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1、制药硕班潘婷婷2021207354抗体的分类抗体的分类12单克隆抗体药物研究领域单克隆抗体药物研究领域3单克隆抗体药物最新进展单克隆抗体药物最新进展4 单克隆抗体的开展单克隆抗体的开展多克隆抗体多克隆抗体用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激机体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体，所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物。 利用杂交瘤技术制备的单克隆抗体及其衍生物，由一个识别一种抗原表位的 B 细胞克隆产生的同源抗体 。单克隆抗体单克隆抗体 抗体是机体对抗原刺激发生反响，由浆细胞产生的一种免疫球蛋白。抗体是机体对抗原刺激发生反响，由浆细胞产生的一种免疫球蛋白。它能特异性地
2、识别相应的抗原物质并与之反响。抗体药物就其开展历程及制它能特异性地识别相应的抗原物质并与之反响。抗体药物就其开展历程及制备技术可分为三类：备技术可分为三类：基因工程抗体基因工程抗体以基因工程技术等高新生物技术为平台，制备的生物药物总称 。 我们现在所称的抗体药物或单克隆抗体药物其实就是单克隆抗体和基因工程抗体的统称，其中主要为基因工程抗体。二、单克隆抗体的开展二、单克隆抗体的开展人源性抗体人源化抗体嵌合抗体鼠源性单抗鼠源性抗体鼠源性抗体 从从超超免免疫疫的的供供体体中中即即抗抗原原免免疫疫的的小小鼠鼠获获取取脾脾细细胞胞，再再与与骨骨髓髓瘤瘤细细胞胞融融合合，最最后后对对单单个个细细胞胞进进行
3、行克克隆隆，培培养养出出能能分泌单抗的克隆细胞。分泌单抗的克隆细胞。嵌合抗体嵌合抗体 用用人人源源基基因因代代替替鼠鼠源源单单抗抗的的恒恒定定区区。这这样样构构建建的的嵌嵌合合抗抗体体不不仅仅保保存存了了抗抗原原抗抗体体结结合合的的特特异异性性，又又大大大大降降低低了了鼠源单抗的免疫原性。鼠源单抗的免疫原性。人源化抗体人源化抗体 由由于于嵌嵌合合抗抗体体异异源源性性仍仍然然很很大大，因因此此需需要要对对鼠鼠源源抗抗体体进进行行人人源源化化改改造造，进进一一步步人人源源化化的的方方法法很很多多，主主要要是是重重构构抗体和外表重塑技术。抗体和外表重塑技术。 重重构构抗抗体体就就是是互互补补决决定定
4、区区(eomplementarity (eomplementarity determining determining regionregion，CDR)CDR)移移植植，将将鼠鼠抗抗体体的的CDRCDR移移植植到到人人抗抗体体的的相相应应部部位位。这这样样人人源源化化程程度度可可达达9090以以上上，目目前前该该方方法法是是人人源源化化单抗最常用、最根本的方单抗最常用、最根本的方 外外表表重重塑塑技技术术即即将将鼠鼠抗抗体体框框架架区区外外表表氨氨基基酸酸的的残残基基(surface (surface amino amino acid acid residuesresidues，SAR)SA
5、R)进进行行人人源源化化改改造造。该该方方法法是是仅仅替替换换与与人人抗抗体体SARSAR差差异异明明显显的的区区域域，在在维维持持抗抗体体活活性性并并兼兼顾顾减减少少异异源源性性根根底底上上选选用用与与人人抗抗体体外外表表残残基基相相似似的的氨氨基基酸酸替替换。换。 人源性抗体人源性抗体 虽然人源化抗体解决了鼠抗体的免疫原性等问题，但生产人源化抗体仍有很大的困难；人源化过程需大量繁复、昂贵的电脑模拟，需取代不同的氨基酸以恢复选择性和亲和力，工作量非常大，并且它总还含有少量鼠源性成分。完全的人源性抗体才是用于治疗的理想抗体， 目前它主要通过3种途径来研制：噬菌体抗体库技术、核糖体展示技术和转基
6、因小鼠制备人源性抗体。 域抗体域抗体抗体抗体-药物共轭体药物共轭体双特异性抗体双特异性抗体 Text三功能抗体三功能抗体 TextFc 片段工程抗体片段工程抗体 Text单克隆抗体药单克隆抗体药物领域物领域三、三、域抗体域抗体( domain antibodies( domain antibodies，DAbs)DAbs) 一直到 1989 年，所有的抗体被认为都是由两个重链和两条轻链组成，两条重链通过二硫键共价连接，重链由 1 个可变区VH 和 3 个恒定区 CH1 和 CH2 和 CH3 组成，轻链由一个可变区VL和恒定区组成CL，并且与重链的 CH1 区非共价连接。1989 年，一种新型
7、抗体首先在单峰骆驼的血清中被发现鉴定，后来在骆驼家族所有其他种群中都有发现。这种抗体不包含轻链，重链中不含有 CH1 区。直到今天，这种重链抗体 的进化优势都不是很清楚，然而仅由重链抗体的一个重链可变区组成的单域抗体，其广泛的适用性已经被迅速认可，由于其晶体结构直径 2.5 nm、长4 nm，因此又被称为纳米抗体。 新技术的应用促进了对这种抗体药物的理解，也发现了这种小分子抗体的很多优点： 具有高亲和性 能够识别普通抗体不能识别或不能接近的抗原 在严苛的环境下非常稳定 容易形成聚体形式 易表达 抗体抗体-药物共轭体药物共轭体( antibody drug-conjugates，ADCs) 它是
