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1、 流式细胞术流式细胞术(flow cytometry FCM)(flow cytometry FCM)是利用流式细是利用流式细胞仪对单个生物颗粒胞仪对单个生物颗粒( (红细胞、白细胞、各类组织细红细胞、白细胞、各类组织细胞、血小板、微生物等胞、血小板、微生物等) )以及人工合成以及人工合成(rn n h (rn n h chn)chn)微球的物理和生物学特性进行多参数定量分微球的物理和生物学特性进行多参数定量分析，并能对特定细胞群体加以分选的分析技术。析，并能对特定细胞群体加以分选的分析技术。流式细胞术的概念(ginin)第1页/共45页第一页，共46页。FCM的工作(gngzu)原理流式细胞
2、仪组成(zchn)：1.液流系统2.光学系统3.数据处理系统第2页/共45页第二页，共46页。1.液流系统：由样本和鞘液组成。液流系统：由样本和鞘液组成。待测细胞被制备成单个细胞的悬液，经荧光染待测细胞被制备成单个细胞的悬液，经荧光染料标记的料标记的McAb染色后置入样品管中，在清洁染色后置入样品管中，在清洁气体压力下进入气体压力下进入(jnr)流动室形成样本流。在流动室形成样本流。在鞘液鞘液 (sheath)的约束下，通过喷嘴，使其形的约束下，通过喷嘴，使其形成单细胞液柱。成单细胞液柱。第3页/共45页第三页，共46页。Flow CellInjector TipFluorescenceFlu
3、orescencesignalssignalsFocused laserFocused laserbeambeamSheath fluid第4页/共45页第四页，共46页。鞘液：辅助(fzh)样本流能被正常检测的基质液作用：1.包裹在样本流的周围，使其处于喷嘴中心，以保证检测的精确性；2.防止样本流中的细胞靠近喷孔壁而堵塞喷孔。第5页/共45页第五页，共46页。2.光学系统：由激发光源、分光镜、光束成形器等组成。激光(jgung)是较常用的光源,稳定性好、单色性好。检测信号：散射光和荧光信号被收集、处理、转化为数字信号。第6页/共45页第六页，共46页。Injector TipFluoresc
4、enceFluorescencesignalssignalsFocused laserFocused laserbeambeamSheath fluid第7页/共45页第七页，共46页。FCM检测(jinc)信号散射光信号前向散射光（fowordscatter,FS）：在激光束正前方的检测器，用于检测细胞或其他粒子物体的表面属性，如大小、形状等。反映细胞颗粒的大小。侧向散射光（sidescatter，SS）：与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器，主要用于检测细胞内部结构属性，可获得细胞内超微结构和颗粒性质的参数(cnsh)。反映颗粒的内部结构复杂程度、表面的光滑程度。荧光信号(反映被染上荧光的
5、细胞数量多少）第8页/共45页第八页，共46页。第9页/共45页第九页，共46页。第10页/共45页第十页，共46页。第11页/共45页第十一页，共46页。第12页/共45页第十二页，共46页。荧光(ynggung)信号每种荧光染料都有特定的激发波长(bchng)，受激光激发后会产生特定波长(bchng)的荧光和颜色，如绿色、红色、黄色等。流式细胞仪就是利用不同波长(bchng)的光学滤片来检测这些特定发射波长(bchng)的光学信号。荧光信号反映被染上荧光的细胞数量多少。第13页/共45页第十三页，共46页。第14页/共45页第十四页，共46页。3.数据处理系统：主要由计算机及其软件组成。通
6、过检测散射光及荧光信号对实验数据进行分析(fnx)存储、显示。具有智能化、自动化特点。第15页/共45页第十五页，共46页。第16页/共45页第十六页，共46页。免疫荧光标记(bioj)直接免疫荧光染色法：选用荧光标记的McAb是直接针对细胞表面抗原特异性标志的单一(dny)抗体,如抗CD3-FITC抗体、抗CD4-PE抗体、抗CD8-PeCy5抗体。间接免疫荧光染色法：选用特异性McAb与相应抗原结合后，再用荧光素标记的第二抗体进行染色。双标记或多标记分析：目前使用的流式细胞仪能用一个激光束激发检测三色甚至四色荧光信号。检测时需注意荧光补偿。第17页/共45页第十七页，共46页。常用免疫荧光
