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1、微生物学微生物学实验 吉林大学生物基吉林大学生物基础实验教教学中心学中心无菌技术及无菌操作一.无菌技术二.灭菌方法三.细胞培养无菌操作基本技术无菌技术无菌技术是用于细胞培养过程的术语，其基本原理可用于所有的细胞类型。无菌技术有两个主要目的，一是防止实验室的培养物被其他来源的微生物（如皮肤、衣服或周围环境的微生物）污染。二是防止实验工作者（包括老师和学生）被微生物感染。无菌试验 无菌实验室无菌操作 细胞培养无菌操作 P2 级无菌操作台无菌操作无菌操作室无菌操作室灭菌方法消毒消毒：一般指消灭病原菌和有害微生物的营养体。灭菌菌：一般指杀灭一切微生物的芽孢孢子及休眠体。灭菌的方法菌的方法：一、加热法二
2、、过滤除菌三、辐射灭菌四、化学药品灭菌一、加热法1、干、干热灭菌菌方法：热空气灭菌和灼烧。机理：利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌目的。2、湿、湿热灭菌菌方法：高压蒸汽灭菌法、常压蒸汽灭菌法、煮沸消毒法和超高温杀菌法。机理：利用高温（高于100）导致菌体蛋白质变性达到目的。干热灭菌箱湿湿热灭菌分菌分类1 高高压蒸汽蒸汽灭菌法菌法2 常常压蒸汽蒸汽灭菌法（菌法（间歇歇灭菌）菌） 可采用阿可采用阿诺氏流氏流动蒸汽蒸汽灭菌器菌器进行。行。3 煮沸消毒法煮沸消毒法4 超高温超高温杀菌菌二、过滤除菌主要是主要是选用孔径小（一般微米或微米）的微孔材料（如用孔径小（一般微米或微米）的微孔材料（
3、如磁土、磁土、 石棉、超石棉、超滤膜等）制作成膜等）制作成专门的的细菌菌滤器，通器，通过抽气抽气泵进行减行减压过滤。最广泛的最广泛的过滤器有蔡氏器有蔡氏过滤器和微孔器和微孔滤膜膜过滤器。器。许多多材料如血清、抗生素及糖溶液都是采用此中方法材料如血清、抗生素及糖溶液都是采用此中方法过滤。无菌无菌滤膜（孔径微米）膜（孔径微米）过滤可以有效除去可以有效除去细菌，但不能菌，但不能除去病毒，因此除去病毒，因此过滤后的溶液不一定是没有病毒的。后的溶液不一定是没有病毒的。配液 过滤 除菌连动线三、辐射灭菌实验室的室的辐射射灭菌通常用紫外菌通常用紫外线灭菌。菌。紫外紫外线波波长在在200300nm具有具有杀菌
4、作用，菌作用，其中以其中以265266nm杀菌力最菌力最强。机理：机理：紫外紫外线诱导了胸腺了胸腺嘧啶二聚体的形成和二聚体的形成和DNA链的交的交联，另外由于，另外由于辐射使空气中的氧气射使空气中的氧气电离成离成氧离子，氧离子再使氧气氧化生成臭氧或使水氧氧离子，氧离子再使氧气氧化生成臭氧或使水氧化生化生过氧化氧化氢，过氧化氧化氢和臭氧有和臭氧有杀菌作用。紫菌作用。紫外灯照射距离以不超外灯照射距离以不超过米米为宜。宜。四、化学药品灭菌化学化学药品品灭菌是菌是应用能抑制或用能抑制或杀死微生物的化学死微生物的化学制制剂进行消毒行消毒灭菌的方法。菌的方法。机理：能破坏机理：能破坏细菌代菌代谢机能使机能
5、使细菌不能增殖。菌不能增殖。杀菌菌剂：能破坏：能破坏细菌代菌代谢机能并有致死作用的化学机能并有致死作用的化学试剂 。如重金属离子等。如重金属离子等。抑菌抑菌剂：只是阻抑：只是阻抑细菌代菌代谢机能使机能使细菌不能增殖的菌不能增殖的化学化学试剂。如磺胺。如磺胺类试剂等等实验室常用的室常用的杀菌菌剂有有2%煤酚皂溶液（来煤酚皂溶液（来苏尔），），0.1%升汞，升汞，3%5%甲甲醛溶液，溶液，75%乙醇溶液等。乙醇溶液等。 细胞培养无菌操作基本技胞培养无菌操作基本技术(1)实验前前,无菌室及无菌操作台用紫外灯照射无菌室及无菌操作台用紫外灯照射30-60分分钟灭菌菌,用用70% 酒精擦拭无菌操作台面酒精
6、擦拭无菌操作台面,并开启无菌操作并开启无菌操作台台风机运机运转10分分钟后后,才可开始才可开始实验操作操作.每次操作只每次操作只处理一株理一株细胞胞,以免造成以免造成细胞交叉胞交叉污染染.实验结束后束后,将将实验物品物品带出工作台出工作台.如需要如需要继续进行下一个行下一个实验,则用用70% 酒精擦拭无菌操作台面酒精擦拭无菌操作台面,再再让无菌操作台无菌操作台风机机运运转10分分钟后后,才可才可进行下一个行下一个实验操作。操作。 (2)无菌操作工作区域无菌操作工作区域应保持清保持清洁与与宽敞敞,必要物品必要物品,如如试管架管架,移液器或吸管移液器或吸管头等可以等可以暂时放置放置,其它其它实验用
7、品用品用完后用完后应及及时移出移出,以利气体流通以利气体流通.实验用品要用用品要用70%酒精擦拭后才能酒精擦拭后才能带入无菌操作台内入无菌操作台内.实验操作操作应在操作在操作台中央无菌区域内台中央无菌区域内进行行,勿在勿在边缘非无菌区域操作。非无菌区域操作。(3)小心取出无菌小心取出无菌实验用品用品,避免造成避免造成污染染.切勿碰触吸管切勿碰触吸管与吸与吸头头部或容器瓶口部或容器瓶口,不要在打开的容器正上方操作不要在打开的容器正上方操作实验.容器打开后容器打开后,用手用手夹住瓶盖并握住瓶身住瓶盖并握住瓶身,倾斜斜约45角取用角取用,尽量勿将瓶盖盖口朝上放在台面上。尽量勿将瓶盖盖口朝上放在台面上
8、。 (4)工作人工作人员应注意自身的安全注意自身的安全,必必须穿戴穿戴实验衣与手套衣与手套后才后才进行行实验.对于来自人源性或病毒感染的于来自人源性或病毒感染的细胞株胞株应特特别小心小心,并并选择适当等适当等级的无菌操作台的无菌操作台(至少两至少两级).操作操作过程中程中,应避免引起气溶胶的避免引起气溶胶的产生生,小心有毒性小心有毒性试剂,例如例如DMSO及及TPA等等,并避免尖并避免尖锐物品物品伤人等。人等。(5)定期定期检查下列下列项目目:CO2钢瓶内的瓶内的CO2压力力;CO2培培养箱内的养箱内的CO2浓度度,温度温度,及水及水盘是否有是否有污染染;无菌操作无菌操作台内气流台内气流压力是否正常力是否正常,定期更定期更换紫外灯管及紫外灯管及HEPA过滤器器滤膜膜,预滤网（网（300小小时/预滤网网,3000小小时/HEPA)。
