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1、基因工程的原理和技术基因工程的原理和技术基因工程的基本操作步骤基因工程的基本操作步骤1、获得目的基因、获得目的基因2、形成重组、形成重组DNA分子分子3、将重组、将重组DNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞4、筛选含有目的基因的受体细胞、筛选含有目的基因的受体细胞5、目的基因的表达、目的基因的表达一、获得目的基因一、获得目的基因从基因从基因文库中文库中寻找寻找聚合酶链式反应聚合酶链式反应（PCRPCR）扩增）扩增化学合成法化学合成法目的基因的核苷酸序列未知目的基因的核苷酸序列未知目的基因的核苷酸序列已知目的基因的核苷酸序列已知基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库基因组基因组DNADNA
2、文库文库cDNAcDNA文库文库基因组基因组DNADNA文库与文库与cDNAcDNA文库的比较文库的比较u基因文库基因文库中不是直接保管相中不是直接保管相应基因，而是应基因，而是保存受体菌保存受体菌，菌，菌中含基因中含基因利用利用PCRPCR提取目的基因提取目的基因PCRPCR：是一项在生物：是一项在生物体外复制特定体外复制特定DNADNA片段片段的核酸合成技术。的核酸合成技术。原理：原理：DNADNA双链复制双链复制原料：模板原料：模板DNADNA；DNADNA引物；四种脱氧核苷引物；四种脱氧核苷酸；热稳定酸；热稳定DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq酶）；离子酶）；离子PCR的基本原理
3、的基本原理v类似于类似于DNA的体内复制。首先待扩增的体内复制。首先待扩增DNA 模板加热模板加热变性变性解链，随之将反应混合物冷却解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生列发生退火退火，再将温度升高使退火引物在，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以聚合酶作用下得以延伸延伸。 这种热变性这种热变性-复性复性-延伸的过程就是一个延伸的过程就是一个PCR循环，循环，PCR就就是在合适条件下的这种循环的不断重复。是在合适条件下的这种循环的不断重复。前提前提: :已知目的基因的脱氧已知目的基因的脱氧核苷酸序列核苷酸序列方法：
4、方法：DNADNA受热变性受热变性解旋为单链、冷却后解旋为单链、冷却后DNADNA引物与单链相应引物与单链相应互补序列结合、互补序列结合、DNADNA聚合酶作用下延伸合聚合酶作用下延伸合成互补链成互补链。指数增长归纳7272949494945555PCRPCR循环循环循环循环1234522557294时间（min）温度（）PCR反应PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍模板DNA95PCR的基本原理vPCR反应条件vPCR过程vPCR的特点50
5、引物1引物2DNA引物PCR的基本原理vPCR反应条件vPCR过程vPCR的特点引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理vPCR反应条件vPCR过程vPCR的特点72第1轮结束第2轮开始PCR的基本原理vPCR反应条件vPCR过程vPCR的特点955072TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理vPCR反应条件vPCR过程vPCR的特点72第2轮结束PCR的基本原理vPCR反应条件vPCR过程vPCR的特点重复重复3030轮后轮后2 23030=1,073,741,824=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝
6、数=2n n 循环次数实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数 从基因文库中获取从基因文库中获取利用利用PCRPCR技术扩增技术扩增利用化学方法人工合成利用化学方法人工合成归纳：获取目的基因的方法归纳：获取目的基因的方法2构建载体形成重组形成重组DNADNA分子分子方法：方法：同种限制酶分别同种限制酶分别切割载体和目的基因，切割载体和目的基因，再用再用DNADNA连接酶把两者连连接酶把两者连接。接。将将重组重组DNADNA分子分子导入受体细胞导入受体细胞v导入植物细导入植物细胞胞补充归纳导入方法（重组重组DNADNA分子分子导入农杆菌，导入农杆菌，再让农杆菌感染植物细