7、染料(rnlio)组合第18页/共45页第十八页，共46页。第19页/共45页第十九页，共46页。荧光补偿：每两种荧光信号间不可避免会出现重叠现象，重叠区越大，信号检测的准确性就越差，因此需计算机工作软件进行自动(zdng)跟踪调节补偿。第20页/共45页第二十页，共46页。 流式细胞仪的基本功能流式细胞仪的基本功能细胞表型分析细胞表型分析(包括细胞膜、胞浆内蛋白表达及核膜成份包括细胞膜、胞浆内蛋白表达及核膜成份(chng fn)分析分析DNA含量及细胞周期分析：含量及细胞周期分析：DNA content analysis，如，如细胞凋亡检测细胞凋亡检测细胞分选细胞分选 cell sortin
8、g自身免疫性疾病相关自身免疫性疾病相关HLA抗原分析、自身抗体的检测：抗原分析、自身抗体的检测：如用如用Hep-2细胞检测抗核抗体。细胞检测抗核抗体。第21页/共45页第二十一页，共46页。 临临临临床床床床(ln (ln (ln (ln chun)chun)chun)chun)免疫学免疫学免疫学免疫学 临临临临床床床床(ln (ln (ln (ln chun)chun)chun)chun)血液学血液学血液学血液学 临临临临床床床床(ln (ln (ln (ln chun)chun)chun)chun)肿瘤学肿瘤学肿瘤学肿瘤学 血栓与止血血栓与止血血栓与止血血栓与止血 骨髓和器官移植骨髓和器官
9、移植骨髓和器官移植骨髓和器官移植 基础医学研究基础医学研究基础医学研究基础医学研究流式细胞术的临床(ln chun)应用第22页/共45页第二十二页，共46页。 FCM FCM在临床在临床(ln chun)(ln chun)免疫学中的应用免疫学中的应用(1) (1) 淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析 T T细胞：细胞： CD3+ CD3+ CD4+ (Th) CD4+ (Th) CD8+ CD8+ (Ts/Tc)(Ts/Tc) B B细胞：细胞： CD19+ CD19+ NK NK细胞：细胞： CD3- CD16+ CD56+ CD3- CD16+ CD56+第23页/共45页第二十三页，共4
10、6页。(2) 淋巴细胞淋巴细胞(xbo)亚群细分亚群细分 T细胞细胞(xbo)：Ts：CD8+ CD28- Tc：CD8+ CD28+ Th：CD4+ CD29+ B细胞细胞(xbo)：B1：CD5+ CD19- B2：CD5 + CD19+第24页/共45页第二十四页，共46页。根据根据T T淋巴细胞分泌细胞因子的不同淋巴细胞分泌细胞因子的不同(b tn)(b tn)还可将还可将CD4+CD4+、CD8+CD8+分为分为 CD4+: CD4+: Th1: CD4+ IFN-r+ Th1: CD4+ IFN-r+ Th2: CD4+ IL4+ Th2: CD4+ IL4+ Th0: CD4+
11、IFN-r+ Th0: CD4+ IFN-r+ IL4+IL4+ CD8+: CD8+: Tc1: CD8+ IFN-r+ Tc1: CD8+ IFN-r+ Tc2: CD8+ IL4+ Tc2: CD8+ IL4+ Tc0: CD8+ IFN-r+ Tc0: CD8+ IFN-r+ IL4+IL4+第25页/共45页第二十五页，共46页。辅助性辅助性T T细胞亚群的生物学功能及临床意义细胞亚群的生物学功能及临床意义Th1Th1细胞：介导细胞免疫、细胞毒性细胞：介导细胞免疫、细胞毒性T T细胞的生长和活化、细胞的生长和活化、巨噬细胞的活化、介导迟发型过敏反应。其功能亢进将导巨噬细胞的活化、介导
12、迟发型过敏反应。其功能亢进将导致炎症慢性迁延，器官特异性自身免疫病，急性排异反应致炎症慢性迁延，器官特异性自身免疫病，急性排异反应和接触性皮炎等的发病和免疫病理损伤。和接触性皮炎等的发病和免疫病理损伤。Th2Th2细胞细胞 ：介导体液免疫，促进：介导体液免疫，促进B B细胞的生长、活化和分细胞的生长、活化和分化，是化，是IgG1IgG1和和IgEIgE类抗体类抗体(kngt)(kngt)的转换因子，其功能亢的转换因子，其功能亢进将导致特异性过敏反应，参与高进将导致特异性过敏反应，参与高IgEIgE综合症和嗜酸性粒综合症和嗜酸性粒细胞增多症。细胞增多症。第26页/共45页第二十六页，共46页。(
