂结合力的差异，并通过改变离子强度、剂结合力的差异，并通过改变离子强度、剂结合力的差异，并通过改变离子强度、pHpH等等等等条件改变各种离子与离子交换剂的结合力而达到条件改变各种离子与离子交换剂的结合力而达到条件改变各种离子与离子交换剂的结合力而达到条件改变各种离子与离子交换剂的结合力而达到分离的目的。分离的目的。分离的目的。分离的目的。一般来讲，离子价数越高，结合力越大；价数相同一般来讲，离子价数越高，结合力越大；价数相同一般来讲，离子价数越高，结合力越大；价数相同一般来讲，离子价数越高，结合力越大；价数相同时，原子序数越高，结合力越大。如阳离子交换剂时，原子序数越高，结合力越大。如阳离子交

150、换剂时，原子序数越高，结合力越大。如阳离子交换剂时，原子序数越高，结合力越大。如阳离子交换剂对离子的结合力顺序为：对离子的结合力顺序为：对离子的结合力顺序为：对离子的结合力顺序为：LiLi+ + Na Na+ + K K+ + RbRb+ + CsCs+ + ；Na+ CaNa+ Ca2+2+ Al Al3+3+ Ti pH pIpI 时，蛋白带负电，不时，蛋白带负电，不时，蛋白带负电，不时，蛋白带负电，不能与阳离子交换剂结合；能与阳离子交换剂结合；能与阳离子交换剂结合；能与阳离子交换剂结合；pH pH pIpI时，蛋白带正电，时，蛋白带正电，时，蛋白带正电，时，蛋白带正电，能与阳离子交换剂结

151、合，一般能与阳离子交换剂结合，一般能与阳离子交换剂结合，一般能与阳离子交换剂结合，一般pIpI越大的蛋白与离子越大的蛋白与离子越大的蛋白与离子越大的蛋白与离子交换剂结合力越强。交换剂结合力越强。交换剂结合力越强。交换剂结合力越强。111What happens in ion exchange?Sampleapplicationand washElutionEquilibrationRegeneration-+-6.3 6.3 离子交换剂的种类和性质离子交换剂的种类和性质离子交换剂的种类和性质离子交换剂的种类和性质6.3.1 6.3.1 离子交换剂的基质离子交换剂的基质离子交换剂的基质离子交换剂

152、的基质聚苯乙烯离子交换剂机械强度大、流速快。与水的聚苯乙烯离子交换剂机械强度大、流速快。与水的聚苯乙烯离子交换剂机械强度大、流速快。与水的聚苯乙烯离子交换剂机械强度大、流速快。与水的亲和力较小，具有较强的疏水性，容易引起蛋白的亲和力较小，具有较强的疏水性，容易引起蛋白的亲和力较小，具有较强的疏水性，容易引起蛋白的亲和力较小，具有较强的疏水性，容易引起蛋白的变性。一般常用于分离小分子物质，如无机离子、变性。一般常用于分离小分子物质，如无机离子、变性。一般常用于分离小分子物质，如无机离子、变性。一般常用于分离小分子物质，如无机离子、氨基酸、核苷酸等。氨基酸、核苷酸等。氨基酸、核苷酸等。氨基酸、核苷

153、酸等。以纤维素（以纤维素（以纤维素（以纤维素（CelluloseCellulose）、球状纤维素（）、球状纤维素（）、球状纤维素（）、球状纤维素（SephacelSephacel）、）、）、）、葡聚糖（葡聚糖（葡聚糖（葡聚糖（SephadexSephadex）、琼脂糖（）、琼脂糖（）、琼脂糖（）、琼脂糖（SepharoseSepharose）为基质）为基质）为基质）为基质的离子交换剂都与水有较强的亲和力，适合于分离的离子交换剂都与水有较强的亲和力，适合于分离的离子交换剂都与水有较强的亲和力，适合于分离的离子交换剂都与水有较强的亲和力，适合于分离蛋白质等大分子物质。蛋白质等大分子物质。蛋白质等大

154、分子物质。蛋白质等大分子物质。6.3.2 6.3.2 离子交换剂的电荷基团离子交换剂的电荷基团离子交换剂的电荷基团离子交换剂的电荷基团根据与基质共价结合的电荷基团的性质，可以将根据与基质共价结合的电荷基团的性质，可以将根据与基质共价结合的电荷基团的性质，可以将根据与基质共价结合的电荷基团的性质，可以将离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。阳离子交换剂的电荷基团带负电，可以交换阳离阳离子交换剂的电荷基团带负电，可以交换阳离阳离子交换剂的电荷基团带负电，可以交换阳离阳离

155、子交换剂的电荷基团带负电，可以交换阳离子物质。子物质。子物质。子物质。根据电荷基团的解离度不同，又可以分为强酸型、根据电荷基团的解离度不同，又可以分为强酸型、根据电荷基团的解离度不同，又可以分为强酸型、根据电荷基团的解离度不同，又可以分为强酸型、中等酸型和弱酸型三类。中等酸型和弱酸型三类。中等酸型和弱酸型三类。中等酸型和弱酸型三类。强酸型离子交换剂在较大的强酸型离子交换剂在较大的强酸型离子交换剂在较大的强酸型离子交换剂在较大的pHpH范围内电荷基团完范围内电荷基团完范围内电荷基团完范围内电荷基团完全解离全解离全解离全解离弱酸型完全解离的弱酸型完全解离的弱酸型完全解离的弱酸型完全解离的pHpH范

156、围则较小，如羧甲基在范围则较小，如羧甲基在范围则较小，如羧甲基在范围则较小，如羧甲基在pHpH小于小于小于小于6 6时就失去了交换能力。时就失去了交换能力。时就失去了交换能力。时就失去了交换能力。结合磺酸基团（结合磺酸基团（结合磺酸基团（结合磺酸基团（-SO-SO3 3HH），如磺酸甲基（简写为），如磺酸甲基（简写为），如磺酸甲基（简写为），如磺酸甲基（简写为SMSM）、磺酸乙基（）、磺酸乙基（）、磺酸乙基（）、磺酸乙基（SESE）等为强酸型离子交换剂。）等为强酸型离子交换剂。）等为强酸型离子交换剂。）等为强酸型离子交换剂。结合磷酸基团（结合磷酸基团（结合磷酸基团（结合磷酸基团（-PO-PO3

157、 3HH2 2）和亚磷酸基团（）和亚磷酸基团（）和亚磷酸基团（）和亚磷酸基团（-PO-PO2 2HH）为中等酸型离子交换剂。为中等酸型离子交换剂。为中等酸型离子交换剂。为中等酸型离子交换剂。结合酚羟基（结合酚羟基（结合酚羟基（结合酚羟基（-OH -OH ）或羧基（）或羧基（）或羧基（）或羧基（-COOH-COOH），如羧甲），如羧甲），如羧甲），如羧甲基（基（基（基（CMCM）为弱酸型离子交换剂。）为弱酸型离子交换剂。）为弱酸型离子交换剂。）为弱酸型离子交换剂。阴离子交换剂的电荷基团带正电，可以交换阴离阴离子交换剂的电荷基团带正电，可以交换阴离阴离子交换剂的电荷基团带正电，可以交换阴离阴离子交

158、换剂的电荷基团带正电，可以交换阴离子物质。分为强碱型、中等碱型和弱碱型三类。子物质。分为强碱型、中等碱型和弱碱型三类。子物质。分为强碱型、中等碱型和弱碱型三类。子物质。分为强碱型、中等碱型和弱碱型三类。一般结合季胺基团（一般结合季胺基团（一般结合季胺基团（一般结合季胺基团（-N(CH-N(CH3 3) )3 3），如季胺乙基），如季胺乙基），如季胺乙基），如季胺乙基（QAEQAE）为强碱型离子交换剂。）为强碱型离子交换剂。）为强碱型离子交换剂。）为强碱型离子交换剂。结合叔胺（结合叔胺（结合叔胺（结合叔胺（-N(CH-N(CH3 3) )2 2）、仲胺（）、仲胺（）、仲胺（）、仲胺（-NHCH-

159、NHCH3 3）、伯胺）、伯胺）、伯胺）、伯胺（-NH-NH2 2）等为中等或弱碱型离子交换剂。）等为中等或弱碱型离子交换剂。）等为中等或弱碱型离子交换剂。）等为中等或弱碱型离子交换剂。一般来讲强碱型离子交换剂对一般来讲强碱型离子交换剂对一般来讲强碱型离子交换剂对一般来讲强碱型离子交换剂对OHOH- -离子的结合力离子的结合力离子的结合力离子的结合力比比比比ClCl- -离子小，弱碱型离子交换剂对离子小，弱碱型离子交换剂对离子小，弱碱型离子交换剂对离子小，弱碱型离子交换剂对OHOH- -离子的结离子的结离子的结离子的结合力比合力比合力比合力比ClCl- -离子大。离子大。离子大。离子大。 6.

160、3.3 6.3.3 交换容量交换容量交换容量交换容量指离子交换剂能提供交换离子的量，它反映离子指离子交换剂能提供交换离子的量，它反映离子指离子交换剂能提供交换离子的量，它反映离子指离子交换剂能提供交换离子的量，它反映离子交换剂与溶液中离子进行交换的能力。交换剂与溶液中离子进行交换的能力。交换剂与溶液中离子进行交换的能力。交换剂与溶液中离子进行交换的能力。通常所说的离子交换剂的交换容量是指离子交换通常所说的离子交换剂的交换容量是指离子交换通常所说的离子交换剂的交换容量是指离子交换通常所说的离子交换剂的交换容量是指离子交换剂所能提供交换离子的总量，又称为总交换容量，剂所能提供交换离子的总量，又称为

161、总交换容量，剂所能提供交换离子的总量，又称为总交换容量，剂所能提供交换离子的总量，又称为总交换容量，它只和离子交换剂本身的性质有关。它只和离子交换剂本身的性质有关。它只和离子交换剂本身的性质有关。它只和离子交换剂本身的性质有关。在实际实验中关心的是层析柱与样品中各个待分在实际实验中关心的是层析柱与样品中各个待分在实际实验中关心的是层析柱与样品中各个待分在实际实验中关心的是层析柱与样品中各个待分离组分进行交换时的交换容量，它不仅与所用的离组分进行交换时的交换容量，它不仅与所用的离组分进行交换时的交换容量，它不仅与所用的离组分进行交换时的交换容量，它不仅与所用的离子交换剂有关，还与实验条件有很大的

162、关系，离子交换剂有关，还与实验条件有很大的关系，离子交换剂有关，还与实验条件有很大的关系，离子交换剂有关，还与实验条件有很大的关系，一般又称为有效交换容量。一般又称为有效交换容量。一般又称为有效交换容量。一般又称为有效交换容量。影响交换容量的因素主要可以分为两个方面：影响交换容量的因素主要可以分为两个方面：影响交换容量的因素主要可以分为两个方面：影响交换容量的因素主要可以分为两个方面：一方面是离子交换剂颗粒大小、颗粒内孔隙大小一方面是离子交换剂颗粒大小、颗粒内孔隙大小一方面是离子交换剂颗粒大小、颗粒内孔隙大小一方面是离子交换剂颗粒大小、颗粒内孔隙大小以及所分离的样品组分的大小等的影响。以及所分

163、离的样品组分的大小等的影响。以及所分离的样品组分的大小等的影响。以及所分离的样品组分的大小等的影响。这些因素主要影响离子交换剂中能与样品组分进这些因素主要影响离子交换剂中能与样品组分进这些因素主要影响离子交换剂中能与样品组分进这些因素主要影响离子交换剂中能与样品组分进行作用的有效表面积。行作用的有效表面积。行作用的有效表面积。行作用的有效表面积。样品组分与离子交换剂作用的表面积越大当然交样品组分与离子交换剂作用的表面积越大当然交样品组分与离子交换剂作用的表面积越大当然交样品组分与离子交换剂作用的表面积越大当然交换容量越高。一般离子交换剂的孔隙应尽量能够换容量越高。一般离子交换剂的孔隙应尽量能够

164、换容量越高。一般离子交换剂的孔隙应尽量能够换容量越高。一般离子交换剂的孔隙应尽量能够让样品组分进入，这样样品组分与离子交换剂作让样品组分进入，这样样品组分与离子交换剂作让样品组分进入，这样样品组分与离子交换剂作让样品组分进入，这样样品组分与离子交换剂作用面积大。用面积大。用面积大。用面积大。另一些影响因素如实验中的离子强度、另一些影响因素如实验中的离子强度、另一些影响因素如实验中的离子强度、另一些影响因素如实验中的离子强度、pHpH值等，主值等，主值等，主值等，主要影响样品中组分和离子交换剂的带电性质。要影响样品中组分和离子交换剂的带电性质。要影响样品中组分和离子交换剂的带电性质。要影响样品中

165、组分和离子交换剂的带电性质。离子强度增大，交换容量下降。实验中增大离子强离子强度增大，交换容量下降。实验中增大离子强离子强度增大，交换容量下降。实验中增大离子强离子强度增大，交换容量下降。实验中增大离子强度进行洗脱，就是要降低交换容量以将结合在离子度进行洗脱，就是要降低交换容量以将结合在离子度进行洗脱，就是要降低交换容量以将结合在离子度进行洗脱，就是要降低交换容量以将结合在离子交换剂上的样品组分洗脱下来。交换剂上的样品组分洗脱下来。交换剂上的样品组分洗脱下来。交换剂上的样品组分洗脱下来。一般一般一般一般pHpH对弱酸和弱碱型离子交换剂影响较大对弱酸和弱碱型离子交换剂影响较大对弱酸和弱碱型离子交

166、换剂影响较大对弱酸和弱碱型离子交换剂影响较大如：弱酸型离子交换剂在如：弱酸型离子交换剂在如：弱酸型离子交换剂在如：弱酸型离子交换剂在pHpH较高时，电荷基团充分较高时，电荷基团充分较高时，电荷基团充分较高时，电荷基团充分解离，交换容量大；在较低的解离，交换容量大；在较低的解离，交换容量大；在较低的解离，交换容量大；在较低的pHpH时，电荷基团不易时，电荷基团不易时，电荷基团不易时，电荷基团不易解离，交换容量小。解离，交换容量小。解离，交换容量小。解离，交换容量小。pHpH还影响样品组分的带电性。尤其对于蛋白质等两还影响样品组分的带电性。尤其对于蛋白质等两还影响样品组分的带电性。尤其对于蛋白质等

