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1、分子分子细胞胞遗传学技学技术与与产前前诊断断南京大学医学院南京大学医学院王王亚平平2006年年11月月基因基因诊断的中心断的中心问题是是认识遗传变异异、基因突基因突变及与及与表型表型之之间的关系的关系一、分子一、分子细胞胞遗传学技学技术荧光原位光原位杂交技交技术（fluorescenceinsitefluorescenceinsitehybridization,FISHhybridization,FISH）：）：用用荧光物光物质标记特异性特异性DNADNA探探针，与中期与中期细胞染色体或胞染色体或间期期细胞核胞核杂交，交，鉴别和确定出生缺和确定出生缺陷、陷、肿瘤瘤细胞染色体异常，分辨率可达胞染
2、色体异常，分辨率可达5050500kb.500kb.荧光原位光原位杂交技交技术（FluorescenceinsiteFluorescenceinsitehybridization,FISHhybridization,FISH）的特异性）的特异性DNADNA探探针基因座特异性探基因座特异性探针：克隆：克隆扩增增获得。在基因制得。在基因制图方面的努方面的努力，越来越多的力，越来越多的这方面探方面探针可以使用可以使用着着丝粒重复序列探粒重复序列探针：这些特异性的探些特异性的探针可在中期染色体可在中期染色体和和间期期细胞核中胞核中产生生强烈信号，可以烈信号，可以鉴别特异性染色体。特异性染色体。全染色体
3、涂染探全染色体涂染探针：通：通过对来自来自特异性染色体分特异性染色体分检库或或仅含一条人含一条人类染色体的染色体的杂种种细胞胞DNA扩增制增制备。这种种DNA序列的混合物与一条染色体上的多个位点同源。因此在中序列的混合物与一条染色体上的多个位点同源。因此在中期核内，整条染色体得以被涂染。通期核内，整条染色体得以被涂染。通过使用不同的使用不同的荧光素，光素，在一个中期染色体涂片上可以在一个中期染色体涂片上可以鉴别几条不同的染色体。几条不同的染色体。应用用1515号染色体一基因特异性号染色体一基因特异性探探针（红色）色）杂交确定其是否交确定其是否缺失；缺失；绿色探色探针鉴定定1515号染色号染色体
4、着体着丝粒。粒。2424种不同染色体涂染探种不同染色体涂染探针杂交得到的彩色染色体交得到的彩色染色体染色体技染色体技术的的应用用1 1inv(14)(p12q24)t(2; 11)(2q34; 11q13)细胞胞遗传学研究中染色体技学研究中染色体技术的的应用用FISHFISH技技术检出出t(2;14)t(2;14)染色体技染色体技术的的应用用2 2inv(9)(p12q13)分子细胞遗传学：分子细胞遗传学：DMD基因第基因第46号外显子缺失号外显子缺失细胞胞遗传学研究中染色体技学研究中染色体技术的的应用用9 9号染色体涂染探号染色体涂染探针杂交。交。箭箭头示易位到示易位到1010号染色体上号染
5、色体上的来自的来自9 9号染色体的片段号染色体的片段2121号染色体涂染探号染色体涂染探针FISHFISH杂交，交，显示示2121三体三体比比较基因基因组杂交（交（comparativegenomiccomparativegenomichybridization,CGHhybridization,CGH）近年在近年在FISHFISH技技术基基础上上发展起来的一种新的分子展起来的一种新的分子细胞胞遗传学技学技术（19921992，KallioniemiKallioniemi）。其基本原理是用不同）。其基本原理是用不同荧光物光物质分分别标记肿瘤瘤细胞胞DNADNA和正常人和正常人细胞胞DNADNA
6、，然后，然后与正常人中期与正常人中期细胞染色体胞染色体杂交。交。通通过检测染色体上两种染色体上两种荧光信号的相光信号的相对比比值，了解，了解肿瘤瘤细胞胞DNADNA拷拷贝数的数的变化，并可在染色体上定位。化，并可在染色体上定位。这一技一技术已广泛已广泛应用于用于肿瘤基因瘤基因组不平衡的不平衡的检测。比比较基因基因组杂交的原理交的原理 待待测DNADNA（肿瘤瘤细胞胞DNADNA，testtestDNA)DNA)为绿色色 参照参照DNA(DNA(正常正常细胞胞DNADNA，referenceDNAreferenceDNA）为红色色 复染复染为蓝色色人食管人食管鳞癌癌细胞株的比胞株的比较基因基因组