13、3) 活化淋巴细胞亚群活化淋巴细胞亚群 活化总活化总T细胞：细胞： CD3+ /HLADR+ 静止总静止总T细胞：细胞： CD3+ /HLADR- 活化活化CD4+细胞：细胞：CD4+ /HLADR+ 活化活化CD8+细胞：细胞：CD8+ /HLADR+ 活化诱导活化诱导(yudo)分子：分子： CD69 白细胞介素白细胞介素2低亲和力受体：低亲和力受体： CD25 CD25+ /CD3+：活化：活化T细胞细胞 CD25- /CD3+：静止：静止T细胞细胞第27页/共45页第二十七页，共46页。(4) (4) (4) (4) 淋淋淋淋巴巴巴巴细细细细胞胞胞胞功功功功能能能能分分分分析析析析：细
14、细细细胞胞胞胞介介介介导导导导细细细细胞胞胞胞毒毒毒毒试试试试验验验验、细细细细胞内细胞因子的测定胞内细胞因子的测定胞内细胞因子的测定胞内细胞因子的测定 自身免疫性疾病自身免疫性疾病自身免疫性疾病自身免疫性疾病 变态反应变态反应变态反应变态反应(bin ti fn yng)(bin ti fn yng)(bin ti fn yng)(bin ti fn yng)性疾病性疾病性疾病性疾病 免疫缺陷性疾病免疫缺陷性疾病免疫缺陷性疾病免疫缺陷性疾病 感染性疾病感染性疾病感染性疾病感染性疾病( ( ( (病毒、细菌、寄生虫感染病毒、细菌、寄生虫感染病毒、细菌、寄生虫感染病毒、细菌、寄生虫感染) ) )
15、 ) 免疫治疗监测免疫治疗监测免疫治疗监测免疫治疗监测 肿瘤免疫监测肿瘤免疫监测肿瘤免疫监测肿瘤免疫监测 移植免疫监测移植免疫监测移植免疫监测移植免疫监测第28页/共45页第二十八页，共46页。( ( ( (二二二二) FCM) FCM) FCM) FCM在临床血液学中的应用在临床血液学中的应用在临床血液学中的应用在临床血液学中的应用1.1.1.1.白血病的白血病的白血病的白血病的MICMICMICMIC分型分型分型分型 Morphology Morphology Morphology Morphology（形态学）（形态学）（形态学）（形态学） Immunology Immunology I
16、mmunology Immunology（免疫学）（免疫学）（免疫学）（免疫学） Cytogenetics Cytogenetics Cytogenetics Cytogenetics（细胞遗传学）（细胞遗传学）（细胞遗传学）（细胞遗传学） 白血病分型是选择化疗方案和判断预后的重白血病分型是选择化疗方案和判断预后的重白血病分型是选择化疗方案和判断预后的重白血病分型是选择化疗方案和判断预后的重要要要要(zhngyo)(zhngyo)(zhngyo)(zhngyo)依据。白血病免疫分型是依据。白血病免疫分型是依据。白血病免疫分型是依据。白血病免疫分型是MICMICMICMIC分型分型分型分型的重要
17、的重要的重要的重要(zhngyo)(zhngyo)(zhngyo)(zhngyo)组成部分，也是对组成部分，也是对组成部分，也是对组成部分，也是对FABFABFABFAB分型的分型的分型的分型的补充，对白血病的诊断、治疗策略制定、预后判补充，对白血病的诊断、治疗策略制定、预后判补充，对白血病的诊断、治疗策略制定、预后判补充，对白血病的诊断、治疗策略制定、预后判断及对白血病发病机制的研究都具有重要断及对白血病发病机制的研究都具有重要断及对白血病发病机制的研究都具有重要断及对白血病发病机制的研究都具有重要(zhngyo)(zhngyo)(zhngyo)(zhngyo)作用。作用。作用。作用。第29
18、页/共45页第二十九页，共46页。免疫(miny)分型的临床意义 弥补FAB分型的不足 诊断其他血液(xuy)系统肿瘤 诊断仅表达个别非本系列相关抗原的急性 白血病（LY+AML、MY+ALL） 急性双系或双表型白血病的诊断 骨髓增生异常综合征（MDS）免疫表型分析的临床意义 免疫分型对鉴别慢性淋巴细胞增生性疾病各亚型亦有肯定的诊断价值第30页/共45页第三十页，共46页。以下为各系列以下为各系列(xli)较特别的标志：较特别的标志： AML： MPO、 CD33、 CDl3、 CDl4 CDl5、 CDllb、 CDllc T-ALL： cmCD3、 CD2、 CD5、 CD7、 CD4CD