167、两还影响样品组分的带电性。尤其对于蛋白质等两性物质，在离子交换层析中要选择合适的性物质，在离子交换层析中要选择合适的性物质，在离子交换层析中要选择合适的性物质，在离子交换层析中要选择合适的pHpH以使样以使样以使样以使样品组分能充分的与离子交换剂交换、结合。品组分能充分的与离子交换剂交换、结合。品组分能充分的与离子交换剂交换、结合。品组分能充分的与离子交换剂交换、结合。离子交换剂的总交换容量通常以每毫克或每毫升离子交换剂的总交换容量通常以每毫克或每毫升离子交换剂的总交换容量通常以每毫克或每毫升离子交换剂的总交换容量通常以每毫克或每毫升交换剂含有可解离基团的毫克当量数表示。可以交换剂含有可解离基

168、团的毫克当量数表示。可以交换剂含有可解离基团的毫克当量数表示。可以交换剂含有可解离基团的毫克当量数表示。可以由滴定法测定。由滴定法测定。由滴定法测定。由滴定法测定。阳离子交换剂首先用阳离子交换剂首先用阳离子交换剂首先用阳离子交换剂首先用HClHCl处理，使其平衡离子为处理，使其平衡离子为处理，使其平衡离子为处理，使其平衡离子为H+H+。再用水洗至中性。再用水洗至中性。再用水洗至中性。再用水洗至中性。对于强酸型离子交换剂，用对于强酸型离子交换剂，用对于强酸型离子交换剂，用对于强酸型离子交换剂，用NaClNaCl充分置换出充分置换出充分置换出充分置换出HH+ +，再用标准浓度的再用标准浓度的再用标

169、准浓度的再用标准浓度的NaOHNaOH滴定生成的滴定生成的滴定生成的滴定生成的HClHCl，就可以计，就可以计，就可以计，就可以计算出离子交换剂的交换容量；算出离子交换剂的交换容量；算出离子交换剂的交换容量；算出离子交换剂的交换容量；对于弱酸型离子交换剂，用一定量的碱将对于弱酸型离子交换剂，用一定量的碱将对于弱酸型离子交换剂，用一定量的碱将对于弱酸型离子交换剂，用一定量的碱将HH+ +充分充分充分充分置换出来，再用酸滴定，计算出离子交换剂消耗置换出来，再用酸滴定，计算出离子交换剂消耗置换出来，再用酸滴定，计算出离子交换剂消耗置换出来，再用酸滴定，计算出离子交换剂消耗的碱量，就可以算出交换容量。

170、的碱量，就可以算出交换容量。的碱量，就可以算出交换容量。的碱量，就可以算出交换容量。6.4 离子交换剂的选择、处理和保存离子交换剂的选择、处理和保存6.4.1 离子交换剂的选择离子交换剂的选择离子交换剂电荷基团的选择，确定是选择阳离子交换剂电荷基团的选择，确定是选择阳离子交换剂还是选择阴离子交换剂。离子交换剂还是选择阴离子交换剂。离子交换剂基质的选择。离子交换剂基质的选择。离子交换剂颗粒大小。离子交换剂颗粒一般离子交换剂颗粒大小。离子交换剂颗粒一般呈球形，颗粒的大小通常以目数（呈球形，颗粒的大小通常以目数（mesh）或者颗粒直径（或者颗粒直径（mm）来表示，目数越大表）来表示，目数越大表示直径

171、越小。示直径越小。6.4.2 6.4.2 离子交换剂的处理和保存离子交换剂的处理和保存离子交换剂的处理和保存离子交换剂的处理和保存干粉状的离子交换剂首先要进行膨化，将干粉在干粉状的离子交换剂首先要进行膨化，将干粉在干粉状的离子交换剂首先要进行膨化，将干粉在干粉状的离子交换剂首先要进行膨化，将干粉在水中充分溶胀，以使离子交换剂颗粒的孔隙增大，水中充分溶胀，以使离子交换剂颗粒的孔隙增大，水中充分溶胀，以使离子交换剂颗粒的孔隙增大，水中充分溶胀，以使离子交换剂颗粒的孔隙增大，具有交换活性的电荷基团充分暴露出来。具有交换活性的电荷基团充分暴露出来。具有交换活性的电荷基团充分暴露出来。具有交换活性的电荷

172、基团充分暴露出来。而后用水悬浮去除杂质和细小颗粒。而后用水悬浮去除杂质和细小颗粒。而后用水悬浮去除杂质和细小颗粒。而后用水悬浮去除杂质和细小颗粒。再用酸碱分别浸泡，每一种试剂处理后要用水洗再用酸碱分别浸泡，每一种试剂处理后要用水洗再用酸碱分别浸泡，每一种试剂处理后要用水洗再用酸碱分别浸泡，每一种试剂处理后要用水洗至中性，再用另一种试剂处理，最后再用水洗至至中性，再用另一种试剂处理，最后再用水洗至至中性，再用另一种试剂处理，最后再用水洗至至中性，再用另一种试剂处理，最后再用水洗至中性，这是为了进一步去除杂质，并使离子交换中性，这是为了进一步去除杂质，并使离子交换中性，这是为了进一步去除杂质，并使

173、离子交换中性，这是为了进一步去除杂质，并使离子交换剂带上需要的平衡离子。剂带上需要的平衡离子。剂带上需要的平衡离子。剂带上需要的平衡离子。处理时应注意酸碱浓度不宜过高、处理时间不宜处理时应注意酸碱浓度不宜过高、处理时间不宜处理时应注意酸碱浓度不宜过高、处理时间不宜处理时应注意酸碱浓度不宜过高、处理时间不宜过长、温度不宜过高，以免离子交换剂被破坏。过长、温度不宜过高，以免离子交换剂被破坏。过长、温度不宜过高，以免离子交换剂被破坏。过长、温度不宜过高，以免离子交换剂被破坏。一般阳离子交换剂最后用碱处理，阴离子交换剂一般阳离子交换剂最后用碱处理，阴离子交换剂一般阳离子交换剂最后用碱处理，阴离子交换剂

174、一般阳离子交换剂最后用碱处理，阴离子交换剂最后用酸处理。常用的酸是最后用酸处理。常用的酸是最后用酸处理。常用的酸是最后用酸处理。常用的酸是HClHCl，碱是，碱是，碱是，碱是NaOHNaOH或再或再或再或再加一定的加一定的加一定的加一定的NaClNaCl，这样处理后阳离子交换剂为，这样处理后阳离子交换剂为，这样处理后阳离子交换剂为，这样处理后阳离子交换剂为NaNa型，型，型，型，阴离子交换剂为阴离子交换剂为阴离子交换剂为阴离子交换剂为ClCl型。使用的酸碱浓度一般小于型。使用的酸碱浓度一般小于型。使用的酸碱浓度一般小于型。使用的酸碱浓度一般小于0.5 mol / L0.5 mol / L，浸泡

175、时间一般，浸泡时间一般，浸泡时间一般，浸泡时间一般30 min30 min。另外要注意的是离子交换剂使用前要排除气泡，另外要注意的是离子交换剂使用前要排除气泡，另外要注意的是离子交换剂使用前要排除气泡，另外要注意的是离子交换剂使用前要排除气泡，否则会影响分离效果。否则会影响分离效果。否则会影响分离效果。否则会影响分离效果。离子交换剂的再生：指对使用过的离子交换剂进离子交换剂的再生：指对使用过的离子交换剂进离子交换剂的再生：指对使用过的离子交换剂进离子交换剂的再生：指对使用过的离子交换剂进行处理，使其恢复原来性状的过程。酸碱交替浸行处理，使其恢复原来性状的过程。酸碱交替浸行处理，使其恢复原来性状

176、的过程。酸碱交替浸行处理，使其恢复原来性状的过程。酸碱交替浸泡的处理方法就可以使离子交换剂再生。泡的处理方法就可以使离子交换剂再生。泡的处理方法就可以使离子交换剂再生。泡的处理方法就可以使离子交换剂再生。离子交换剂的转型：指离子交换剂由一种平衡离离子交换剂的转型：指离子交换剂由一种平衡离离子交换剂的转型：指离子交换剂由一种平衡离离子交换剂的转型：指离子交换剂由一种平衡离子转为另一种平衡离子的过程。如对阴离子交换子转为另一种平衡离子的过程。如对阴离子交换子转为另一种平衡离子的过程。如对阴离子交换子转为另一种平衡离子的过程。如对阴离子交换剂用剂用剂用剂用HClHCl处理可将其转为处理可将其转为处理

177、可将其转为处理可将其转为ClCl型，用型，用型，用型，用NaOHNaOH处理可处理可处理可处理可转为转为转为转为OHOH型，用甲酸钠处理可转为甲酸型等。型，用甲酸钠处理可转为甲酸型等。型，用甲酸钠处理可转为甲酸型等。型，用甲酸钠处理可转为甲酸型等。离子交换剂的处理、再生和转型的目的是一致的，离子交换剂的处理、再生和转型的目的是一致的，离子交换剂的处理、再生和转型的目的是一致的，离子交换剂的处理、再生和转型的目的是一致的，都是为了使离子交换剂带上所需的平衡离子。都是为了使离子交换剂带上所需的平衡离子。都是为了使离子交换剂带上所需的平衡离子。都是为了使离子交换剂带上所需的平衡离子。如果平衡离子与离

178、子交换剂结合力过强，会造成组如果平衡离子与离子交换剂结合力过强，会造成组如果平衡离子与离子交换剂结合力过强，会造成组如果平衡离子与离子交换剂结合力过强，会造成组分离子难以与交换剂结合而使交换容量降低。分离子难以与交换剂结合而使交换容量降低。分离子难以与交换剂结合而使交换容量降低。分离子难以与交换剂结合而使交换容量降低。另外还要保证平衡离子不对样品组分有明显影响。另外还要保证平衡离子不对样品组分有明显影响。另外还要保证平衡离子不对样品组分有明显影响。另外还要保证平衡离子不对样品组分有明显影响。如，制备过程中用到的离子交换剂的平衡离子是如，制备过程中用到的离子交换剂的平衡离子是如，制备过程中用到的

179、离子交换剂的平衡离子是如，制备过程中用到的离子交换剂的平衡离子是HH或或或或OHOH离子（其它离子都会对纯水有污染）。但是离子（其它离子都会对纯水有污染）。但是离子（其它离子都会对纯水有污染）。但是离子（其它离子都会对纯水有污染）。但是在分离蛋白质时，一般不能使用在分离蛋白质时，一般不能使用在分离蛋白质时，一般不能使用在分离蛋白质时，一般不能使用HH或或或或OHOH型离子交型离子交型离子交型离子交换剂（换剂（换剂（换剂（HH或或或或OHOH离子被置换出来都会改变层析柱内离子被置换出来都会改变层析柱内离子被置换出来都会改变层析柱内离子被置换出来都会改变层析柱内pHpH值，影响分离效果，甚至引起蛋

180、白质变性）。值，影响分离效果，甚至引起蛋白质变性）。值，影响分离效果，甚至引起蛋白质变性）。值，影响分离效果，甚至引起蛋白质变性）。离子交换剂保存时应首先处理洗净蛋白等杂质，并离子交换剂保存时应首先处理洗净蛋白等杂质，并离子交换剂保存时应首先处理洗净蛋白等杂质，并离子交换剂保存时应首先处理洗净蛋白等杂质，并加入适当的防腐剂，一般加入加入适当的防腐剂，一般加入加入适当的防腐剂，一般加入加入适当的防腐剂，一般加入0.02%0.02%的叠氮钠，的叠氮钠，的叠氮钠，的叠氮钠，4 4下保存。下保存。下保存。下保存。 6.5 离子交换层析操作中应注意的问题离子交换层析操作中应注意的问题6.5.1 层析柱层

181、析柱离子交换层析要根据分离的样品量选择合适离子交换层析要根据分离的样品量选择合适的层析柱，离子交换用的层析柱一般粗而的层析柱，离子交换用的层析柱一般粗而短，不宜过长。短，不宜过长。直径和柱长比一般为直径和柱长比一般为1:10到到1:50之间，层析之间，层析柱安装要垂直。柱安装要垂直。装柱时要均匀平整，不能有气泡。装柱时要均匀平整，不能有气泡。6.5.2 6.5.2 平衡缓冲液平衡缓冲液平衡缓冲液平衡缓冲液平衡缓冲液的离子强度和平衡缓冲液的离子强度和平衡缓冲液的离子强度和平衡缓冲液的离子强度和pHpH的选择首先要保证各的选择首先要保证各的选择首先要保证各的选择首先要保证各个待分离物质个待分离物质

182、个待分离物质个待分离物质( (如蛋白质如蛋白质如蛋白质如蛋白质) )的稳定。的稳定。的稳定。的稳定。其次是要使各个待分离物质与离子交换剂有适当的其次是要使各个待分离物质与离子交换剂有适当的其次是要使各个待分离物质与离子交换剂有适当的其次是要使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合，并尽量使待分离样品和杂质与离子交换剂的结合，并尽量使待分离样品和杂质与离子交换剂的结合，并尽量使待分离样品和杂质与离子交换剂的结合，并尽量使待分离样品和杂质与离子交换剂的结合有较大的差别。结合有较大的差别。结合有较大的差别。结合有较大的差别。平衡缓冲液中不能有与离子交换剂结合力强的离子，平衡缓冲液中不能有与离子交换剂

183、结合力强的离子，平衡缓冲液中不能有与离子交换剂结合力强的离子，平衡缓冲液中不能有与离子交换剂结合力强的离子，否则会大大降低交换容量，影响分离效果。在一些否则会大大降低交换容量，影响分离效果。在一些否则会大大降低交换容量，影响分离效果。在一些否则会大大降低交换容量，影响分离效果。在一些情况下（如污水处理）可以使杂质与离子交换剂有情况下（如污水处理）可以使杂质与离子交换剂有情况下（如污水处理）可以使杂质与离子交换剂有情况下（如污水处理）可以使杂质与离子交换剂有牢固的结合，而样品与离子交换剂结合不稳定，也牢固的结合，而样品与离子交换剂结合不稳定，也牢固的结合，而样品与离子交换剂结合不稳定，也牢固的结