7、杂交交A.A.中期染色体的中期染色体的DAPIDAPI的的B.B.复染复染图B. 中期染色体比中期染色体比较基因基因组杂交（交（CGHCGH）：）：红色区域表示色区域表示 丢失，失，绿色区域表示色区域表示扩增。增。CGHCGH的的优点：点：经一次染色体原位一次染色体原位杂交交实验即可在整条染色体或染色体即可在整条染色体或染色体区区带水平水平对待待检基因基因组DNADNA序列拷序列拷贝数改数改变进行行检测和定和定位。位。无需无需进行染色体培养，行染色体培养，对于不易制于不易制备良好分裂相的良好分裂相的实体体瘤尤瘤尤为适用。适用。所需染色体所需染色体DNADNA可来自各种可来自各种组织，如新，如新
8、鲜组织、福、福尔马林林固定的固定的组织、石蜡包埋、石蜡包埋组织，可在很少量的基，可在很少量的基础上上检测，利于做回利于做回顾性研究。性研究。CGHCGH的局限性：的局限性：难以以检出以下异常：平衡易位，微小突出以下异常：平衡易位，微小突变，基，基因重排，倍体水平改因重排，倍体水平改变。结果可能受到一些因素影响：正常果可能受到一些因素影响：正常细胞存在，胞存在，肿瘤自身的瘤自身的遗传异异质性，系性，系统的波的波动。灵敏度：限于灵敏度：限于检测较大范大范围的缺失（的缺失（101030MB30MB）二、突二、突变分析与分子分析与分子诊断断（一）基因突（一）基因突变类型型点点突突变：只只有有一一个个或
9、或几几个个核核苷苷酸酸的的改改变，是是突突变中最多中最多见的形式。的形式。稳定突定突变：传递中不改中不改变原有的突原有的突变。动态突突变：传递中中不不断断改改变自自己己，多多见于于短短重重复复序序列列的的突突变，在在一一代代代代传递中中重重复复次次数数发生生明明显变化。化。点突点突变的的结果：果：（1 1）同同义突突变（samesensesamesensemutationmutation）：碱碱基基替替换后后，虽然然密密码子子发生生改改变，但但编码氨氨基基酸酸没没有有改改变（遗传密密码的的兼并性），亦称兼并性），亦称静止突静止突变。（2 2）错义突突变（missensemissensemuta
10、tionmutation）：碱碱基基替替换，密密码子子发生改生改变后，后，编码氨基酸亦氨基酸亦发生改生改变，编码另一个氨基酸。另一个氨基酸。 （3 3）无无义突突变（nonsensemutationnonsensemutation）：碱基替）：碱基替换后，使后，使编码氨基酸的密氨基酸的密码子子变成一个成一个终止密止密码子。子。（4 4）中性突）中性突变：包含两种情况，即：包含两种情况，即“同同义突突变”和不改和不改变蛋白蛋白质功能的功能的“错义突突变”基因突基因突变形式形式碱基的插入和缺失碱基的插入和缺失碱碱基基的的插插入入和和缺缺失失：基基因因编码序序列列中中插插入入或或丢失失一一个个或或几
11、几个个碱碱基基，其其结果果是是突突变点点下下游游碱碱基基序序列列发生生移移码，编码氨氨基基酸酸序序列列都都发生生改改变，又又称称移移码突突变（frameshift mutation），），并可在突并可在突变点下游提前出点下游提前出现终止密止密码。碱基的插入和缺失的碱基的插入和缺失的结果果：将：将导致致移移码突突变（frameshift mutation），），并可在突并可在突变点下游点下游提前出提前出现终止密止密码产生生截短型蛋白截短型蛋白缺失突缺失突变基因突基因突变形式形式框框内内突突变（inframeinframemutationmutation）：3 3个个或或是是的的倍倍数数的的碱碱基
12、基缺缺失失或或插插入入导致致的的突突变，使使基基因因丢失或增加失或增加1 1个或几个氨基酸。个或几个氨基酸。DNADNA大大片片段段缺缺失失或或复复制制（largelargedeletiondeletionororduplication)duplication)：几几百百个个bp至至几几十十个个kb的的碱碱基基缺失或复制。缺失或复制。 各种各种类型病理性突型病理性突变的比例的比例1.1.无无义突突变和移和移码突突变：60602.2.稀有的稀有的错义突突变：20203.3.DNADNA大片段缺失或重复大片段缺失或重复: 20204.4.另外：可能和疾病另外：可能和疾病风险评估有关的大量的多估有关
13、的大量的多态位点位点微小突变微小突变（二）（二）目前常用的目前常用的对已知已知点突点突变的分析技的分析技术限制性片段限制性片段长度多度多态性（性（RFLPRFLP）等位基因特异性（等位基因特异性（PCRPCR）扩增（增（ASAASA）等位基因特异性寡核苷酸等位基因特异性寡核苷酸杂交（交（ASOASO）DNADNA芯片芯片1.1.限制性片段限制性片段长度多度多态性（性（RFLPRFLP）分析）分析当突当突变影响到某一限制性内切影响到某一限制性内切酶位点位点时，可通可通过酶切切PCRPCR产物，物，电泳分析泳分析: :限制性片限制性片段段长度多度多态性（性（RFLPRFLP）2.2.等位基因特异性