19、8、 CD38 B-ALL： cCD22、cCD79、 CDl9、 CDl0、 CD24、 HLADR、 CD20、 CD38 造造血血干干祖祖细细胞胞: CD34、 CDll7、 CD38、 HLA-DR、 ACl33第31页/共45页第三十一页，共46页。在在AMLAML各亚型的免疫各亚型的免疫(miny)(miny)分型中有时仍较难分辨，有分型中有时仍较难分辨，有以下特点可供参考：以下特点可供参考： CD41 CD41、CD61CD61是巨核细胞的标志，见于是巨核细胞的标志，见于FABM7FABM7，但，但 血小板粘附于某细胞上可造成假阳性。血小板粘附于某细胞上可造成假阳性。 CD71
20、CD71与血型糖蛋白是红系的标志，见于与血型糖蛋白是红系的标志，见于FABM6FABM6型。型。 CDl4 CDl4、 CD64 CD64是单核细胞的标志，见于是单核细胞的标志，见于M4M4或或M5M5。 FABM3 FABM3，t(15t(15；17)17)者典型的免疫者典型的免疫(miny)(miny)表型是表型是CDl3+CDl3+、 CD33+ CD33+、 CD9+ CD9+、 CD38+ CD38+、 CD34- CD34-、 DR- DR-。 t(8 t(8；21)M221)M2的表型为的表型为 CDl3+ CDl3+、 DR+ DR+、 CD34+ CD34+、 CD33+CD
21、33+、 CDl5+ CDl5+、 CDl9+ CDl9+或或CD56+CD56+。 M0 M0与与M1M1较难区分，应有髓系标志而无淋系标志，胞较难区分，应有髓系标志而无淋系标志，胞浆浆MPOMPO应阴性。应阴性。 CD34 CD34及及DRDR在在M0M0较强，并可伴有较强，并可伴有CD7CD7与与CD4CD4。第32页/共45页第三十二页，共46页。 CDll7+多见于AML。 CD7常与CD34共表达， CD4见于M4、M5。 CD2+见于M4Eo，往往伴有16号染色体异常。 M3亦可有 CD56+表达。正常粒细跑可表达 CDl0。由此可见，单抗本身(bnshn)有其多向性，勿轻易判断
22、为杂合型白血病。 TBALL可分为几个亚型，然而对临床价值不大。但若BALL伴有CD34表达时，应进一步作遗传学与基因检测，以确定是否是Ph+ALL，不论是Mbcl/abl或m-bcrablmRNA阳性者，其预后均较差，应接受大剂量化疗或早期接受异基因骨髓移植。第33页/共45页第三十三页，共46页。FCMFCM检检测测白白血血病病微微小小(wixio)(wixio)残残留留病病变变(MRD):(MRD): 过过去去认认为为 FCMFCM测测定定残残存存白白血血病病细细胞胞不不可可靠靠，因因为为现现用用的的 McAbMcAb不不能能鉴鉴别别正正常常血血细细胞胞与与白白血血病病细细胞胞。虽虽然然
23、至至今今尚尚未未发发现现白白血血病病细细胞胞特特异异抗抗原原，但但近近来来有有人人提提出出根根据据白白血血病病细细胞胞的的以以下下特特征征， FCMFCM检检测测的的敏敏感感度度可可明明显显提提高高第34页/共45页第三十四页，共46页。白血病细胞的某些抗原表达量明显高于相应白血病细胞的某些抗原表达量明显高于相应(xingyng)的正常血细胞的正常血细胞 如小儿如小儿ALL，其，其CDl0+细胞的荧光强度可细胞的荧光强度可高达高达3-4个对数值，而其个对数值，而其 CD45则为弱阳性或则为弱阳性或阴性。阴性。相应相应(xingyng)正常细胞正常细胞 CDl0+的细胞荧的细胞荧光强度约为光强度
24、约为2个对数值，个对数值， CD45为阳性。若能为阳性。若能定量则更可靠。定量则更可靠。第35页/共45页第三十五页，共46页。 FCM FCM FCM FCM在临床肿瘤在临床肿瘤在临床肿瘤在临床肿瘤(zhngli)(zhngli)(zhngli)(zhngli)学中的应用学中的应用学中的应用学中的应用1.1.1.1.血液标本的检查血液标本的检查血液标本的检查血液标本的检查 肿瘤肿瘤肿瘤肿瘤(zhngli)(zhngli)(zhngli)(zhngli)患者的免疫功能检查患者的免疫功能检查患者的免疫功能检查患者的免疫功能检查 肿瘤肿瘤肿瘤肿瘤(zhngli)(zhngli)(zhngli)(z