7、胞）再让农杆菌感染植物细胞）将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞v农杆菌转化法农杆菌转化法v基因枪法基因枪法v花粉管通道法花粉管通道法导入动物的方法导入动物的方法将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞v显微注射法显微注射法（将基因表达载体提纯，用显微（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中）仪注射到受精卵中）导入微生物导入微生物将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞4检测和鉴定Ca2处理受处理受体细胞成为体细胞成为感受态细胞，感受态细胞，再进行混合。再进行混合。筛选含有目的基因的受体细胞筛选含有目的基因的受体细胞目的基因的表达目的基因的表达v检测检测: :是否插入目
8、的基是否插入目的基因因是否转录是否转录是否翻译是否翻译v鉴定鉴定: :功能活性鉴定功能活性鉴定抗性鉴定抗性鉴定分别提取什么进行检测DNA附着在膜上附着在膜上硝化纤维素硝化纤维素加探针加探针报告基因（含荧光素分子）报告基因（含荧光素分子）变性变性DNA杂交杂交（如检测（如检测SARS病毒等）病毒等）abcd检测是否插入目的基因，检测是否插入目的基因，利用利用DNADNA分子杂交技术分子杂交技术，目的基因，目的基因DNADNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的一条链（作探针）与受体细胞中提取的DNADNA杂交，看是否有杂交，看是否有杂交带。杂交带。检测是否转录出了检测是否转录出了mRNAmRNA，
9、利用利用DNADNA分子杂交技术，分子杂交技术，目的基因目的基因DNADNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的一条链（作探针）与受体细胞中提取的mRNAmRNA杂交，看是否有杂交，看是否有杂交带。杂交带。检测目的基因是否翻译成蛋白质。检测目的基因是否翻译成蛋白质。抗体与蛋白质进行抗原抗体与蛋白质进行抗原抗体杂交，看是否有杂交带。抗体杂交，看是否有杂交带。还可以进行个体水平的鉴定，根据其性状。还可以进行个体水平的鉴定，根据其性状。提示：提示：DNADNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNADNA，然后高，然后高温解成单链，再与同位素标记的温解成单链，再与同位素标
10、记的DNADNA探针杂交；探针杂交；抗原抗体杂抗原抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。相应的抗体，并提取出而来的。3232（8 8分）将分）将动物致病菌的抗原基因物致病菌的抗原基因导入入马铃薯制成植物疫苗，薯制成植物疫苗，饲喂喂转基因基因马铃薯可使薯可使动物物获得免疫力。以下是与植物疫苗制得免疫力。以下是与植物疫苗制备过程相关的程相关的图和表。和表。(08(08江江苏) ) 请根据以上图表回答下列问题。请根据以上图表回答下列问题。（1）在采用常规）在采用常规PCR方法扩增目的基因的过程中，
11、使用的方法扩增目的基因的过程中，使用的DNA聚合酶不同于一般生物体内的聚合酶不同于一般生物体内的DNA聚合酶，其最主要聚合酶，其最主要的特点是的特点是 。（2）PCR过程中退火（复性）温度必须根据引物的碱基数过程中退火（复性）温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定。表量和种类来设定。表1为根据模板设计的两对引物序列，图为根据模板设计的两对引物序列，图2为引物对与模板结合示意图。请判断哪一对引物可采用较高为引物对与模板结合示意图。请判断哪一对引物可采用较高的退火温度？的退火温度？_。（3）图）图1步骤步骤所用的所用的DNA连接酶对所连接的连接酶对所连接的DNA两端碱两端碱基序列是否有专一性要求？
12、基序列是否有专一性要求？ 。（4）为将外源基因转入马铃薯，图）为将外源基因转入马铃薯，图1步骤步骤转基因所用的转基因所用的细菌细菌B通常为通常为 。耐高温耐高温引物对引物对B否否农杆菌农杆菌（5）对符合设计要求的重组质粒）对符合设计要求的重组质粒T进行酶切，。假设所用的酶进行酶切，。假设所用的酶均可将识别位点完全切开，请根据图均可将识别位点完全切开，请根据图1中标示的酶切位点和表中标示的酶切位点和表2所列的识别序列，对以下酶切结果作出判断。所列的识别序列，对以下酶切结果作出判断。采用采用EcoR和和Pst酶切，得到酶切，得到_种种DNA片断。片断。采用采用EcoR和和Sma酶切，得到酶切，得到_种种DNA片断。片断。21