14、（等位基因特异性（PCRPCR）扩增（增（ASAASA）通通过设计两个两个55端引物，一个与正常端引物，一个与正常DNADNA互互补，一个与突一个与突变DNADNA互互补。分。分别加入加入这两种引物及两种引物及33端引物端引物进行两个平行的行两个平行的PCRPCR，分析，分析结果果。3.3.等位基因特异性寡核苷酸等位基因特异性寡核苷酸杂交（交（ASOASO）设计两段寡核苷酸探两段寡核苷酸探针，其中包含，其中包含发生突生突变的的位点，位点，一段与野生型一段与野生型链互互补，一段与突一段与突变型型链互互补。杂交分析是否存在突交分析是否存在突变4.4.基因芯片：基因芯片：SNP位点的位点的检测Mic
15、roarray-based method for genotyping of functional single nucleotide polymorphisms using dual-color fluorescence hybridization. Mutat Res. 2004; 548: 97-105（三）目前常用的（三）目前常用的未知未知基因突基因突变分析技分析技术异源双异源双链体形成分析（体形成分析（ Heteroduplex analysis, HA）单 链 构构 象象 多多 态 性性 分分 析析 （ Single-strand conformation analysis, SS
16、CP）变 性性 梯梯 度度 凝凝 胶胶 电 泳泳 （ denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE）变性性高高效效液液相相色色谱分分析析（Denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC ）体外蛋白截短体外蛋白截短实验（Protein truncation test, PTTPTT）定定量量多多重重PCRPCR技技术（QuantitativeQuantitativemultiplex PCR, QM-PCR）多多重重探探针连接接依依赖性性扩增增技技术（Multiplex Ligatio
17、n-dependent Probe Amplifcation, MLPA) DNADNA序列分析（序列分析（DNA sequencing)1.1.异源双异源双链体形成分析（体形成分析（HAHA）由由突突变型型和和野野生生型型DNADNA链形形成成的的异异源源双双链DNADNA在在其其错配配处形形成成一一个个凸凸起起，电泳泳时会会产生生与与相相应的的同同源双源双链DNADNA不同的迁移率，从而使两者得以分离。不同的迁移率，从而使两者得以分离。技技术路路线：PCRPCR产物物9595 C C变性性5 5分分钟，3737 C C复复性性 1010分分钟。10%10%聚聚丙丙烯酰胺胺凝凝胶胶电泳泳（0
18、.2%0.2%硝硝酸酸银染色）染色）2.2.变性梯度凝胶性梯度凝胶电泳（泳（DGGEDGGE）利用不同利用不同DNADNA序列开始序列开始变性性时对变性性剂浓度的要求度的要求不同，在不同，在变性性剂浓度梯度凝胶内度梯度凝胶内电泳，野生型泳，野生型DNADNA和突和突变型型DNADNA序列的差异所序列的差异所导致其致其变性点不同使两性点不同使两者的者的电泳迁移率出泳迁移率出现差异差异3.3.单链构象多构象多态性分析（性分析（SSCPSSCP）单链DNADNA在在中中性性条条件件下下会会形形成成二二级结构构。这种种二二级结构构依依赖于于其其碱碱基基的的序序列列。即即使使只只有有一一个个碱碱基基的的
19、不不同同，也也会会形形成成不不同同的的二二级结构构并并可可引引起起非非变性性条条件件下下的的电泳泳迁迁移移率率的差异。的差异。技技术路路线：PCRPCR产物物9595 C C变性性5 5分分钟，立立即即置置冰冰上上。10%10%聚聚丙丙烯酰胺胺凝凝胶胶电泳泳。条条件件：电泳泳缓冲冲液液0.50.5 TBETBE，电压70v,470v,4 C C环境下境下电泳泳过夜（夜（0.2%0.2%硝酸硝酸银染色）。染色）。4.4.体外蛋白截短体外蛋白截短试验（PTTPTT）从从蛋蛋白白质水水平平检测基基因因的的突突变。其其原原理理是是碱碱基基缺缺失失和和插插入入导致致的的移移码突突变、碱碱基基替替换出出现