184、合，而样品与离子交换剂结合不稳定，也可以达到分离的目的。可以达到分离的目的。可以达到分离的目的。可以达到分离的目的。6.5.3 6.5.3 上样上样上样上样离子交换层析的上样时应注意样品液的离子强度离子交换层析的上样时应注意样品液的离子强度离子交换层析的上样时应注意样品液的离子强度离子交换层析的上样时应注意样品液的离子强度和和和和pHpH值，上样量也不宜过大，一般为柱床体积的值，上样量也不宜过大，一般为柱床体积的值，上样量也不宜过大，一般为柱床体积的值，上样量也不宜过大，一般为柱床体积的1 15 5为宜，以使样品能吸附在层析柱的上层，为宜，以使样品能吸附在层析柱的上层，为宜，以使样品能吸附在层

185、析柱的上层，为宜，以使样品能吸附在层析柱的上层，得到较好的分离效果。得到较好的分离效果。得到较好的分离效果。得到较好的分离效果。 6.5.4. 6.5.4. 洗脱缓冲液洗脱缓冲液洗脱缓冲液洗脱缓冲液常用梯度洗脱，通常有改变离子强度和改变常用梯度洗脱，通常有改变离子强度和改变常用梯度洗脱，通常有改变离子强度和改变常用梯度洗脱，通常有改变离子强度和改变pHpH两两两两种方式。种方式。种方式。种方式。改变离子强度通常是在洗脱过程中逐步增大离子改变离子强度通常是在洗脱过程中逐步增大离子改变离子强度通常是在洗脱过程中逐步增大离子改变离子强度通常是在洗脱过程中逐步增大离子强度，从而使与离子交换剂结合的各个

186、组分被洗强度，从而使与离子交换剂结合的各个组分被洗强度，从而使与离子交换剂结合的各个组分被洗强度，从而使与离子交换剂结合的各个组分被洗脱下来。脱下来。脱下来。脱下来。而改变而改变而改变而改变pHpH的洗脱，对于阳离子交换剂一般是的洗脱，对于阳离子交换剂一般是的洗脱，对于阳离子交换剂一般是的洗脱，对于阳离子交换剂一般是pHpH从从从从低到高洗脱，阴离子交换剂一般是低到高洗脱，阴离子交换剂一般是低到高洗脱，阴离子交换剂一般是低到高洗脱，阴离子交换剂一般是pHpH从高到低。从高到低。从高到低。从高到低。由于由于由于由于pHpH可能对蛋白的稳定性有较大的影响，故一可能对蛋白的稳定性有较大的影响，故一可

187、能对蛋白的稳定性有较大的影响，故一可能对蛋白的稳定性有较大的影响，故一般通常采用改变离子强度的梯度洗脱。般通常采用改变离子强度的梯度洗脱。般通常采用改变离子强度的梯度洗脱。般通常采用改变离子强度的梯度洗脱。梯度洗脱的装置有线性梯度、凹形梯度、凸形梯梯度洗脱的装置有线性梯度、凹形梯度、凸形梯梯度洗脱的装置有线性梯度、凹形梯度、凸形梯梯度洗脱的装置有线性梯度、凹形梯度、凸形梯度以及分级梯度等洗脱方式。一般线性梯度洗脱度以及分级梯度等洗脱方式。一般线性梯度洗脱度以及分级梯度等洗脱方式。一般线性梯度洗脱度以及分级梯度等洗脱方式。一般线性梯度洗脱分离效果较好，故通常采用线性梯度进行洗脱。分离效果较好，故

188、通常采用线性梯度进行洗脱。分离效果较好，故通常采用线性梯度进行洗脱。分离效果较好，故通常采用线性梯度进行洗脱。6.5.5. 6.5.5. 洗脱速度洗脱速度洗脱速度洗脱速度洗脱液的流速也会影响离子交换层析分离效果，洗脱液的流速也会影响离子交换层析分离效果，洗脱液的流速也会影响离子交换层析分离效果，洗脱液的流速也会影响离子交换层析分离效果，洗脱速度通常要保持恒定。洗脱速度通常要保持恒定。洗脱速度通常要保持恒定。洗脱速度通常要保持恒定。一般来说洗脱速度慢比快的分辨率要好，但洗脱一般来说洗脱速度慢比快的分辨率要好，但洗脱一般来说洗脱速度慢比快的分辨率要好，但洗脱一般来说洗脱速度慢比快的分辨率要好，但洗

189、脱速度过慢会造成分离时间长、样品扩散、谱峰变速度过慢会造成分离时间长、样品扩散、谱峰变速度过慢会造成分离时间长、样品扩散、谱峰变速度过慢会造成分离时间长、样品扩散、谱峰变宽、分辨率降低等副作用，所以要根据实际情况宽、分辨率降低等副作用，所以要根据实际情况宽、分辨率降低等副作用，所以要根据实际情况宽、分辨率降低等副作用，所以要根据实际情况选择合适的洗脱速度。选择合适的洗脱速度。选择合适的洗脱速度。选择合适的洗脱速度。如果洗脱峰相对集中某个区域造成重叠，则应适如果洗脱峰相对集中某个区域造成重叠，则应适如果洗脱峰相对集中某个区域造成重叠，则应适如果洗脱峰相对集中某个区域造成重叠，则应适当缩小梯度范围

190、或降低洗脱速度来提高分辨率；当缩小梯度范围或降低洗脱速度来提高分辨率；当缩小梯度范围或降低洗脱速度来提高分辨率；当缩小梯度范围或降低洗脱速度来提高分辨率；如果分辨率较好，但洗脱峰过宽，则可适当提高如果分辨率较好，但洗脱峰过宽，则可适当提高如果分辨率较好，但洗脱峰过宽，则可适当提高如果分辨率较好，但洗脱峰过宽，则可适当提高洗脱速度。洗脱速度。洗脱速度。洗脱速度。6.5.6 6.5.6 样品的浓缩、脱盐样品的浓缩、脱盐样品的浓缩、脱盐样品的浓缩、脱盐离子交换层析得到的样品往往盐浓度较高，而且离子交换层析得到的样品往往盐浓度较高，而且离子交换层析得到的样品往往盐浓度较高，而且离子交换层析得到的样品往

191、往盐浓度较高，而且体积较大，样品浓度较低。所以一般离子交换层体积较大，样品浓度较低。所以一般离子交换层体积较大，样品浓度较低。所以一般离子交换层体积较大，样品浓度较低。所以一般离子交换层析得到的样品要进行浓缩、脱盐处理。析得到的样品要进行浓缩、脱盐处理。析得到的样品要进行浓缩、脱盐处理。析得到的样品要进行浓缩、脱盐处理。6.6 离子交换层析的应用离子交换层析的应用6.6.1 6.6.1 水处理水处理水处理水处理6.5.2 6.5.2 分离纯化小分子物质分离纯化小分子物质分离纯化小分子物质分离纯化小分子物质6.5.3 6.5.3 分离纯化生物大分子物质分离纯化生物大分子物质分离纯化生物大分子物质

192、分离纯化生物大分子物质6.6.1 6.6.1 水处理水处理水处理水处理离子交换层析方法可以大量、快速制备高纯水。离子交换层析方法可以大量、快速制备高纯水。离子交换层析方法可以大量、快速制备高纯水。离子交换层析方法可以大量、快速制备高纯水。聚苯乙烯树脂广泛的应用于高纯水的制备、硬水聚苯乙烯树脂广泛的应用于高纯水的制备、硬水聚苯乙烯树脂广泛的应用于高纯水的制备、硬水聚苯乙烯树脂广泛的应用于高纯水的制备、硬水软化以及污水处理等方面。软化以及污水处理等方面。软化以及污水处理等方面。软化以及污水处理等方面。先将水依次通过先将水依次通过先将水依次通过先将水依次通过HH+ + 型强阳离子交换剂，去除各种型强

193、阳离子交换剂，去除各种型强阳离子交换剂，去除各种型强阳离子交换剂，去除各种阳离子及与阳离子交换剂吸附的杂质；然后通过阳离子及与阳离子交换剂吸附的杂质；然后通过阳离子及与阳离子交换剂吸附的杂质；然后通过阳离子及与阳离子交换剂吸附的杂质；然后通过OHOH- - 型强阴离子交换剂，去除各种阴离子及与阴型强阴离子交换剂，去除各种阴离子及与阴型强阴离子交换剂，去除各种阴离子及与阴型强阴离子交换剂，去除各种阴离子及与阴离子交换剂吸附的杂质，即可得到纯水。离子交换剂吸附的杂质，即可得到纯水。离子交换剂吸附的杂质，即可得到纯水。离子交换剂吸附的杂质，即可得到纯水。再通过弱型阳离子和阴离子交换剂进一步纯化，再通

194、过弱型阳离子和阴离子交换剂进一步纯化，再通过弱型阳离子和阴离子交换剂进一步纯化，再通过弱型阳离子和阴离子交换剂进一步纯化，就可以得到纯度较高的纯水。就可以得到纯度较高的纯水。就可以得到纯度较高的纯水。就可以得到纯度较高的纯水。离子交换剂使用一段时间后可以通过再生处理重离子交换剂使用一段时间后可以通过再生处理重离子交换剂使用一段时间后可以通过再生处理重离子交换剂使用一段时间后可以通过再生处理重复使用。复使用。复使用。复使用。 6.6.2 6.6.2 分离纯化小分子物质分离纯化小分子物质分离纯化小分子物质分离纯化小分子物质离子交换层析也广泛的应用于无机离子、有机酸、离子交换层析也广泛的应用于无机离

195、子、有机酸、离子交换层析也广泛的应用于无机离子、有机酸、离子交换层析也广泛的应用于无机离子、有机酸、核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子物质的分离纯核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子物质的分离纯核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子物质的分离纯核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子物质的分离纯化。化。化。化。例如，对氨基酸的分析，使用强酸性阳离子聚苯例如，对氨基酸的分析，使用强酸性阳离子聚苯例如，对氨基酸的分析，使用强酸性阳离子聚苯例如，对氨基酸的分析，使用强酸性阳离子聚苯乙烯树脂，将氨基酸混合液在乙烯树脂，将氨基酸混合液在乙烯树脂，将氨基酸混合液在乙烯树脂，将氨基酸混合液在pH 23pH 23上柱。这时上柱。这时上柱

196、。这时上柱。这时氨基酸都结合在树脂上。氨基酸都结合在树脂上。氨基酸都结合在树脂上。氨基酸都结合在树脂上。逐步提高洗脱液的离子强度和逐步提高洗脱液的离子强度和逐步提高洗脱液的离子强度和逐步提高洗脱液的离子强度和pHpH，各种氨基酸将，各种氨基酸将，各种氨基酸将，各种氨基酸将以不同的速度被洗脱下来，可以进行分离鉴定。以不同的速度被洗脱下来，可以进行分离鉴定。以不同的速度被洗脱下来，可以进行分离鉴定。以不同的速度被洗脱下来，可以进行分离鉴定。目前已有全部氨基酸的自动分析仪。目前已有全部氨基酸的自动分析仪。目前已有全部氨基酸的自动分析仪。目前已有全部氨基酸的自动分析仪。6.6.3 6.6.3 分离纯化

197、生物大分子物质分离纯化生物大分子物质分离纯化生物大分子物质分离纯化生物大分子物质离子交换层析是依据物质的带电性质的不同来进离子交换层析是依据物质的带电性质的不同来进离子交换层析是依据物质的带电性质的不同来进离子交换层析是依据物质的带电性质的不同来进行分离纯化的，是分离纯化蛋白质等生物大分子行分离纯化的，是分离纯化蛋白质等生物大分子行分离纯化的，是分离纯化蛋白质等生物大分子行分离纯化的，是分离纯化蛋白质等生物大分子的一种重要手段。的一种重要手段。的一种重要手段。的一种重要手段。由于生物样品中蛋白的复杂性，一般很难只经过由于生物样品中蛋白的复杂性，一般很难只经过由于生物样品中蛋白的复杂性，一般很难

198、只经过由于生物样品中蛋白的复杂性，一般很难只经过一次离子交换层析就达到高纯度，往往要与其它一次离子交换层析就达到高纯度，往往要与其它一次离子交换层析就达到高纯度，往往要与其它一次离子交换层析就达到高纯度，往往要与其它分离方法配合使用。分离方法配合使用。分离方法配合使用。分离方法配合使用。使用离子交换层析分离样品要充分利用其按带电使用离子交换层析分离样品要充分利用其按带电使用离子交换层析分离样品要充分利用其按带电使用离子交换层析分离样品要充分利用其按带电性质来分离的特性，只要选择合适的条件，通过性质来分离的特性，只要选择合适的条件，通过性质来分离的特性，只要选择合适的条件，通过性质来分离的特性，

199、只要选择合适的条件，通过离子交换层析可以得到较满意的分离效果。离子交换层析可以得到较满意的分离效果。离子交换层析可以得到较满意的分离效果。离子交换层析可以得到较满意的分离效果。 离离子子交交换换柱柱层层析析原原理理第七节第七节 亲和层析亲和层析7.1 亲和层析简介亲和层析简介7.2 亲和层析的基本原理亲和层析的基本原理7.3 亲和吸附剂亲和吸附剂7.4 亲和层析操作中的注意事项亲和层析操作中的注意事项7.5 亲和层析的应用亲和层析的应用7.1 7.1 亲和层析亲和层析亲和层析亲和层析简介简介简介简介亲和层析（亲和层析（亲和层析（亲和层析（Affinity ChromatographyAffin

200、ity Chromatography）是利用生）是利用生）是利用生）是利用生物分子间专一的亲和力而进行分离的层析技术。物分子间专一的亲和力而进行分离的层析技术。物分子间专一的亲和力而进行分离的层析技术。物分子间专一的亲和力而进行分离的层析技术。上世纪上世纪上世纪上世纪6060年代末，溴化氰活化多糖凝胶并偶联蛋年代末，溴化氰活化多糖凝胶并偶联蛋年代末，溴化氰活化多糖凝胶并偶联蛋年代末，溴化氰活化多糖凝胶并偶联蛋白质技术的出现，解决了配体固定化的问题，使白质技术的出现，解决了配体固定化的问题，使白质技术的出现，解决了配体固定化的问题，使白质技术的出现，解决了配体固定化的问题，使得亲和层析技术得到了