8、由一个合成接头共价连接一个单克它是由一个合成接头共价连接一个单克隆抗体与一个细胞毒类化学物质构成，这样隆抗体与一个细胞毒类化学物质构成，这样 ADC 就融合了单克隆抗体对肿瘤相关抗原的就融合了单克隆抗体对肿瘤相关抗原的高度特异性和小分子毒性物质对肿瘤相关抗高度特异性和小分子毒性物质对肿瘤相关抗原的毒性效应，加强毒性物质对肿瘤细胞攻原的毒性效应，加强毒性物质对肿瘤细胞攻击效率的同时，防止了化学疗法中毒性物质击效率的同时，防止了化学疗法中毒性物质对正常的组织细胞非特异性杀伤而引起的不对正常的组织细胞非特异性杀伤而引起的不良反响。良反响。 双特异性抗体双特异性抗体( bispecific antib
9、odies，BsAb) 简单来说，双特异性抗体就是可以与两个不同抗原靶点特异性结合的抗体融合体。u早期对 BsAb 的研究侧重于将一个特异性抗原与效应细胞连接起来，例如，一个 BsAb 既特异性地与肿瘤细胞上抗原结合，同时又与 T 细胞上 CD3 抗原或者 NK 细胞上的 CD16 抗原结合，这样 BsAb 交叉连接了肿瘤细胞与效应细胞，同时激活了效应细胞。u最近一个新概念的 BsAb 得到了人们的极大关注，它同时结合一种疾病相关的两个靶抗原，这样BsAb 可以与相同疾病发生途径中的不同靶点抗原结合，阻滞和中和作用都增强了，而且可以阻断单抗药物单一靶点疗法中出现的代偿现象。uBsAb 还可以与
10、同一个靶抗原的不同抗原决定簇结合，不仅使亲和力加强，而且加强了抗体依赖的效应作用如抗体依赖的细胞毒作用和 / 或补体依赖的细胞毒作用。三功能抗体三功能抗体( trifunctional antibodies，TriomAb) 三功能抗体除具有两个不同抗原结合位点，还具有完整的 Fc 片段，其两个抗原通常是 T 细胞上的CD3 和肿瘤细胞上的抗原，这使它成为双特异性单克隆抗体的一种。 Fc Fc 工程抗体工程抗体( Fc-engineered antibodies) 现在有两种改造 Fc 片段的方法: 基因改造和糖基化改造。基因改造主要是通过丙氨酸扫描、定向突变、基于结构的系统计算等分子工程学手
11、段改造编码 Fc 片段的DNA。糖基化改造通常是通过改造产生抗体的细胞系或者酵母来实现。A Human Monoclonal Antibody Targeting Scavenger Receptor Class B Type I Precludes Hepatitis C Virus Infection and Viral Spread InVitro and InVivo四、单克隆抗体的最新进展四、单克隆抗体的最新进展人类免疫缺陷病毒单克隆抗体在小麦胚乳中的表达 阻止丙型肝炎病毒在体外和体内感染的 一种新型的人类单克隆抗体研究背景： Endstage liver disease cause
12、d by chronic hepatitis C virus (HCV) infection is the leading indication for liver transplantation in the Western world. However, immediate reinfection of the grafted donor liver by circulating virus is inevitable and liver disease progresses much faster than the original disease. Standard antiviral
13、 therapy is not well tolerated and usually ineffective in liver transplant patients, whereas anti-HCV immunotherapy is hampered by the extreme genetic diversity of the virus and its ability to spread by way of cellcell contacts.对于肝移植患者，通常采用聚乙二醇化干扰素联合利巴韦林治疗，但是这种联合疗法耐受性不好而且并不是很有效，因此，新的防止再度感染药物的研发是必要的。
14、 丙型肝炎病毒(HCV)的特点：extreme genetic diversityhave ability to spread by way of cell-cell contacts 新合成的人类免疫球蛋白G4单克隆抗体(mAb)16-71的作用机制：mAb16-71 interferes with direct cell-to-cell transmission of HCV.结果说明： Using in vitro cell culture and human liver-chimeric mouse models,we show that a human mAb targeting t