20、的的无无义突突变均均可可使使基基因因提提前前出出现终止止密密码，从从而而截短截短mRNAmRNA翻翻译的蛋白的蛋白质。技技术路路线：血血细胞胞RNARNAcDNAcDNART-PCRRT-PCR体体外外蛋蛋白白质合合成成电泳泳分分析析截截短短了了的的蛋蛋白白质相相应基基因片段的序列分析因片段的序列分析上游引物上游引物55端均端均连接接T7T7启启动子序列子序列GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACCATGGGGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACCATGG 3535SS甲硫氨酸，甲硫氨酸，T7T7体外体外转录/ /翻翻译体系（兔网体系（兔网
21、织红细胞提取物），胞提取物），3030孵育孵育90min90min，完成体外，完成体外蛋白蛋白质合成。合成。SDS-SDS-聚丙聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶电泳泳5.5.变性高效液相色性高效液相色谱分析（分析（DHPLCDHPLC）19951995年年OefnerandUnderhillOefnerandUnderhill首次首次报道道DHPLCDHPLC技技术。其原。其原理是在接近理是在接近DNADNA融解温度条件下融解温度条件下进行离子行离子对反相高效液相色反相高效液相色谱分析分析。DHPLCDHPLC分分析析突突变的的原原理理：在在DNADNA部部分分变性性的的条条件件下下，变异异型型和和野野生
22、生型型DNADNA可可形形成成同同源源双双链和和异异源源双双链根根据据其其在在层析析柱柱上保留的上保留的时间可以分辨出可以分辨出变异性型异性型DNA.DNA.用离子用离子对反相高效液相色反相高效液相色谱检测DNADNA变异是基于异是基于同同时存在同源双存在同源双链和异源双和异源双链。异源双。异源双链的的检出取决于高效液相色出取决于高效液相色谱的温度。而色的温度。而色谱温度的温度的选定与野生型定与野生型DNADNA融解温度（融解温度（TmTm）有关。）有关。DHPLCDHPLC与其它突与其它突变分析技分析技术的比的比较:对单个核苷个核苷酸酸变异的异的检出率出率:SSCP:SSCP技技术,约75%
23、75%；DHPLC,DHPLC,90%.90%.DHPLC的优点：的优点：灵敏，准确；灵敏，准确；分析速度快，分析速度快，单个个样本的分析本的分析时间仅需几分需几分钟；容易容易实现自自动化操作；化操作；适用于适用于较大大样本中基因突本中基因突变的的筛选。DHPLC分析：（野生型）分析：（野生型）DHPLC分析分析:突突变型（型（单个碱基改个碱基改变）DHPLC分析分析:突突变型（型（单个碱基改个碱基改变）6.6.定量多重定量多重PCRPCR技技术（QuantitativeQuantitativemultiplexPCRmultiplexPCR，Q-M-PCRQ-M-PCR）目目前前各各实验室室
24、普普遍遍采采用用的的突突变基基因因分分析析技技术对基基因因微微小小突突变的的检测具具有有较高高的的敏敏感感性性，如如对单个个碱碱基基改改变的的检出出率率可可达达90%90%以以上上。但但对于于较大大的的DNADNA缺缺失失或或DNADNA重重复复产生生的的突突变，如如以以外外显子子为单位位的的DNADNA缺缺失失，SSCPSSCP、DHPLCDHPLC等等均均难以以将将其其检出出。有有资料料表表明明大大片片段段DNADNA缺缺失失可可占占基基因因突突变的的三三分分之之一一定量多重定量多重PCRPCR技技术要点要点：涉及至少涉及至少2 2个基因的多个外个基因的多个外显子在一个反子在一个反应管内管
25、内同同时进行行PCRPCR扩增，其中一个外增，其中一个外显子作子作为参照外参照外显子，其余作子，其余作为检测外外显子；子；控制控制PCRPCR循循环数数，使，使PCRPCR产物的增加物的增加处于于对数增数增长曲曲线内；内；PCRPCR产物于物于DNADNA测序序仪电泳，其泳，其结果果经GeneScanGeneScan软件件处理；理；以以检测外外显子子PCRPCR产物与参照外物与参照外显子子PCRPCR产物的物的比比值计算模版算模版DNADNA相相对拷拷贝数，确定是否存在数，确定是否存在检测外外显子的子的杂合性缺失；合性缺失；检出的缺失出的缺失经其它方法（其它方法（长片段片段PCRPCR或缺失断
