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1、真核细胞真核细胞RNA的提取及电泳分析的提取及电泳分析 中南大学中南大学1实验目的实验目的实验目的实验目的q掌握一种真核细胞掌握一种真核细胞RNARNA的提取方法的提取方法 q熟悉熟悉RNARNA的琼脂糖凝胶电泳检测分析的琼脂糖凝胶电泳检测分析 2实验原理实验原理实验原理实验原理qrRNA,8085%qtRNA,1015%，约，约5S/70-120nt qmRNA,15% ，长短不一，长短不一28S，4700 nt18S，1900 nt5.8S，160 nt5S，120 nt哺乳动物细胞总哺乳动物细胞总RNA:真核细胞真核细胞RNA分布于胞质分布于胞质75%、胞核、胞核10%、细胞器、细胞器1
2、5% 3实验原理实验原理实验原理实验原理qTrizolTrizol试剂是由试剂是由苯酚苯酚和和异硫氰酸胍异硫氰酸胍等组成的单相、快速抽提总等组成的单相、快速抽提总RNARNA的试剂。的试剂。q十二烷基肌氨酸钠：十二烷基肌氨酸钠：破细胞膜及核膜，释放破细胞膜及核膜，释放RNARNA、DNADNA和蛋白。和蛋白。q异硫氰酸胍：异硫氰酸胍：RNase RNase 抑制剂，抑制内源性抑制剂，抑制内源性RNaseRNase。q苯酚：苯酚：使蛋白变性。使蛋白变性。4实验原理实验原理实验原理实验原理q当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，离心后形当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，离心后形 成水相层和有机相层。成
3、水相层和有机相层。RNARNA位于水相，位于水相，而而DNADNA和蛋白质位于分界层和有机相。和蛋白质位于分界层和有机相。q水相中水相中RNARNA在高盐和有机溶剂共存时沉淀分离。在高盐和有机溶剂共存时沉淀分离。 q提取的提取的RNARNA可用于可用于NorthernNorthern杂交、杂交、mRNAmRNA分离、分离、cDNAcDNA合成、合成、RT-PCRRT-PCR。5实验试剂实验试剂实验试剂实验试剂qRNAiso BloodRNAiso Bloodq氯仿氯仿q异丙醇异丙醇q75%75%乙醇（乙醇（DEPCDEPC处理水配制）处理水配制）qRNase-freeRNase-free水水6
4、微量移液器微量移液器台式微量离心机台式微量离心机 电泳槽电泳槽凝胶成像系统凝胶成像系统主要仪器主要仪器主要仪器主要仪器 电泳仪电泳仪 7实验步骤实验步骤实验步骤实验步骤1.取取0.25 ml血液样品移至离心管中，添加血液样品移至离心管中，添加 0.75 ml RNAiso Blood。2.用移液枪上下反复吸打直至细胞完全裂解。用移液枪上下反复吸打直至细胞完全裂解。3.加入加入 0.2 ml氯仿，混匀至溶液呈乳白色。氯仿，混匀至溶液呈乳白色。4. 室温静置室温静置 5 分钟。分钟。5. 12,000g、4离心离心 15 分钟。分钟。6. 吸取上清液移至新的离心管中（切勿吸出白色中间层）。吸取上清
5、液移至新的离心管中（切勿吸出白色中间层）。7. 向上清中加入等量体积的异丙醇，上下颠倒混匀后，室温下静置向上清中加入等量体积的异丙醇，上下颠倒混匀后，室温下静置 10 分钟。分钟。8.12,000g、4离心离心 10 分钟，试管底部会出现分钟，试管底部会出现 RNA 沉淀。沉淀。9.弃上清弃上清,加入等量的加入等量的 75乙醇，振荡清洗沉淀后，乙醇，振荡清洗沉淀后，7,500g、4离心离心 5 分钟，弃上清。分钟，弃上清。10.室温干燥沉淀室温干燥沉淀23分钟，加入分钟，加入30 l RNase-free 水溶解沉淀。水溶解沉淀。11.取取5 l电泳检测，剩余电泳检测，剩余-70保存。保存。8