15、he HCV coreceptor SR-BI completely prevents infection and intrahepatic spread of multiple HCV genotypes. 本研究的目的是利用基因枪介导法将抗体基因IgG转人小麦，获得转基因植株，并在分子水平上证实目的基因的整合、转录和表达。 植植物物表表达达载载体体的的构构建建。用EcoR V和Sac I酶切HC基因，回收约1 414 bp的目的片段。将回收的目的片段插入到植物表达载体pBarLYA克隆位点Sma I和Sac I之间，获得HC表达载体pBarLYAHC(图1)。LC基因经Sma I和Sac
16、I酶切，回收约723 bp的目的片段，并插入到载体pLYA克隆位点Sma I和Sac I之间，获得LC表达载体pLYA-LC(图1)。HC和LC基因均由燕麦球蛋白启动子AsGlo驱动。 提取小麦叶片DNA，用HC和LC基因特异引物进行多重PCR检测，在T。代抗性苗中，其中有3株为阳性，且同时扩增出497 bp和380 bp的目的带(图2一A)，说明IgG的HC和LC基因共整合到小麦基因组中。对T0代植株PCR鉴定说明，所有T0代植株均同时检测到HC和LC 2个基因。对T1代和T0代进行鉴定，所有转基因后代依然可以同时检测到HC和LC 2个基因，T2代局部植株的PCR扩增结果见图2一B。连续3代
17、的PCR鉴定结果说明，基因HC和LC是连锁的，而且能够稳定遗传。2)2)基因枪介导的转化及转基因植株的筛选基因枪介导的转化及转基因植株的筛选3)3)转基因植株的转基因植株的PCRPCR检测检测4)4)转基因植株的转基因植株的RT-PCRRT-PCR检测。检测。 T2代转基因小麦和未转化植株开花后21d时，分别提取幼嫩籽粒RNA，用IgG的重链和轻链特异引物进行RT-PCR扩增。如图3所示，选取的6株转基因植株均可扩增出预期大小的目的带，而未转化对照中没有目的带，说明转基因株系的基因组中不仅整合了目的基因，而且能在胚乳中形成正常的转录本。 5)IgG5)IgG蛋白的蛋白的ELISAELISA检测
18、。检测。 于开花后21d时，取T3代转基因株系和未转化植株幼嫩籽粒，提取总蛋白进行ELISA检测。结果说明，转基因株系蛋白提取液的D值与阴性对照相比差异显著(图4)。用IgG重链作为抗体检测时，样品的D值是对照的36倍；IgG轻链作为抗体检测时，样品的D值是对照的25倍，说明种子中IgG蛋白重链和轻链表达积累量均较高。讨论：讨论： 本本研研究究利利用用基基因因枪枪共共转转化化法法将将单单克克隆隆抗抗体体IgGIgG的的重重链链和和轻轻链链基基因因同同时时导导人人小小麦麦基基因因组组。T T。代代共共得得到到3 3株株转转基基因因植植株株，并并同同时时含含有有IgGIgG重重链链和和轻轻链链。连
19、连续续3 3代代的的PCRPCR检检测测结结果果说说明明，HCHC和和LCLC基基因因是是连连锁锁的的，而而且且能能够够稳稳定定遗遗传传，说说明明目目的的基基因因已已经经整整合合到到小小麦麦基基因因组组中中。为为检检测测IgGIgG在在小小麦麦颖颖果果中中的的表表达达情情况况，取取开开花花后后21 21 d d的的幼幼嫩嫩籽籽粒粒提提取取RNARNA，进进行行RTPCRRTPCR鉴鉴定定，在在随随机机选选取取的的几几个个样样品品中中都都可可以以检检测测到到信信号号，说说明明工工gGgG基基因因在在小小麦麦胚胚乳乳中中能能正正常常转转录录。ELISAELISA结结果果进进一一步步证证实实小小麦麦
20、胚胚乳乳中中能产生正常的能产生正常的IgGIgG分子。分子。 RademacherRademacher等等在在玉玉米米胚胚乳乳中中表表达达了了重重组组抗抗体体2G122G12，此此抗抗体体具具有有HIVHIV中中和和活活性性，而而且且并并不不低低于于仓仓鼠鼠卵卵巢巢细细胞胞来来源源的的抗抗体体，在在烟烟草草中中也也曾曾表表达达过过HIVHIV有有抑抑制制作作用用的的抗抗体体，但但烟烟草草中中含含有有对对人人体体有有害害的的物物质质，玉玉米米虽虽是是主主要粮食作物之一，但不及小麦应用广泛。要粮食作物之一，但不及小麦应用广泛。 小小麦麦是是人人类类多多种种食食物物的的原原材材料料，将将小小麦麦种种子子作作为为生生产产IgGIgG的的工工厂厂，既既经经济济又又平平安安，而而且且直直接接口口服服转转基基因因种子磨成的面粉，机体的抗性要高于纯化的抗体。种子磨成的面粉，机体的抗性要高于纯化的抗体。 本本研研究究在在小小麦麦胚胚乳乳中中成成功功表表达达了了抗抗体体蛋蛋白白IgGIgG，小小麦麦种种子子数数量量多多，贮贮存存方方便便，而而且且蛋蛋白白质质贮贮存存在在种种子子中中不不影影响响其其活活性性，为为以以后后大大量量纯纯化化抗抗体体用用于于动动物物免免疫疫研究并用于生产奠定了根底。研究并用于生产奠定了根底。