201、快速的发展。得亲和层析技术得到了快速的发展。得亲和层析技术得到了快速的发展。得亲和层析技术得到了快速的发展。亲和层析是分离纯化蛋白质、酶等生物大分子最亲和层析是分离纯化蛋白质、酶等生物大分子最亲和层析是分离纯化蛋白质、酶等生物大分子最亲和层析是分离纯化蛋白质、酶等生物大分子最为特异而有效的层析技术，分离过程简单、快速，为特异而有效的层析技术，分离过程简单、快速，为特异而有效的层析技术，分离过程简单、快速，为特异而有效的层析技术，分离过程简单、快速，具有很高的分辨率。具有很高的分辨率。具有很高的分辨率。具有很高的分辨率。它还用于某些生物大分子结构和功能的研究。它还用于某些生物大分子结构和功能的研

202、究。它还用于某些生物大分子结构和功能的研究。它还用于某些生物大分子结构和功能的研究。 7.2 7.2 亲和层析的基本原理亲和层析的基本原理亲和层析的基本原理亲和层析的基本原理生物分子间存在很多特异性的相互作用，如我们生物分子间存在很多特异性的相互作用，如我们生物分子间存在很多特异性的相互作用，如我们生物分子间存在很多特异性的相互作用，如我们熟悉的抗原抗体、酶底物或抑制剂、激素熟悉的抗原抗体、酶底物或抑制剂、激素熟悉的抗原抗体、酶底物或抑制剂、激素熟悉的抗原抗体、酶底物或抑制剂、激素受体等等，它们之间都能够专一而可逆的结合，受体等等，它们之间都能够专一而可逆的结合，受体等等，它们之间都能够专一而

203、可逆的结合，受体等等，它们之间都能够专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲和力。这种结合力就称为亲和力。这种结合力就称为亲和力。这种结合力就称为亲和力。亲和层析的分离原理简单的说就是通过将具有亲亲和层析的分离原理简单的说就是通过将具有亲亲和层析的分离原理简单的说就是通过将具有亲亲和层析的分离原理简单的说就是通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分用分子间亲和力的特异性和可逆性

204、，对另一个分用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。子进行分离纯化。子进行分离纯化。子进行分离纯化。被固定在基质上的分子称为配体，配体和基质是被固定在基质上的分子称为配体，配体和基质是被固定在基质上的分子称为配体，配体和基质是被固定在基质上的分子称为配体，配体和基质是共价结合的，构成亲和层析的固定相，称为亲和共价结合的，构成亲和层析的固定相，称为亲和共价结合的，构成亲和层析的固定相，称为亲和共价结合的，构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。吸附剂。吸附剂。吸附剂。亲和层析时首先选择与待分离的生物大分子有亲亲和层析时首先选择与待分离的生物大分子有亲亲和层析时首先选择与待分离的生

205、物大分子有亲亲和层析时首先选择与待分离的生物大分子有亲和力物质作为配体，例如分离酶可以选择其底物和力物质作为配体，例如分离酶可以选择其底物和力物质作为配体，例如分离酶可以选择其底物和力物质作为配体，例如分离酶可以选择其底物类似物或竞争性抑制剂为配体，分离抗体可以选类似物或竞争性抑制剂为配体，分离抗体可以选类似物或竞争性抑制剂为配体，分离抗体可以选类似物或竞争性抑制剂为配体，分离抗体可以选择抗原作为配体等。择抗原作为配体等。择抗原作为配体等。择抗原作为配体等。制备的亲和吸附剂装柱平衡后，当样品溶液通过制备的亲和吸附剂装柱平衡后，当样品溶液通过制备的亲和吸附剂装柱平衡后，当样品溶液通过制备的亲和吸

206、附剂装柱平衡后，当样品溶液通过亲和层析柱的时候，待分离的生物分子就与配体亲和层析柱的时候，待分离的生物分子就与配体亲和层析柱的时候，待分离的生物分子就与配体亲和层析柱的时候，待分离的生物分子就与配体发生特异性的结合，从而留在固定相上。发生特异性的结合，从而留在固定相上。发生特异性的结合，从而留在固定相上。发生特异性的结合，从而留在固定相上。而其它杂质不能与配体结合，仍在流动相中，并而其它杂质不能与配体结合，仍在流动相中，并而其它杂质不能与配体结合，仍在流动相中，并而其它杂质不能与配体结合，仍在流动相中，并随洗脱液流出，这样层析柱中就只有待分离的生随洗脱液流出，这样层析柱中就只有待分离的生随洗脱

207、液流出，这样层析柱中就只有待分离的生随洗脱液流出，这样层析柱中就只有待分离的生物分子。物分子。物分子。物分子。通过适当的洗脱液将其从配体上洗脱下来，就得通过适当的洗脱液将其从配体上洗脱下来，就得通过适当的洗脱液将其从配体上洗脱下来，就得通过适当的洗脱液将其从配体上洗脱下来，就得到了纯化的待分离物质。到了纯化的待分离物质。到了纯化的待分离物质。到了纯化的待分离物质。 7.3 亲和吸附剂亲和吸附剂 选择并制备合适的亲和吸附剂是亲和层析选择并制备合适的亲和吸附剂是亲和层析的关键步骤之一。包括：的关键步骤之一。包括：7.3.1 基质的性质与选择基质的性质与选择7.3.2 基质的活化基质的活化7.3.3

208、 间隔臂分子间隔臂分子7.3.4 配体的性质与分类配体的性质与分类7.3.5 配体与基质的偶联配体与基质的偶联7.3.6 亲和吸附剂的再生与保存亲和吸附剂的再生与保存7.3.1 7.3.1 基质的性质与选择基质的性质与选择基质的性质与选择基质的性质与选择1 1、基质的性质、基质的性质、基质的性质、基质的性质具有较好的物理化学稳定性。在与配体偶联、层具有较好的物理化学稳定性。在与配体偶联、层具有较好的物理化学稳定性。在与配体偶联、层具有较好的物理化学稳定性。在与配体偶联、层析过程中配体与待分离物结合、以及洗脱时的析过程中配体与待分离物结合、以及洗脱时的析过程中配体与待分离物结合、以及洗脱时的析过

209、程中配体与待分离物结合、以及洗脱时的pHpH、离子强度等条件下，基质的性质都没有明显的改离子强度等条件下，基质的性质都没有明显的改离子强度等条件下，基质的性质都没有明显的改离子强度等条件下，基质的性质都没有明显的改变。变。变。变。能够和配体稳定的结合。亲和层析的基质应具有能够和配体稳定的结合。亲和层析的基质应具有能够和配体稳定的结合。亲和层析的基质应具有能够和配体稳定的结合。亲和层析的基质应具有较多的化学活性基团，通过一定的化学处理能够较多的化学活性基团，通过一定的化学处理能够较多的化学活性基团，通过一定的化学处理能够较多的化学活性基团，通过一定的化学处理能够与配体稳定的共价结合，并且结合后不

210、改变基质与配体稳定的共价结合，并且结合后不改变基质与配体稳定的共价结合，并且结合后不改变基质与配体稳定的共价结合，并且结合后不改变基质和配体的基本性质。和配体的基本性质。和配体的基本性质。和配体的基本性质。基质的结构应是均匀的多孔网状结构。以使被分基质的结构应是均匀的多孔网状结构。以使被分基质的结构应是均匀的多孔网状结构。以使被分基质的结构应是均匀的多孔网状结构。以使被分离的生物分子能够均匀、稳定的通透，并充分与离的生物分子能够均匀、稳定的通透，并充分与离的生物分子能够均匀、稳定的通透，并充分与离的生物分子能够均匀、稳定的通透，并充分与配体结合。基质的孔径过小会增加基质的排阻效配体结合。基质的

211、孔径过小会增加基质的排阻效配体结合。基质的孔径过小会增加基质的排阻效配体结合。基质的孔径过小会增加基质的排阻效应，使被分离物与配体结合的机率下降，降低亲应，使被分离物与配体结合的机率下降，降低亲应，使被分离物与配体结合的机率下降，降低亲应，使被分离物与配体结合的机率下降，降低亲和层析的吸附容量。所以一般来说，多选择较大和层析的吸附容量。所以一般来说，多选择较大和层析的吸附容量。所以一般来说，多选择较大和层析的吸附容量。所以一般来说，多选择较大孔径的基质，以使待分离物有充分的空间与配体孔径的基质，以使待分离物有充分的空间与配体孔径的基质，以使待分离物有充分的空间与配体孔径的基质，以使待分离物有充

212、分的空间与配体结合。结合。结合。结合。基质本身与样品中的各个组分均没有明显的非特基质本身与样品中的各个组分均没有明显的非特基质本身与样品中的各个组分均没有明显的非特基质本身与样品中的各个组分均没有明显的非特异性吸附，不影响配体与待分离物的结合。基质异性吸附，不影响配体与待分离物的结合。基质异性吸附，不影响配体与待分离物的结合。基质异性吸附，不影响配体与待分离物的结合。基质应具有较好的亲水性，以使生物分子易于靠近并应具有较好的亲水性，以使生物分子易于靠近并应具有较好的亲水性，以使生物分子易于靠近并应具有较好的亲水性，以使生物分子易于靠近并与配体作用。与配体作用。与配体作用。与配体作用。2 2、基

213、质的选择、基质的选择、基质的选择、基质的选择纤维素价格低，可利用的活性基团较多，但它对蛋白质等纤维素价格低，可利用的活性基团较多，但它对蛋白质等纤维素价格低，可利用的活性基团较多，但它对蛋白质等纤维素价格低，可利用的活性基团较多，但它对蛋白质等生物分子可能有明显的非特异性吸附作用，另外它的稳定生物分子可能有明显的非特异性吸附作用，另外它的稳定生物分子可能有明显的非特异性吸附作用，另外它的稳定生物分子可能有明显的非特异性吸附作用，另外它的稳定性和均一性也较差。性和均一性也较差。性和均一性也较差。性和均一性也较差。交联葡聚糖和聚丙烯酰胺的物理化学稳定性较好，但它们交联葡聚糖和聚丙烯酰胺的物理化学稳

214、定性较好，但它们交联葡聚糖和聚丙烯酰胺的物理化学稳定性较好，但它们交联葡聚糖和聚丙烯酰胺的物理化学稳定性较好，但它们的孔径相对比较小，而且孔径的稳定性不好，可能会在与的孔径相对比较小，而且孔径的稳定性不好，可能会在与的孔径相对比较小，而且孔径的稳定性不好，可能会在与的孔径相对比较小，而且孔径的稳定性不好，可能会在与配体偶联时有较大的降低，不利待分离物与配体充分结合，配体偶联时有较大的降低，不利待分离物与配体充分结合，配体偶联时有较大的降低，不利待分离物与配体充分结合，配体偶联时有较大的降低，不利待分离物与配体充分结合，只有大孔径型号凝胶可以用于亲和层析。只有大孔径型号凝胶可以用于亲和层析。只有

215、大孔径型号凝胶可以用于亲和层析。只有大孔径型号凝胶可以用于亲和层析。多孔玻璃珠的特点是机械强度好，化学稳定性好。但它可多孔玻璃珠的特点是机械强度好，化学稳定性好。但它可多孔玻璃珠的特点是机械强度好，化学稳定性好。但它可多孔玻璃珠的特点是机械强度好，化学稳定性好。但它可利用的活性基团较少，对蛋白质等生物分子也有较强的吸利用的活性基团较少，对蛋白质等生物分子也有较强的吸利用的活性基团较少，对蛋白质等生物分子也有较强的吸利用的活性基团较少，对蛋白质等生物分子也有较强的吸附作用。附作用。附作用。附作用。琼脂糖凝胶具有非特异性吸附低、稳定性好、孔径均匀适琼脂糖凝胶具有非特异性吸附低、稳定性好、孔径均匀适

216、琼脂糖凝胶具有非特异性吸附低、稳定性好、孔径均匀适琼脂糖凝胶具有非特异性吸附低、稳定性好、孔径均匀适当、宜于活化等优点，因此得到了广泛的应用。当、宜于活化等优点，因此得到了广泛的应用。当、宜于活化等优点，因此得到了广泛的应用。当、宜于活化等优点，因此得到了广泛的应用。 7.3.2 基质的活化基质的活化基质的活化后才能与配体偶联。常见方法有：基质的活化后才能与配体偶联。常见方法有：1、多糖基质的活化、多糖基质的活化 溴化氰活化溴化氰活化 环氧乙烷基活化环氧乙烷基活化2、聚丙烯酰胺的活化、聚丙烯酰胺的活化3、多孔玻璃珠的活化、多孔玻璃珠的活化1 1 1 1、多糖基质的活化、多糖基质的活化、多糖基质

217、的活化、多糖基质的活化多糖基质是琼脂糖是一种常用的基质。琼脂糖通多糖基质是琼脂糖是一种常用的基质。琼脂糖通多糖基质是琼脂糖是一种常用的基质。琼脂糖通多糖基质是琼脂糖是一种常用的基质。琼脂糖通常含有大量的羟基，通过一定的处理可以引入各常含有大量的羟基，通过一定的处理可以引入各常含有大量的羟基，通过一定的处理可以引入各常含有大量的羟基，通过一定的处理可以引入各种适宜的活性基团。种适宜的活性基团。种适宜的活性基团。种适宜的活性基团。 溴化氰活化溴化氰活化溴化氰活化溴化氰活化溴化氰活化法是最常用的活化方法之一，活化过溴化氰活化法是最常用的活化方法之一，活化过溴化氰活化法是最常用的活化方法之一，活化过溴

218、化氰活化法是最常用的活化方法之一，活化过程主要是生成亚胺碳酸活性基团，偶联时可以和程主要是生成亚胺碳酸活性基团，偶联时可以和程主要是生成亚胺碳酸活性基团，偶联时可以和程主要是生成亚胺碳酸活性基团，偶联时可以和伯氨基（伯氨基（伯氨基（伯氨基（RNHRNHRNHRNH2 2 2 2）反应，主要生成异脲衍生物。）反应，主要生成异脲衍生物。）反应，主要生成异脲衍生物。）反应，主要生成异脲衍生物。溴化氰活化的基质可以在温和的条件下与配体结合，溴化氰活化的基质可以在温和的条件下与配体结合，溴化氰活化的基质可以在温和的条件下与配体结合，溴化氰活化的基质可以在温和的条件下与配体结合，结合的配体量大。利用溴化氰