6、注意事项注意事项注意事项注意事项RNaseRNase（核糖核酸内切酶）生物特性十分稳定，耐热、耐酸、耐碱，作用不需辅助因子，（核糖核酸内切酶）生物特性十分稳定，耐热、耐酸、耐碱，作用不需辅助因子，存在十分广泛，本实验的关键是创造一个无存在十分广泛，本实验的关键是创造一个无RNaseRNase的环境，减少的环境，减少RNARNA的降解。的降解。 9注意事项注意事项注意事项注意事项q去去除外源性除外源性RNase的污染，包括操作者、工作环境、试剂及耗材等环节的污染，包括操作者、工作环境、试剂及耗材等环节 戴口罩和手套，少少说话；戴口罩和手套，少少说话； 工作台面洁净，可用工作台面洁净，可用3%H2
7、O2擦洗，空气中无灰尘；擦洗，空气中无灰尘； 离心管、离心管、Tip等塑料品用等塑料品用0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液浸泡（焦碳酸二乙酯）水溶液浸泡12h，后高温高压灭菌处理；，后高温高压灭菌处理； 玻璃或陶瓷制品可玻璃或陶瓷制品可180250干烤干烤84h; RNA溶解水溶液用溶解水溶液用DEPC处理过，后高温高压灭菌使用（处理过，后高温高压灭菌使用（DEPC分解成分解成CO2和和H2O）q抑制内源性抑制内源性RNase的活性的活性 细胞裂解后细胞裂解后RNase随之释放，应及时加入其抑制剂，如异硫氰酸胍。随之释放，应及时加入其抑制剂，如异硫氰酸胍。10注意事项注意事项注意事项注意事
8、项qRNase活性抑制：物理法（高温），化学法（活性抑制：物理法（高温），化学法（DEPC、VRC【氧钒核糖核苷复合物氧钒核糖核苷复合物】、H2O2），），生物法（生物法（RNasin）。）。q不同组织样品的预处理（如组织块、贴壁细胞）不同组织样品的预处理（如组织块、贴壁细胞）每每10 510 7细胞可提取细胞可提取50100ugRNA。样品体积不要超过裂解液的。样品体积不要超过裂解液的10%。q样品保存：样品用样品保存：样品用Trizol打散后于打散后于-70可保存一个月以上。分离的可保存一个月以上。分离的RNA最好尽快反转录成最好尽快反转录成cDNA等，保存在等，保存在75%乙醇中于乙醇中
9、于28一周，一周，-20一年。一年。11结果分析结果分析结果分析结果分析电泳后应该是有电泳后应该是有3条主带，尤其是条主带，尤其是28S和和18S两条带锐利清晰且亮度比约两条带锐利清晰且亮度比约2:1，无，无DNA杂杂带及向前拖尾现象（无降解）。带及向前拖尾现象（无降解）。纯品纯品RNA和和DNA的的OD260/OD280（R）应为）应为2. 0和和1.8，所以提取，所以提取RNA的的R值应保证在值应保证在1.82.0，R2.2表示有降解。表示有降解。Tris水溶解水溶解RNA应保证应保证2.0R2.2。-70和和-20保存无明显差异，否则为内源性保存无明显差异，否则为内源性RNase污染。污
10、染。12问题及解决方法问题及解决方法问题及解决方法问题及解决方法 抽提产量较低抽提产量较低 1.样品裂解不完全减少样品、延长裂解时间或加大提取液；样品裂解不完全减少样品、延长裂解时间或加大提取液；2.RNA未完全溶解，会带来未完全溶解，会带来OD比值过低延长溶解时间且比值过低延长溶解时间且RNA不可过分干燥；不可过分干燥；3.实验材料质量不佳新鲜样品或生长旺盛细胞；实验材料质量不佳新鲜样品或生长旺盛细胞；4.离心不够充分加大转速及延长时间。离心不够充分加大转速及延长时间。13问题及解决方法问题及解决方法问题及解决方法问题及解决方法 RNA有降解有降解1.样品不新鲜或提取过程时间有延误组织样边研
11、磨边加入液氮；样品不新鲜或提取过程时间有延误组织样边研磨边加入液氮；2.RNA 存放不够低温存放不够低温-70；3.提取液加入不足，内源提取液加入不足，内源RNase没被充分抑制减少样品或加大提取液；没被充分抑制减少样品或加大提取液；4.外源外源RNase没被充分抑制所用试剂与耗材要有防止没被充分抑制所用试剂与耗材要有防止RNase处理。处理。14问题及解决方法问题及解决方法问题及解决方法问题及解决方法 有有DNA污染污染1.样品裂解不完全，会带入蛋白污染；样品裂解不完全，会带入蛋白污染；2.取上清时取道中间层，会带入蛋白污染；取上清时取道中间层，会带入蛋白污染；3.加入氯仿震荡过于剧烈。加入氯仿震荡过于剧烈。15谢 谢！16