26、裂或缺失断裂点点测序）确序）确认。7. Multiplex Ligation-dependent Probe Amplifcation MLPADenatured genomic DNA is hybridized with a mixture of more than 40 probes.Each MLPA probe consists of two oligonucleotides, one synthetic and one M13-derived.The two part of hybridized probes are ligated.All probe ligation produ
27、cts are amplified by PCR using only one primer pair.Electrophoresis of PCR products on DNA Sequencer in GeneScan model.三、三、遗传性疾病的性疾病的诊断断遗传性疾病的性疾病的诊断：断：（一）（一）临症症诊断断（二）症状出（二）症状出现前的前的诊断断（三）（三）产前前诊断断（一）（一）临症症诊断断根据就根据就诊患者的患者的临床表床表现作出（初步）判断：疾病作出（初步）判断：疾病诊断，断，遗传方式方式（1 1）症状、体征）症状、体征（2 2）系）系谱分析分析部分部分遗传性疾病的性疾
28、病的诊断主要依断主要依赖于症状、体征于症状、体征对于同于同时存在散存在散发病例和病例和遗传性病例的复性病例的复杂性疾病，如性疾病，如肿瘤，瘤，建立相建立相应的的临床可疑病例的判定床可疑病例的判定标准准根据不同的根据不同的遗传性疾病，性疾病，选择适当的适当的实验室技室技术分析确分析确诊：生化技生化技术、细胞技胞技术、分子技、分子技术多用于多用于对先先证者者的的诊断断Pedigree of a family遗传性疾病基因性疾病基因诊断程序断程序临床床诊断和确定分析断和确定分析对象象确定分析的目确定分析的目标基因基因以以检测目目标基因的基因的结构确定分析的技构确定分析的技术构成和分析构成和分析过程：
29、程：基因微小基因微小变异异筛查：SSCP, DGGE, DHPLC, PTT, DNA测序分析序分析基因大片段基因大片段变异（缺失或重复）的分析异（缺失或重复）的分析检出出变异的性异的性质评估和患者家族的估和患者家族的遗传咨咨询。 DHPLCDHPLC突突变分析分析体外蛋白截短体外蛋白截短试验（PTTPTT）HNPCCHNPCC遗传性突性突变DNADNA序列分析序列分析 碱基替碱基替换DNA序列分析序列分析移移码突突变DHPLCDHPLC外外显子缺失子缺失APCAPC基因型和患者基因型和患者临床表型关系的研究床表型关系的研究(1)APC(1)APC基因胚系突基因胚系突变与与FAPFAP临床表型
30、的相关床表型的相关:位于位于第第13091309位位密密码子附近的突子附近的突变，患者，患者临床症床症 状状严重。重。(2)APC(2)APC基因体基因体细胞突胞突变与与CRCCRC生物学特征：生物学特征：APCAPC基因体细胞突变基因体细胞突变有转移有转移无转移无转移含含11141114密码子突变的密码子突变的CRCCRC患者患者 50未见未见11141114密码子突变的密码子突变的CRCCRC患者患者5（38.5%)8Fishers exact test:Fishers exact test: P=0.03P=0.03 （二）症状出（二）症状出现前的前的诊断断应用于用于发病年病年龄延延迟的
31、的遗传性疾病。性疾病。应用于已知用于已知遗传性疾病家族的目前表型正常的个性疾病家族的目前表型正常的个体。体。单基因基因显性性遗传病的病的杂合子个体。合子个体。动态突突变的分析。的分析。结合于合于遗传咨咨询工作。工作。对家庭其他人家庭其他人员进行症状出行症状出现前的基因分析前的基因分析A.A.异源双异源双链体形成分析体形成分析（HDHD）B.B.单链构象构象多多态性分析性分析（SSCPSSCP）AB（三）（三）产前前诊断断分析指征分析指征（1 1）夫）夫妇之一存在染色体畸之一存在染色体畸变，或曾生育染色体病患儿；，或曾生育染色体病患儿；（2 2）有畸形儿生育史；）有畸形儿生育史；（3 3）有原因不明的）有原因不明的习惯性流性流产孕孕妇；（4 4）夫）夫妇之一有先天性代之一有先天性代谢缺陷，或曾生育缺陷，或曾生育这类患儿；患儿；（5 5）X X连锁遗传病基因携病基因携带者孕者孕妇（6 6）有）有遗传病家族史，有系近病家族史，有系近亲婚配的孕婚配的孕妇出生缺陷出生缺陷监测Thanks!