219、活化的基质通过进一步结合的配体量大。利用溴化氰活化的基质通过进一步结合的配体量大。利用溴化氰活化的基质通过进一步结合的配体量大。利用溴化氰活化的基质通过进一步处理还可以得到很多其它的衍生物。处理还可以得到很多其它的衍生物。处理还可以得到很多其它的衍生物。处理还可以得到很多其它的衍生物。缺点一：溴化氰活化法的基质和配体偶联后生成的异缺点一：溴化氰活化法的基质和配体偶联后生成的异缺点一：溴化氰活化法的基质和配体偶联后生成的异缺点一：溴化氰活化法的基质和配体偶联后生成的异脲衍生物中氨基的脲衍生物中氨基的脲衍生物中氨基的脲衍生物中氨基的pKpKa a10.410.4，所以通常会带一定的正，所以通常会带

220、一定的正，所以通常会带一定的正，所以通常会带一定的正电荷，从而使基质可能有阴离子离子交换作用，增大电荷，从而使基质可能有阴离子离子交换作用，增大电荷，从而使基质可能有阴离子离子交换作用，增大电荷，从而使基质可能有阴离子离子交换作用，增大了非特异性吸附，影响亲和层析的分辨率。了非特异性吸附，影响亲和层析的分辨率。了非特异性吸附，影响亲和层析的分辨率。了非特异性吸附，影响亲和层析的分辨率。缺点二：溴化氰活化的基质与配体结合不够稳定，尤缺点二：溴化氰活化的基质与配体结合不够稳定，尤缺点二：溴化氰活化的基质与配体结合不够稳定，尤缺点二：溴化氰活化的基质与配体结合不够稳定，尤其是当与小配体结合时，可能会

221、出现配体脱落现象。其是当与小配体结合时，可能会出现配体脱落现象。其是当与小配体结合时，可能会出现配体脱落现象。其是当与小配体结合时，可能会出现配体脱落现象。缺点三：溴化氰有剧毒、易挥发，所以操作不便。缺点三：溴化氰有剧毒、易挥发，所以操作不便。缺点三：溴化氰有剧毒、易挥发，所以操作不便。缺点三：溴化氰有剧毒、易挥发，所以操作不便。 环氧乙烷基活化环氧乙烷基活化活化后的基质都含有环氧乙烷基。活化后的基质都含有环氧乙烷基。活化后的基质都含有环氧乙基，可以结合含活化后的基质都含有环氧乙基，可以结合含有伯氨基（有伯氨基（NH2）、羟基（）、羟基（OH）和硫醇基）和硫醇基（SH）等基团的配体。）等基团的

222、配体。优点：活化后不引入电荷基团，基质与配体形成优点：活化后不引入电荷基团，基质与配体形成优点：活化后不引入电荷基团，基质与配体形成优点：活化后不引入电荷基团，基质与配体形成的的的的N-CN-C、O-CO-C和和和和S-CS-C键都很稳定，配体与基质结合键都很稳定，配体与基质结合键都很稳定，配体与基质结合键都很稳定，配体与基质结合紧密，不但亲和吸附剂使用寿命长，而且便于在紧密，不但亲和吸附剂使用寿命长，而且便于在紧密，不但亲和吸附剂使用寿命长，而且便于在紧密，不但亲和吸附剂使用寿命长，而且便于在亲和层析中使用较强烈的洗脱手段，亲和层析中使用较强烈的洗脱手段，亲和层析中使用较强烈的洗脱手段，亲和

223、层析中使用较强烈的洗脱手段，缺点：用环氧乙基活化的基质在与配体偶联时需缺点：用环氧乙基活化的基质在与配体偶联时需缺点：用环氧乙基活化的基质在与配体偶联时需缺点：用环氧乙基活化的基质在与配体偶联时需要碱性条件，要碱性条件，要碱性条件，要碱性条件，pHpH为为为为913913，温度为，温度为，温度为，温度为20402040。这样。这样。这样。这样的条件对于一些比较敏感的配体可能不适用。的条件对于一些比较敏感的配体可能不适用。的条件对于一些比较敏感的配体可能不适用。的条件对于一些比较敏感的配体可能不适用。前两种方法是比较常用的方法，另外还有很多种前两种方法是比较常用的方法，另外还有很多种前两种方法是

224、比较常用的方法，另外还有很多种前两种方法是比较常用的方法，另外还有很多种活化方法如：活化方法如：活化方法如：活化方法如：N N羟基琥珀酰亚胺（羟基琥珀酰亚胺（羟基琥珀酰亚胺（羟基琥珀酰亚胺（NHSNHS）活化）活化）活化）活化三嗪（三嗪（三嗪（三嗪（triazinetriazine）活化）活化）活化）活化高碘酸盐（高碘酸盐（高碘酸盐（高碘酸盐（periodateperiodate）活化）活化）活化）活化羰酰二咪唑（羰酰二咪唑（羰酰二咪唑（羰酰二咪唑（carbonyldiimidazolecarbonyldiimidazole）活化）活化）活化）活化2,4,6-2,4,6-三氟三氟三氟三氟5 5

225、氯吡啶（氯吡啶（氯吡啶（氯吡啶（FCPFCP）活化）活化）活化）活化乙二酸酰肼（乙二酸酰肼（乙二酸酰肼（乙二酸酰肼（adipic acid dihydrazideadipic acid dihydrazide）活化）活化）活化）活化二乙烯砜（二乙烯砜（二乙烯砜（二乙烯砜（divinylsulfonedivinylsulfone）活化等。）活化等。）活化等。）活化等。2、聚丙烯酰胺的活化、聚丙烯酰胺的活化聚丙烯酰胺凝胶有大量的甲酰胺基，可以通聚丙烯酰胺凝胶有大量的甲酰胺基，可以通过对甲酰胺基的修饰而对聚丙烯酰胺凝胶过对甲酰胺基的修饰而对聚丙烯酰胺凝胶进行活化。进行活化。一般有以下三种方式：氨乙基

226、化作用、肼解一般有以下三种方式：氨乙基化作用、肼解作用和碱解作用。作用和碱解作用。另外在偶联蛋白质配体时也通常用戊二醛活另外在偶联蛋白质配体时也通常用戊二醛活化聚丙烯酰胺凝胶。化聚丙烯酰胺凝胶。 3、多孔玻璃珠的活化、多孔玻璃珠的活化对于多孔玻璃珠等无机凝胶的活化通常采用对于多孔玻璃珠等无机凝胶的活化通常采用硅烷化试剂与玻璃反应生成烷基胺硅烷化试剂与玻璃反应生成烷基胺-玻璃玻璃在多孔玻璃上引进氨基，再通过这些氨基进在多孔玻璃上引进氨基，再通过这些氨基进一步反应引入活性基团，与适当的配体偶一步反应引入活性基团，与适当的配体偶联。联。 7.3.3 间隔臂分子间隔臂分子当配体较小或待分离的生物大分子

227、较大时，当配体较小或待分离的生物大分子较大时，由于空间障碍，影响待分离的生物大分子由于空间障碍，影响待分离的生物大分子与配体的结合，造成吸附量的降低。与配体的结合，造成吸附量的降低。解决这一问题的方法通常是在配体和基质解决这一问题的方法通常是在配体和基质之间引入适当长度的之间引入适当长度的“间隔臂间隔臂”，即加入，即加入一段有机分子，使基质上的配体离开基质一段有机分子，使基质上的配体离开基质的骨架向外扩展伸长，这样就可以减少空的骨架向外扩展伸长，这样就可以减少空间位阻效应，大大增加配体对待分离的生间位阻效应，大大增加配体对待分离的生物大分子的吸附效率。物大分子的吸附效率。引入间隔臂分子常用的方

228、法是将适当长度的氨基引入间隔臂分子常用的方法是将适当长度的氨基引入间隔臂分子常用的方法是将适当长度的氨基引入间隔臂分子常用的方法是将适当长度的氨基化合物化合物化合物化合物NHNH2 2 (CH (CH2 2) )n n R R共价结合到活化的基质上，共价结合到活化的基质上，共价结合到活化的基质上，共价结合到活化的基质上，R R通常是氨基或羧基，通常是氨基或羧基，通常是氨基或羧基，通常是氨基或羧基，n n一般为一般为一般为一般为212212。例如。例如。例如。例如PharmaciaPharmacia公司生产的公司生产的公司生产的公司生产的AH-Sepharose 4BAH-Sepharose 4

229、B和和和和CH-CH-Sepharose 4BSepharose 4B就是分别将就是分别将就是分别将就是分别将1,6-1,6-乙二胺，乙二胺，乙二胺，乙二胺，6-6-氨基乙酸氨基乙酸氨基乙酸氨基乙酸与与与与CNBrCNBr活化的琼脂糖反应引入间隔臂分子。二者活化的琼脂糖反应引入间隔臂分子。二者活化的琼脂糖反应引入间隔臂分子。二者活化的琼脂糖反应引入间隔臂分子。二者的末端分别为氨基或羧基，通过碳二亚胺的缩合的末端分别为氨基或羧基，通过碳二亚胺的缩合的末端分别为氨基或羧基，通过碳二亚胺的缩合的末端分别为氨基或羧基，通过碳二亚胺的缩合作用可以分别与含羧基或氨基的配体偶联。作用可以分别与含羧基或氨基的

230、配体偶联。作用可以分别与含羧基或氨基的配体偶联。作用可以分别与含羧基或氨基的配体偶联。另外也可以通过进一步的活化处理，生成另外也可以通过进一步的活化处理，生成N-羟基琥珀酰亚胺酯、环氧基等活性基团羟基琥珀酰亚胺酯、环氧基等活性基团直接与各种配体偶联。直接与各种配体偶联。引入间隔臂的基质与配体结合时，配体就可引入间隔臂的基质与配体结合时，配体就可以离开基质一定的空间，从而可以减少空以离开基质一定的空间，从而可以减少空间位阻效应，易于与待分离物质结合。间位阻效应，易于与待分离物质结合。加入手臂的长度要恰当，太短则效果不明显；加入手臂的长度要恰当，太短则效果不明显；太长则容易造成弯曲，反而降低吸附效

231、率。太长则容易造成弯曲，反而降低吸附效率。7.3.4 配体的性质与分类配体的性质与分类1、配体的性质、配体的性质 配体与待分离的物质有适当的亲和力配体与待分离的物质有适当的亲和力亲和力太弱，待分离物质不易与配体结合，亲和力太弱，待分离物质不易与配体结合，造成亲和层析吸附效率很低。而且吸附洗造成亲和层析吸附效率很低。而且吸附洗脱过程中易受非特异性吸附的影响，引起脱过程中易受非特异性吸附的影响，引起分辨率下降。分辨率下降。亲和力太强，待分离物质很难与配体分离，亲和力太强，待分离物质很难与配体分离，这又会造成洗脱的困难。这又会造成洗脱的困难。配体与待分离的物质之间的亲和力要有较配体与待分离的物质之间

232、的亲和力要有较强的特异性强的特异性也就是说配体与待分离物质有适当的亲和力，也就是说配体与待分离物质有适当的亲和力，而与样品中其它组分没有明显的亲和力，而与样品中其它组分没有明显的亲和力，对其它组分没有非特异性吸附作用。对其它组分没有非特异性吸附作用。配体要能够与基质稳定的共价结合配体要能够与基质稳定的共价结合实验过程中不易脱落，并且配体与基质偶联实验过程中不易脱落，并且配体与基质偶联后，对其结构没有明显改变，不涉及配体后，对其结构没有明显改变，不涉及配体中与待分离物质有亲和力的部分。中与待分离物质有亲和力的部分。 配体自身应具有较好的稳定性配体自身应具有较好的稳定性在实验中能够耐受偶联以及洗脱

233、时可能的的在实验中能够耐受偶联以及洗脱时可能的的较剧烈的条件，可以多次重复使用。较剧烈的条件，可以多次重复使用。完全满足上述条件的配体实际上很难找到，完全满足上述条件的配体实际上很难找到，在实验中应根据具体的条件来选择尽量满在实验中应根据具体的条件来选择尽量满足上述条件的最适宜的配体。足上述条件的最适宜的配体。 2 2、配体的分类、配体的分类、配体的分类、配体的分类根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为两类：特异性配体（其分为两类：特异性配体（其分为两类：特异

234、性配体（其分为两类：特异性配体（specific ligandspecific ligand）和通）和通）和通）和通用性配体（用性配体（用性配体（用性配体（general ligandgeneral ligand）。）。）。）。特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白质等生物大分子结合的配体。质等生物大分子结合的配体。质等生物大分子结合的配体。质等生物大分子结合的配体。如生物素和亲和素、抗原和抗体、酶和它的抑制如生物素和亲和素、抗原和抗体、酶和它的抑制如生物素和亲和素

235、、抗原和抗体、酶和它的抑制如生物素和亲和素、抗原和抗体、酶和它的抑制剂、激素受体等，它们结合都具有很高的特异剂、激素受体等，它们结合都具有很高的特异剂、激素受体等，它们结合都具有很高的特异剂、激素受体等，它们结合都具有很高的特异性，用这些物质作为配体都属于特异性配体。性，用这些物质作为配体都属于特异性配体。性，用这些物质作为配体都属于特异性配体。性，用这些物质作为配体都属于特异性配体。对于一些性质不很了解的生物大分子，一般首先对于一些性质不很了解的生物大分子，一般首先对于一些性质不很了解的生物大分子，一般首先对于一些性质不很了解的生物大分子，一般首先使用通用性的配体。使用通用性的配体。使用通用

236、性的配体。使用通用性的配体。通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某一通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某一通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某一通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物大分子结合的配体，如各种凝类的蛋白质等生物大分子结合的配体，如各种凝类的蛋白质等生物大分子结合的配体，如各种凝类的蛋白质等生物大分子结合的配体，如各种凝集素（集素（集素（集素（lectinelectine）可以结合各种糖蛋白，核酸可以）可以结合各种糖蛋白，核酸可以）可以结合各种糖蛋白，核酸可以）可以结合各种糖蛋白，核酸可以结合结合结合结合RNARNA、结合、结合、结合、结合RNARNA

237、的蛋白质等。的蛋白质等。的蛋白质等。的蛋白质等。通用性配体通过选择合适的洗脱条件也可以得到通用性配体通过选择合适的洗脱条件也可以得到通用性配体通过选择合适的洗脱条件也可以得到通用性配体通过选择合适的洗脱条件也可以得到很高的分辨率。很高的分辨率。很高的分辨率。很高的分辨率。通用性配体还具有结构稳定、偶联率高、吸附容通用性配体还具有结构稳定、偶联率高、吸附容通用性配体还具有结构稳定、偶联率高、吸附容通用性配体还具有结构稳定、偶联率高、吸附容量高、易于洗脱、价格便宜等优点。量高、易于洗脱、价格便宜等优点。量高、易于洗脱、价格便宜等优点。量高、易于洗脱、价格便宜等优点。 7.3.5 配体与基质的偶联配

238、体与基质的偶联基质活化后的活性基团可以在较温和的条件基质活化后的活性基团可以在较温和的条件下与含氨基、羧基醛基、酮基、羟基、硫下与含氨基、羧基醛基、酮基、羟基、硫醇基等多种配体反应，使配体偶联在基质醇基等多种配体反应，使配体偶联在基质上。上。另外通过碳二亚胺、戊二醛等双功能试剂的另外通过碳二亚胺、戊二醛等双功能试剂的作用也可以使配体与基质偶联。作用也可以使配体与基质偶联。配体和基质偶联完毕后，必须要反复洗涤，以去配体和基质偶联完毕后，必须要反复洗涤，以去配体和基质偶联完毕后，必须要反复洗涤，以去配体和基质偶联完毕后，必须要反复洗涤，以去除未偶联的配体。除未偶联的配体。除未偶联的配体。除未偶联的

239、配体。另外要用适当的方法封闭基质中未偶联上配体的另外要用适当的方法封闭基质中未偶联上配体的另外要用适当的方法封闭基质中未偶联上配体的另外要用适当的方法封闭基质中未偶联上配体的活性基团，也就是使基质失活，以免影响后面的活性基团，也就是使基质失活，以免影响后面的活性基团，也就是使基质失活，以免影响后面的活性基团，也就是使基质失活，以免影响后面的亲和层析分离。例如对于能结合氨基的活性基团，亲和层析分离。例如对于能结合氨基的活性基团，亲和层析分离。例如对于能结合氨基的活性基团，亲和层析分离。例如对于能结合氨基的活性基团，常用的方法是用常用的方法是用常用的方法是用常用的方法是用2 2乙醇胺、氨基乙烷等小

240、分子处乙醇胺、氨基乙烷等小分子处乙醇胺、氨基乙烷等小分子处乙醇胺、氨基乙烷等小分子处理。理。理。理。配体与基质偶联后，通常要测定配体的结合量以配体与基质偶联后，通常要测定配体的结合量以配体与基质偶联后，通常要测定配体的结合量以配体与基质偶联后，通常要测定配体的结合量以了解其与基质的偶联情况，同时也可以推断亲和了解其与基质的偶联情况，同时也可以推断亲和了解其与基质的偶联情况，同时也可以推断亲和了解其与基质的偶联情况，同时也可以推断亲和层析过程中对待分离的生物大分子吸附容量。层析过程中对待分离的生物大分子吸附容量。层析过程中对待分离的生物大分子吸附容量。层析过程中对待分离的生物大分子吸附容量。配体

241、结合量通常是用每毫升或每克基质结合的配体配体结合量通常是用每毫升或每克基质结合的配体配体结合量通常是用每毫升或每克基质结合的配体配体结合量通常是用每毫升或每克基质结合的配体的量来表示。的量来表示。的量来表示。的量来表示。测定配体结合量的方法很多，下面简单介绍几种：测定配体结合量的方法很多，下面简单介绍几种：测定配体结合量的方法很多，下面简单介绍几种：测定配体结合量的方法很多，下面简单介绍几种： 1) 1) 差量分析：根据加入配体的总量减去配体与基质差量分析：根据加入配体的总量减去配体与基质差量分析：根据加入配体的总量减去配体与基质差量分析：根据加入配体的总量减去配体与基质偶联后洗涤出来的量即可

242、大致推算出配体的结合偶联后洗涤出来的量即可大致推算出配体的结合偶联后洗涤出来的量即可大致推算出配体的结合偶联后洗涤出来的量即可大致推算出配体的结合量。当配体可以用光谱法准确定量时，这种方法量。当配体可以用光谱法准确定量时，这种方法量。当配体可以用光谱法准确定量时，这种方法量。当配体可以用光谱法准确定量时，这种方法还是相当准确的。还是相当准确的。还是相当准确的。还是相当准确的。2) 2) 直接光谱测量：对于能够吸收直接光谱测量：对于能够吸收直接光谱测量：对于能够吸收直接光谱测量：对于能够吸收250nm250nm以上波长的以上波长的以上波长的以上波长的配体，可以直接用光谱法测定与基质结合的配体配体

243、，可以直接用光谱法测定与基质结合的配体配体，可以直接用光谱法测定与基质结合的配体配体，可以直接用光谱法测定与基质结合的配体的量。的量。的量。的量。3) 3) 凝胶溶解：通过适当的方法将凝胶溶解，如凝胶溶解：通过适当的方法将凝胶溶解，如凝胶溶解：通过适当的方法将凝胶溶解，如凝胶溶解：通过适当的方法将凝胶溶解，如7575下下下下与酸或碱作用，而后直接用光谱法测量。与酸或碱作用，而后直接用光谱法测量。与酸或碱作用，而后直接用光谱法测量。与酸或碱作用，而后直接用光谱法测量。4) 4) 酸或酶的水解：用酸或酶作用，使得基质释放出酸或酶的水解：用酸或酶作用，使得基质释放出酸或酶的水解：用酸或酶作用，使得基

244、质释放出酸或酶的水解：用酸或酶作用，使得基质释放出配体或配体的裂解物进行分析。配体或配体的裂解物进行分析。配体或配体的裂解物进行分析。配体或配体的裂解物进行分析。5) 2,4,6-5) 2,4,6-三硝基苯磺酸钠（三硝基苯磺酸钠（三硝基苯磺酸钠（三硝基苯磺酸钠（TNBSTNBS）分析：利用）分析：利用）分析：利用）分析：利用TNBSTNBS与未结合配体和结合某些配体的基质作用呈现不与未结合配体和结合某些配体的基质作用呈现不与未结合配体和结合某些配体的基质作用呈现不与未结合配体和结合某些配体的基质作用呈现不同的颜色，可以计算出配体结合量同的颜色，可以计算出配体结合量同的颜色，可以计算出配体结合量

245、同的颜色，可以计算出配体结合量6) 6) 元素分析：如果配体中含有某种特别的元素，通元素分析：如果配体中含有某种特别的元素，通元素分析：如果配体中含有某种特别的元素，通元素分析：如果配体中含有某种特别的元素，通过元素分析就可以确定配体结合量。过元素分析就可以确定配体结合量。过元素分析就可以确定配体结合量。过元素分析就可以确定配体结合量。7) 7) 放射性分析法：偶联中加入一定量带有同位素的放射性分析法：偶联中加入一定量带有同位素的放射性分析法：偶联中加入一定量带有同位素的放射性分析法：偶联中加入一定量带有同位素的配体，通过放射性分析确定配体结合量，这是一配体，通过放射性分析确定配体结合量，这是

246、一配体，通过放射性分析确定配体结合量，这是一配体，通过放射性分析确定配体结合量，这是一种非常灵敏的方法。种非常灵敏的方法。种非常灵敏的方法。种非常灵敏的方法。 7.3.6 7.3.6 亲和吸附剂的再生和保存亲和吸附剂的再生和保存亲和吸附剂的再生和保存亲和吸附剂的再生和保存通常使用过的亲和层析柱，用大量的洗脱液或较高浓度通常使用过的亲和层析柱，用大量的洗脱液或较高浓度通常使用过的亲和层析柱，用大量的洗脱液或较高浓度通常使用过的亲和层析柱，用大量的洗脱液或较高浓度的盐溶液洗涤，再用平衡液重新平衡即可再次使用。的盐溶液洗涤，再用平衡液重新平衡即可再次使用。的盐溶液洗涤，再用平衡液重新平衡即可再次使用

247、。的盐溶液洗涤，再用平衡液重新平衡即可再次使用。当待分离样品组分比较复杂的时候，亲和吸附剂可能会当待分离样品组分比较复杂的时候，亲和吸附剂可能会当待分离样品组分比较复杂的时候，亲和吸附剂可能会当待分离样品组分比较复杂的时候，亲和吸附剂可能会产生较严重的不可逆吸附，使亲和吸附剂的吸附效率明产生较严重的不可逆吸附，使亲和吸附剂的吸附效率明产生较严重的不可逆吸附，使亲和吸附剂的吸附效率明产生较严重的不可逆吸附，使亲和吸附剂的吸附效率明显下降。这时需要使用一些比较强烈的处理手段，使用显下降。这时需要使用一些比较强烈的处理手段，使用显下降。这时需要使用一些比较强烈的处理手段，使用显下降。这时需要使用一些

248、比较强烈的处理手段，使用高浓度的盐溶液、尿素等变性剂或加入适当的非专一性高浓度的盐溶液、尿素等变性剂或加入适当的非专一性高浓度的盐溶液、尿素等变性剂或加入适当的非专一性高浓度的盐溶液、尿素等变性剂或加入适当的非专一性蛋白酶。蛋白酶。蛋白酶。蛋白酶。如果配体是蛋白质等一些易于变性的物质，则应注意处如果配体是蛋白质等一些易于变性的物质，则应注意处如果配体是蛋白质等一些易于变性的物质，则应注意处如果配体是蛋白质等一些易于变性的物质，则应注意处理时不能改变配体的活性。理时不能改变配体的活性。理时不能改变配体的活性。理时不能改变配体的活性。亲和吸附剂的保存一般是加入亲和吸附剂的保存一般是加入亲和吸附剂的

249、保存一般是加入亲和吸附剂的保存一般是加入0.01%0.01%的叠氮化钠，的叠氮化钠，的叠氮化钠，的叠氮化钠，4 4下保存。也可以加入下保存。也可以加入下保存。也可以加入下保存。也可以加入0.5%0.5%的醋酸洗必泰或的醋酸洗必泰或的醋酸洗必泰或的醋酸洗必泰或0.05%0.05%的苯甲的苯甲的苯甲的苯甲酸。亲和吸附剂绝对不允许冰冻。酸。亲和吸附剂绝对不允许冰冻。酸。亲和吸附剂绝对不允许冰冻。酸。亲和吸附剂绝对不允许冰冻。 7.4 亲和层析操作中的注意事项亲和层析操作中的注意事项7.4.1 上样上样亲和层析纯化生物大分子通常采用柱层析的亲和层析纯化生物大分子通常采用柱层析的方法。亲和层析柱一般很短

250、，通常方法。亲和层析柱一般很短，通常10cm左左右。上样时应注意选择适当的条件，包括右。上样时应注意选择适当的条件，包括上样流速、缓冲液种类、上样流速、缓冲液种类、pH、离子强度、离子强度、温度等，以使待分离的物质能够充分结合温度等，以使待分离的物质能够充分结合在亲和吸附剂上。在亲和吸附剂上。样品液的浓度不易过高，上样时流速应比较样品液的浓度不易过高，上样时流速应比较慢，以保证样品和亲和吸附剂有充分的接慢，以保证样品和亲和吸附剂有充分的接触时间进行吸附。触时间进行吸附。当配体和待分离的生物大分子的亲和力比较当配体和待分离的生物大分子的亲和力比较小或样品浓度较高、杂质较多时，可以在小或样品浓度较

251、高、杂质较多时，可以在上样后停止流动，让样品在层析柱中反应上样后停止流动，让样品在层析柱中反应一段时间，或者将上样后流出液进行二次一段时间，或者将上样后流出液进行二次上样，以增加吸附量。上样，以增加吸附量。样品缓冲液中一般有一定的的离子强度，以样品缓冲液中一般有一定的的离子强度，以减小基质、配体与样品其它组分之间的非减小基质、配体与样品其它组分之间的非特异性吸附。特异性吸附。通常亲和力随温度的升高而下降通常亲和力随温度的升高而下降在上样时可以选择适当较低的温度，使待分在上样时可以选择适当较低的温度，使待分离的物质与配体有较大的亲和力，能够充离的物质与配体有较大的亲和力，能够充分的结合；分的结合

252、；洗脱过程可以选择适当较高的温度，使待分洗脱过程可以选择适当较高的温度，使待分离的物质与配体的亲和力下降，以便于将离的物质与配体的亲和力下降，以便于将待分离的物质从配体上洗脱下来。待分离的物质从配体上洗脱下来。上样后用平衡洗脱液洗去未吸附在亲和吸附上样后用平衡洗脱液洗去未吸附在亲和吸附剂上的杂质。平衡缓冲液的流速可以快一剂上的杂质。平衡缓冲液的流速可以快一些。些。但如果待分离物质与配体结合较弱，平衡缓但如果待分离物质与配体结合较弱，平衡缓冲液的流速还是较慢为宜。冲液的流速还是较慢为宜。如果存在较强的非特异性吸附，可以用适当如果存在较强的非特异性吸附，可以用适当较高离子强度的平衡缓冲液进行洗涤较

253、高离子强度的平衡缓冲液进行洗涤但应注意平衡缓冲液不应对待分离物质与配但应注意平衡缓冲液不应对待分离物质与配体的结合有明显影响，以免将待分离物质体的结合有明显影响，以免将待分离物质同时洗下。同时洗下。7.4.2 7.4.2 洗脱洗脱洗脱洗脱洗脱方法分为两种：特异性洗脱和非特异性洗脱洗脱方法分为两种：特异性洗脱和非特异性洗脱洗脱方法分为两种：特异性洗脱和非特异性洗脱洗脱方法分为两种：特异性洗脱和非特异性洗脱 特异性洗脱特异性洗脱特异性洗脱特异性洗脱特异性洗脱是指利用洗脱液中的物质与待分离物特异性洗脱是指利用洗脱液中的物质与待分离物特异性洗脱是指利用洗脱液中的物质与待分离物特异性洗脱是指利用洗脱液中

254、的物质与待分离物质或与配体的亲和特性而将待分离物质从亲和吸质或与配体的亲和特性而将待分离物质从亲和吸质或与配体的亲和特性而将待分离物质从亲和吸质或与配体的亲和特性而将待分离物质从亲和吸附剂上洗脱下来。附剂上洗脱下来。附剂上洗脱下来。附剂上洗脱下来。 特异性洗脱分为两种：一种是选择与配体有亲和特异性洗脱分为两种：一种是选择与配体有亲和特异性洗脱分为两种：一种是选择与配体有亲和特异性洗脱分为两种：一种是选择与配体有亲和力的物质进行洗脱，另一种是选择与待分离物质力的物质进行洗脱，另一种是选择与待分离物质力的物质进行洗脱，另一种是选择与待分离物质力的物质进行洗脱，另一种是选择与待分离物质有亲和力的物质

255、进行洗脱。有亲和力的物质进行洗脱。有亲和力的物质进行洗脱。有亲和力的物质进行洗脱。例例1：用凝集素作为配体分离糖蛋白时，：用凝集素作为配体分离糖蛋白时，可以用适当的单糖洗脱，单糖与糖蛋可以用适当的单糖洗脱，单糖与糖蛋白竞争对凝集素的结合，可以将糖蛋白竞争对凝集素的结合，可以将糖蛋白从凝集素上置换下来。白从凝集素上置换下来。例例2：用染料作为配体分离脱氢酶时，可：用染料作为配体分离脱氢酶时，可以选择以选择NAD+进行洗脱，进行洗脱，NAD+是脱氢是脱氢酶的辅酶，它与脱氢酶的亲和力要强酶的辅酶，它与脱氢酶的亲和力要强于染料，所以脱氢酶就会与于染料，所以脱氢酶就会与NAD+结合结合而从配体上脱离。而

256、从配体上脱离。特异性洗脱方法的优点是特异性强，可进一步消除特异性洗脱方法的优点是特异性强，可进一步消除特异性洗脱方法的优点是特异性强，可进一步消除特异性洗脱方法的优点是特异性强，可进一步消除非特异性吸附的影响，提高分辨率。非特异性吸附的影响，提高分辨率。非特异性吸附的影响，提高分辨率。非特异性吸附的影响，提高分辨率。待分离物质与配体亲和力很强时，非特异性洗脱方待分离物质与配体亲和力很强时，非特异性洗脱方待分离物质与配体亲和力很强时，非特异性洗脱方待分离物质与配体亲和力很强时，非特异性洗脱方法需要较强烈的洗脱条件，可能使蛋白质等生物大法需要较强烈的洗脱条件，可能使蛋白质等生物大法需要较强烈的洗脱

257、条件，可能使蛋白质等生物大法需要较强烈的洗脱条件，可能使蛋白质等生物大分子变性，甚至只能使待分离的生物大分子变性才分子变性，甚至只能使待分离的生物大分子变性才分子变性，甚至只能使待分离的生物大分子变性才分子变性，甚至只能使待分离的生物大分子变性才能够洗脱下来；特异性洗脱可以避免这种情况。能够洗脱下来；特异性洗脱可以避免这种情况。能够洗脱下来；特异性洗脱可以避免这种情况。能够洗脱下来；特异性洗脱可以避免这种情况。亲和吸附达到平衡较慢，洗脱需要较长的时间和较亲和吸附达到平衡较慢，洗脱需要较长的时间和较亲和吸附达到平衡较慢，洗脱需要较长的时间和较亲和吸附达到平衡较慢，洗脱需要较长的时间和较大的洗脱条

258、件，可通过适当的改变其它条件，如选大的洗脱条件，可通过适当的改变其它条件，如选大的洗脱条件，可通过适当的改变其它条件，如选大的洗脱条件，可通过适当的改变其它条件，如选择亲和力强的物质洗脱、加大洗脱液浓度等，来缩择亲和力强的物质洗脱、加大洗脱液浓度等，来缩择亲和力强的物质洗脱、加大洗脱液浓度等，来缩择亲和力强的物质洗脱、加大洗脱液浓度等，来缩小洗脱时间和洗脱体积。小洗脱时间和洗脱体积。小洗脱时间和洗脱体积。小洗脱时间和洗脱体积。 非特异性洗脱非特异性洗脱非特异性洗脱非特异性洗脱非特异性洗脱是指通过改变洗脱缓冲液非特异性洗脱是指通过改变洗脱缓冲液非特异性洗脱是指通过改变洗脱缓冲液非特异性洗脱是指通

259、过改变洗脱缓冲液pHpH、离子、离子、离子、离子强度、温度等条件，降低待分离物质与配体的亲强度、温度等条件，降低待分离物质与配体的亲强度、温度等条件，降低待分离物质与配体的亲强度、温度等条件，降低待分离物质与配体的亲和力而将待分离物质洗脱下来。和力而将待分离物质洗脱下来。和力而将待分离物质洗脱下来。和力而将待分离物质洗脱下来。待分离物质与配体亲和力较小时，一般通过连续待分离物质与配体亲和力较小时，一般通过连续待分离物质与配体亲和力较小时，一般通过连续待分离物质与配体亲和力较小时，一般通过连续大体积平衡缓冲液冲洗，就可以在杂质之后将待大体积平衡缓冲液冲洗，就可以在杂质之后将待大体积平衡缓冲液冲洗

260、，就可以在杂质之后将待大体积平衡缓冲液冲洗，就可以在杂质之后将待分离物质洗脱下来。分离物质洗脱下来。分离物质洗脱下来。分离物质洗脱下来。这种洗脱方式简单、条件温和，不会影响待分离这种洗脱方式简单、条件温和，不会影响待分离这种洗脱方式简单、条件温和，不会影响待分离这种洗脱方式简单、条件温和，不会影响待分离物质的活性。但是洗脱体积一般比较大，得到的物质的活性。但是洗脱体积一般比较大，得到的物质的活性。但是洗脱体积一般比较大，得到的物质的活性。但是洗脱体积一般比较大，得到的待分离物质浓度较低。待分离物质浓度较低。待分离物质浓度较低。待分离物质浓度较低。待分离物质和配体结合较强时待分离物质和配体结合较

261、强时待分离物质和配体结合较强时待分离物质和配体结合较强时 。7.5 7.5 亲和层析的应用亲和层析的应用亲和层析的应用亲和层析的应用亲和层析的应用主要是生物大分子的分离、纯化。亲和层析的应用主要是生物大分子的分离、纯化。亲和层析的应用主要是生物大分子的分离、纯化。亲和层析的应用主要是生物大分子的分离、纯化。7.5.1 7.5.1 抗原和抗体抗原和抗体抗原和抗体抗原和抗体利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行分离利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行分离利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行分离利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行分离的方法又称为免疫亲和层析。的方法又称为免疫亲和层析。的方法又

262、称为免疫亲和层析。的方法又称为免疫亲和层析。抗原、抗体间亲和力比较强，洗脱比较困难，通抗原、抗体间亲和力比较强，洗脱比较困难，通抗原、抗体间亲和力比较强，洗脱比较困难，通抗原、抗体间亲和力比较强，洗脱比较困难，通常需要较强烈的洗脱条件。也可以采取适当的方常需要较强烈的洗脱条件。也可以采取适当的方常需要较强烈的洗脱条件。也可以采取适当的方常需要较强烈的洗脱条件。也可以采取适当的方法如改变抗原、抗体种类或使用类似物等来降低法如改变抗原、抗体种类或使用类似物等来降低法如改变抗原、抗体种类或使用类似物等来降低法如改变抗原、抗体种类或使用类似物等来降低二者的亲和力，以便于洗脱。二者的亲和力，以便于洗脱。

263、二者的亲和力，以便于洗脱。二者的亲和力，以便于洗脱。例例例例1 1：将抗原结合于亲和层析基质上，就可以从血清：将抗原结合于亲和层析基质上，就可以从血清：将抗原结合于亲和层析基质上，就可以从血清：将抗原结合于亲和层析基质上，就可以从血清中分离其对应的抗体。中分离其对应的抗体。中分离其对应的抗体。中分离其对应的抗体。例例例例2 2：蛋白质工程菌发酵液中所需蛋白质的分离：蛋白质工程菌发酵液中所需蛋白质的分离：蛋白质工程菌发酵液中所需蛋白质的分离：蛋白质工程菌发酵液中所需蛋白质的分离发酵液中目标蛋白质浓度通常较低，用离子交换、发酵液中目标蛋白质浓度通常较低，用离子交换、发酵液中目标蛋白质浓度通常较低，

264、用离子交换、发酵液中目标蛋白质浓度通常较低，用离子交换、凝胶过滤等方法都难于进行分离，而亲和层析则凝胶过滤等方法都难于进行分离，而亲和层析则凝胶过滤等方法都难于进行分离，而亲和层析则凝胶过滤等方法都难于进行分离，而亲和层析则是一种非常有效的方法。是一种非常有效的方法。是一种非常有效的方法。是一种非常有效的方法。将所需蛋白质作为抗原，经动物免疫后制备抗体，将所需蛋白质作为抗原，经动物免疫后制备抗体，将所需蛋白质作为抗原，经动物免疫后制备抗体，将所需蛋白质作为抗原，经动物免疫后制备抗体，将抗体与适当基质偶联形成亲和吸附剂，就可以将抗体与适当基质偶联形成亲和吸附剂，就可以将抗体与适当基质偶联形成亲和

265、吸附剂，就可以将抗体与适当基质偶联形成亲和吸附剂，就可以对发酵液中的所需蛋白质进行分离纯化。对发酵液中的所需蛋白质进行分离纯化。对发酵液中的所需蛋白质进行分离纯化。对发酵液中的所需蛋白质进行分离纯化。例例例例3 3：金黄色葡萄球菌蛋白：金黄色葡萄球菌蛋白：金黄色葡萄球菌蛋白：金黄色葡萄球菌蛋白A A（Protein AProtein A）能够与免）能够与免）能够与免）能够与免疫球蛋白疫球蛋白疫球蛋白疫球蛋白GG（Ig GIg G）结合，可以用于分离各种）结合，可以用于分离各种）结合，可以用于分离各种）结合，可以用于分离各种Ig GIg G。7.5.2 7.5.2 生物素和亲和素生物素和亲和素生

266、物素和亲和素生物素和亲和素生物素（生物素（生物素（生物素（biotionbiotion）和亲和素（）和亲和素（）和亲和素（）和亲和素（avidinavidin）之间具有很）之间具有很）之间具有很）之间具有很强而特异的亲和力，可以用于亲和层析。如用亲和强而特异的亲和力，可以用于亲和层析。如用亲和强而特异的亲和力，可以用于亲和层析。如用亲和强而特异的亲和力，可以用于亲和层析。如用亲和素分离含有生物素的蛋白等。素分离含有生物素的蛋白等。素分离含有生物素的蛋白等。素分离含有生物素的蛋白等。生物素和亲和素的亲和力很强，其解离常数为生物素和亲和素的亲和力很强，其解离常数为生物素和亲和素的亲和力很强，其解离

267、常数为生物素和亲和素的亲和力很强，其解离常数为10 -10 -15M15M，洗脱通常需要强类的变性条件。，洗脱通常需要强类的变性条件。，洗脱通常需要强类的变性条件。，洗脱通常需要强类的变性条件。也可以选择也可以选择也可以选择也可以选择biotionbiotion的类似物，如：的类似物，如：的类似物，如：的类似物，如：2-iminobiotin2-iminobiotin、diiminobiotindiiminobiotin等降低与等降低与等降低与等降低与avidinavidin的亲和力，这样可以的亲和力，这样可以的亲和力，这样可以的亲和力，这样可以在较温和的条件下将其从在较温和的条件下将其从在较

268、温和的条件下将其从在较温和的条件下将其从avidinavidin上洗脱下来。上洗脱下来。上洗脱下来。上洗脱下来。可以利用生物素和亲和素间的高亲和力，将某种可以利用生物素和亲和素间的高亲和力，将某种可以利用生物素和亲和素间的高亲和力，将某种可以利用生物素和亲和素间的高亲和力，将某种配体固定在基质上。配体固定在基质上。配体固定在基质上。配体固定在基质上。例：将生物素酰化的胰岛素与以亲和素为配体的琼例：将生物素酰化的胰岛素与以亲和素为配体的琼例：将生物素酰化的胰岛素与以亲和素为配体的琼例：将生物素酰化的胰岛素与以亲和素为配体的琼脂糖作用，通过生物素与亲和素的亲和力，胰岛素脂糖作用，通过生物素与亲和素

269、的亲和力，胰岛素脂糖作用，通过生物素与亲和素的亲和力，胰岛素脂糖作用，通过生物素与亲和素的亲和力，胰岛素就被固定在琼脂糖上，可以用于亲和层析分离与胰就被固定在琼脂糖上，可以用于亲和层析分离与胰就被固定在琼脂糖上，可以用于亲和层析分离与胰就被固定在琼脂糖上，可以用于亲和层析分离与胰岛素有亲和力的生物大分子物质。岛素有亲和力的生物大分子物质。岛素有亲和力的生物大分子物质。岛素有亲和力的生物大分子物质。这种非共价的间接结合比直接将胰岛素共价结合与这种非共价的间接结合比直接将胰岛素共价结合与这种非共价的间接结合比直接将胰岛素共价结合与这种非共价的间接结合比直接将胰岛素共价结合与CNBrCNBr活化的琼

270、脂糖上更稳定。活化的琼脂糖上更稳定。活化的琼脂糖上更稳定。活化的琼脂糖上更稳定。很多种生物大分子可以用生物素标记试剂（如生物很多种生物大分子可以用生物素标记试剂（如生物很多种生物大分子可以用生物素标记试剂（如生物很多种生物大分子可以用生物素标记试剂（如生物素与素与素与素与NHSNHS生成的酯）作用结合上生物素，并且不生成的酯）作用结合上生物素，并且不生成的酯）作用结合上生物素，并且不生成的酯）作用结合上生物素，并且不改变其生物活性，这使得生物素和亲和素在亲和层改变其生物活性，这使得生物素和亲和素在亲和层改变其生物活性，这使得生物素和亲和素在亲和层改变其生物活性，这使得生物素和亲和素在亲和层析分

271、离中有更广泛的用途。析分离中有更广泛的用途。析分离中有更广泛的用途。析分离中有更广泛的用途。 7.5.3 维生素、激素和结合转运蛋白维生素、激素和结合转运蛋白通常结合蛋白含量很低，如通常结合蛋白含量很低，如1000升人血浆中升人血浆中只含有只含有20毫克毫克Vit B12结合蛋白，用通常的层结合蛋白，用通常的层析技术难于分离。析技术难于分离。利用维生素或激素与其结合蛋白具有强而特利用维生素或激素与其结合蛋白具有强而特异的亲和力（解离常数为异的亲和力（解离常数为10-710-16M），进），进行亲和层析则可以获得较好的分离效果。行亲和层析则可以获得较好的分离效果。由于亲和力较强，所以洗脱时可能需

272、要较强由于亲和力较强，所以洗脱时可能需要较强烈的条件，另外可以加入适量的配体进行特烈的条件，另外可以加入适量的配体进行特异性洗脱。异性洗脱。7.5.4 7.5.4 激素和受体蛋白激素和受体蛋白激素和受体蛋白激素和受体蛋白激素的受体蛋白属于膜蛋白，利用去污剂溶解后激素的受体蛋白属于膜蛋白，利用去污剂溶解后激素的受体蛋白属于膜蛋白，利用去污剂溶解后激素的受体蛋白属于膜蛋白，利用去污剂溶解后的膜蛋白往往具有相似的物理性质，难于用通常的膜蛋白往往具有相似的物理性质，难于用通常的膜蛋白往往具有相似的物理性质，难于用通常的膜蛋白往往具有相似的物理性质，难于用通常的层析技术分离。的层析技术分离。的层析技术分

273、离。的层析技术分离。去污剂溶解通常不影响受体蛋白与其对应激素的去污剂溶解通常不影响受体蛋白与其对应激素的去污剂溶解通常不影响受体蛋白与其对应激素的去污剂溶解通常不影响受体蛋白与其对应激素的结合。所以利用激素和受体蛋白间的高亲和力结合。所以利用激素和受体蛋白间的高亲和力结合。所以利用激素和受体蛋白间的高亲和力结合。所以利用激素和受体蛋白间的高亲和力（1010-6-61010-12-12MM）而进行亲和层析是分离受体蛋白）而进行亲和层析是分离受体蛋白）而进行亲和层析是分离受体蛋白）而进行亲和层析是分离受体蛋白的重要方法。的重要方法。的重要方法。的重要方法。目前已经用亲和层析方法纯化出了大量的受体蛋

274、目前已经用亲和层析方法纯化出了大量的受体蛋目前已经用亲和层析方法纯化出了大量的受体蛋目前已经用亲和层析方法纯化出了大量的受体蛋白，如乙酰胆碱、肾上腺素、生长激素、吗啡、白，如乙酰胆碱、肾上腺素、生长激素、吗啡、白，如乙酰胆碱、肾上腺素、生长激素、吗啡、白，如乙酰胆碱、肾上腺素、生长激素、吗啡、胰岛素等等多种激素的受体。胰岛素等等多种激素的受体。胰岛素等等多种激素的受体。胰岛素等等多种激素的受体。7.5.5 7.5.5 凝集素和糖蛋白凝集素和糖蛋白凝集素和糖蛋白凝集素和糖蛋白凝集素是一类具有多种特性的糖蛋白，几乎都是凝集素是一类具有多种特性的糖蛋白，几乎都是凝集素是一类具有多种特性的糖蛋白，几乎

275、都是凝集素是一类具有多种特性的糖蛋白，几乎都是从植物中提取。它们能识别特殊的糖，因此可以从植物中提取。它们能识别特殊的糖，因此可以从植物中提取。它们能识别特殊的糖，因此可以从植物中提取。它们能识别特殊的糖，因此可以用于分离多糖、各种糖蛋白、免疫球蛋白、血清用于分离多糖、各种糖蛋白、免疫球蛋白、血清用于分离多糖、各种糖蛋白、免疫球蛋白、血清用于分离多糖、各种糖蛋白、免疫球蛋白、血清蛋白甚至完整的细胞。用凝集素作为配体的亲和蛋白甚至完整的细胞。用凝集素作为配体的亲和蛋白甚至完整的细胞。用凝集素作为配体的亲和蛋白甚至完整的细胞。用凝集素作为配体的亲和层析是分离糖蛋白的主要方法。层析是分离糖蛋白的主要

276、方法。层析是分离糖蛋白的主要方法。层析是分离糖蛋白的主要方法。如：如：如：如：伴刀豆球蛋白伴刀豆球蛋白伴刀豆球蛋白伴刀豆球蛋白A A能结合含能结合含能结合含能结合含 -D-D-吡喃甘露糖苷吡喃甘露糖苷吡喃甘露糖苷吡喃甘露糖苷或或或或 -D-D-吡喃葡萄糖苷的糖蛋白；吡喃葡萄糖苷的糖蛋白；吡喃葡萄糖苷的糖蛋白；吡喃葡萄糖苷的糖蛋白； 麦胚凝集素可麦胚凝集素可麦胚凝集素可麦胚凝集素可以特异的与以特异的与以特异的与以特异的与N-N-乙酰氨基葡萄糖或乙酰氨基葡萄糖或乙酰氨基葡萄糖或乙酰氨基葡萄糖或N-N-乙酰神经氨酸乙酰神经氨酸乙酰神经氨酸乙酰神经氨酸结合，可以用于血型糖蛋白结合，可以用于血型糖蛋白结

277、合，可以用于血型糖蛋白结合，可以用于血型糖蛋白A A、红细胞膜凝集素、红细胞膜凝集素、红细胞膜凝集素、红细胞膜凝集素受体等的分离。受体等的分离。受体等的分离。受体等的分离。洗脱时只需用相应的单糖或类似物，就可以洗脱时只需用相应的单糖或类似物，就可以将待分离的糖蛋白洗脱下来。将待分离的糖蛋白洗脱下来。如：洗脱伴刀豆球蛋白如：洗脱伴刀豆球蛋白A吸附的蛋白可以用吸附的蛋白可以用-D-甲基甘露糖苷或甲基甘露糖苷或-D-甲基葡萄糖苷洗脱。甲基葡萄糖苷洗脱。同样，用适当的糖蛋白或单糖、多糖作为配同样，用适当的糖蛋白或单糖、多糖作为配体也可以分离各种凝集素。体也可以分离各种凝集素。 7.5.6 辅酶辅酶核苷

278、酸及其许多衍生物、各种维生素等是多核苷酸及其许多衍生物、各种维生素等是多种酶的辅酶或辅助因子，利用它们与对应种酶的辅酶或辅助因子，利用它们与对应酶的亲和力可以对多种酶类进行分离纯化。酶的亲和力可以对多种酶类进行分离纯化。例：固定的各种腺嘌呤核苷酸辅酶，包括例：固定的各种腺嘌呤核苷酸辅酶，包括AMP、cAMP、ADP、ATP、CoA、NAD+、NADP+等等应用很广泛，可以用于分离各等等应用很广泛，可以用于分离各种激酶和脱氢酶。种激酶和脱氢酶。7.5.7 多核苷酸和核酸多核苷酸和核酸利用利用poly-U作为配体可以用于分离作为配体可以用于分离mRNA以以及各种及各种poly-U结合蛋白。结合蛋白

279、。poly-A可以用于分离各种可以用于分离各种RNA、RNA聚合聚合酶以及其它酶以及其它poly-A结合蛋白。结合蛋白。以以DNA作为配体可以用于分离各种作为配体可以用于分离各种DNA结结合蛋白、合蛋白、DNA聚合酶、聚合酶、RNA聚合酶、核酸聚合酶、核酸外切酶等多种酶类。外切酶等多种酶类。7.5.8 氨基酸氨基酸固定化氨基酸是多用途的介质，通过氨基酸固定化氨基酸是多用途的介质，通过氨基酸与其互补蛋白间的亲和力，或者通过氨基与其互补蛋白间的亲和力，或者通过氨基酸的疏水性等性质，可以用于多种蛋白质、酸的疏水性等性质，可以用于多种蛋白质、酶的分离纯化。酶的分离纯化。如：如：L-精氨酸可以用于分离羧

280、肽酶；精氨酸可以用于分离羧肽酶；L-赖氨赖氨酸则广泛的应用于分离各种酸则广泛的应用于分离各种rRNA。7.5.9 染料配体染料配体结合在蓝色葡聚糖中的蓝色染料结合在蓝色葡聚糖中的蓝色染料Cibacron Blue F3GA是一种多芳香环的磺化物。由于它具有与是一种多芳香环的磺化物。由于它具有与NAD+相似的空间结构，所以它与各种激酶、脱相似的空间结构，所以它与各种激酶、脱氢酶、血清清蛋白、氢酶、血清清蛋白、DNA聚合酶等具有亲和力，聚合酶等具有亲和力，可以用于亲和层析分离。可以用于亲和层析分离。另外较常用的还有另外较常用的还有Procion Red HE3B等。等。染料作为配体吸附容量高、可多

281、次重复使用。染料作为配体吸附容量高、可多次重复使用。染料有一定的阳离子交换作用，使用时应适当染料有一定的阳离子交换作用，使用时应适当提高缓冲液离子强度来减少非特异性吸附。提高缓冲液离子强度来减少非特异性吸附。7.5.10 7.5.10 分离病毒、细胞分离病毒、细胞分离病毒、细胞分离病毒、细胞利用配体与病毒、细胞表面受体的相互作用，亲利用配体与病毒、细胞表面受体的相互作用，亲利用配体与病毒、细胞表面受体的相互作用，亲利用配体与病毒、细胞表面受体的相互作用，亲和层析也可以用于病毒和细胞的分离。和层析也可以用于病毒和细胞的分离。和层析也可以用于病毒和细胞的分离。和层析也可以用于病毒和细胞的分离。利用

282、凝集素、抗原、抗体等作为配体都可以用于利用凝集素、抗原、抗体等作为配体都可以用于利用凝集素、抗原、抗体等作为配体都可以用于利用凝集素、抗原、抗体等作为配体都可以用于细胞的分离。细胞的分离。细胞的分离。细胞的分离。如：各种凝集素可以用于分离红细胞以及各种淋巴如：各种凝集素可以用于分离红细胞以及各种淋巴如：各种凝集素可以用于分离红细胞以及各种淋巴如：各种凝集素可以用于分离红细胞以及各种淋巴细胞；胰岛素可以用于分离脂肪细胞等。细胞；胰岛素可以用于分离脂肪细胞等。细胞；胰岛素可以用于分离脂肪细胞等。细胞；胰岛素可以用于分离脂肪细胞等。由于细胞体积大、非特异性吸附强，所以亲和层由于细胞体积大、非特异性吸

283、附强，所以亲和层由于细胞体积大、非特异性吸附强，所以亲和层由于细胞体积大、非特异性吸附强，所以亲和层析时要注意选择合适的基质。目前已有特别的基析时要注意选择合适的基质。目前已有特别的基析时要注意选择合适的基质。目前已有特别的基析时要注意选择合适的基质。目前已有特别的基质如质如质如质如PharmaciaPharmacia公司生产的公司生产的公司生产的公司生产的Sepharose 6MBSepharose 6MB，颗粒，颗粒，颗粒，颗粒大、非特异性吸附小，适合用于细胞亲和层析。大、非特异性吸附小，适合用于细胞亲和层析。大、非特异性吸附小，适合用于细胞亲和层析。大、非特异性吸附小，适合用于细胞亲和层

284、析。 7.5.11 金属螯合色谱金属螯合色谱金属螯合色谱以及后面介绍的共价色谱、疏金属螯合色谱以及后面介绍的共价色谱、疏水色谱是一些特殊的亲和层析技术。水色谱是一些特殊的亲和层析技术。金属螯合色谱通常使用亚氨二乙酸（金属螯合色谱通常使用亚氨二乙酸（IDA）等螯合剂，它能与等螯合剂，它能与Cu2+、Zn2+、Fe2+等作用，等作用，生成带有多个配位基的金属螯合物，可以生成带有多个配位基的金属螯合物，可以用于生物分子尤其是对重金属有较强亲和用于生物分子尤其是对重金属有较强亲和力的蛋白质的分离纯化。力的蛋白质的分离纯化。如：如：Cu2+-IDA配体可以用于分离带精氨酸的配体可以用于分离带精氨酸的蛋白

285、质。蛋白质。7.5.12 7.5.12 共价色谱共价色谱共价色谱共价色谱共价色谱与常规的亲和色谱方法不同之处在于它是共价色谱与常规的亲和色谱方法不同之处在于它是共价色谱与常规的亲和色谱方法不同之处在于它是共价色谱与常规的亲和色谱方法不同之处在于它是利用亲和吸附剂与待分离的蛋白质的共价结合而将利用亲和吸附剂与待分离的蛋白质的共价结合而将利用亲和吸附剂与待分离的蛋白质的共价结合而将利用亲和吸附剂与待分离的蛋白质的共价结合而将其吸附，而后用适当的处理方法将共价键打开而将其吸附，而后用适当的处理方法将共价键打开而将其吸附，而后用适当的处理方法将共价键打开而将其吸附，而后用适当的处理方法将共价键打开而将

286、蛋白释放出来。蛋白释放出来。蛋白释放出来。蛋白释放出来。共价色谱结合和洗脱条件一般都很温和，可以多次共价色谱结合和洗脱条件一般都很温和，可以多次共价色谱结合和洗脱条件一般都很温和，可以多次共价色谱结合和洗脱条件一般都很温和，可以多次重复使用。重复使用。重复使用。重复使用。 如：活化的巯基如：活化的巯基如：活化的巯基如：活化的巯基-Sepharose-Sepharose、巯丙基、巯丙基、巯丙基、巯丙基-Sepharose-Sepharose等活等活等活等活化基质可以直接与含巯基的蛋白质通过二硫键共价化基质可以直接与含巯基的蛋白质通过二硫键共价化基质可以直接与含巯基的蛋白质通过二硫键共价化基质可以

287、直接与含巯基的蛋白质通过二硫键共价结合而将其吸附在基质上，通过适当的洗脱液如半结合而将其吸附在基质上，通过适当的洗脱液如半结合而将其吸附在基质上，通过适当的洗脱液如半结合而将其吸附在基质上，通过适当的洗脱液如半胱氨酸，巯基乙醇等还原二硫键即可将蛋白质洗脱胱氨酸，巯基乙醇等还原二硫键即可将蛋白质洗脱胱氨酸，巯基乙醇等还原二硫键即可将蛋白质洗脱胱氨酸，巯基乙醇等还原二硫键即可将蛋白质洗脱下来。下来。下来。下来。7.5.13 疏水色谱疏水色谱疏水色谱是指利用固定的疏水配体和蛋白质疏水色谱是指利用固定的疏水配体和蛋白质疏水表面区域之间的相互作用而进行分离疏水表面区域之间的相互作用而进行分离的色谱技术。的色谱技术。如：用各种烷胺作为配体与基质结合，用于如：用各种烷胺作为配体与基质结合，用于分离糖元磷酸化酶分离糖元磷酸化酶b等。等。