25、hngli)患者的粘附分子检查患者的粘附分子检查患者的粘附分子检查患者的粘附分子检查ICAM-1 CD54ICAM-1 CD54ICAM-1 CD54ICAM-1 CD54ICAM-2 CD102ICAM-2 CD102ICAM-2 CD102ICAM-2 CD102ICAM-3 CD106ICAM-3 CD106ICAM-3 CD106ICAM-3 CD106CD62CD62CD62CD62、CD63CD63CD63CD63、CD42a/bCD42a/bCD42a/bCD42a/b、CD41/61CD41/61CD41/61CD41/61、TSPTSPTSPTSP第36页/共45页第三十六页
26、，共46页。(2) (2) (2) (2) 肿瘤实体标本的肿瘤实体标本的肿瘤实体标本的肿瘤实体标本的FCMFCMFCMFCM检查检查检查检查(jinch)(jinch)(jinch)(jinch) 耐药基因检查耐药基因检查耐药基因检查耐药基因检查(jinch)(jinch)(jinch)(jinch) 粘附分子检查粘附分子检查粘附分子检查粘附分子检查(jinch)(jinch)(jinch)(jinch) 细胞凋亡检查细胞凋亡检查细胞凋亡检查细胞凋亡检查(jinch)(jinch)(jinch)(jinch) 细胞细胞细胞细胞DNADNADNADNA分析分析分析分析 增殖性核抗原增殖性核抗原增
27、殖性核抗原增殖性核抗原 肿瘤细胞耐药性筛选肿瘤细胞耐药性筛选肿瘤细胞耐药性筛选肿瘤细胞耐药性筛选 肿瘤相关抗原肿瘤相关抗原肿瘤相关抗原肿瘤相关抗原 激素受体激素受体激素受体激素受体 与癌细胞生物行为有关的因子，如与癌细胞生物行为有关的因子，如与癌细胞生物行为有关的因子，如与癌细胞生物行为有关的因子，如CD44CD44CD44CD44第37页/共45页第三十七页，共46页。组织标本的正确处理：组织标本的正确处理： 去除脂肪去除脂肪(zhfng)、结缔组织、结缔组织 洗涤除去红细胞洗涤除去红细胞 用眼科剪剪成肉糜状用眼科剪剪成肉糜状 用用250至至350目的铜网过滤目的铜网过滤要求：要求： 细胞碎
28、片、细胞连片少，单细胞要细胞碎片、细胞连片少，单细胞要多多第38页/共45页第三十八页，共46页。 利利利利用用用用特特特特殊殊殊殊的的的的荧荧荧荧光光光光染染染染料料料料(PI(PI(PI(PI、EBEBEBEB、AOAOAOAO等等等等) ) ) ) 与与与与细细细细胞胞胞胞内内内内DNADNADNADNA碱碱碱碱基基基基结结结结合合合合，被被被被这这这这些些些些荧荧荧荧光光光光染染染染料料料料染染染染色色色色的的的的细细细细胞胞胞胞在在在在激激激激光光光光照照照照射射射射(zhosh)(zhosh)(zhosh)(zhosh)下下下下发发发发射射射射出出出出荧荧荧荧光光光光，荧荧荧荧光光
29、光光强强强强度度度度与与与与DNADNADNADNA含含含含量量量量成成成成正正正正比比比比。流流流流式式式式细细细细胞胞胞胞仪仪仪仪通通通通过过过过测测测测定定定定细胞的荧光强度推算出细胞的细胞的荧光强度推算出细胞的细胞的荧光强度推算出细胞的细胞的荧光强度推算出细胞的DNADNADNADNA含量。含量。含量。含量。细胞(xbo)DNA分析原理第39页/共45页第三十九页，共46页。细胞周期与DNA的倍体关系(gun x)第40页/共45页第四十页，共46页。DNA非2倍体出现是鉴别良性与恶性肿瘤的特异性指标: 良性肿瘤和正常组织良性增生不出现DNA非2倍体细胞而恶性肿瘤常可出现异倍体细胞；实
30、体瘤以多倍体居多；实体恶性肿瘤的非2倍体出现率70%,淋巴瘤和白血病以亚二倍体居多,出现率达50%。交界性肿瘤形态学介于良恶性之间,难于(nny)监别。如果交界性肿瘤出现异倍体即已具有恶性特征,尽管病理形态学尚不能证实,也应视为恶性。第41页/共45页第四十一页，共46页。观察病情演变观察病情演变判断预后判断预后 非整倍体的肿瘤恶性程度高，复发率高，预后差。非整倍体的肿瘤恶性程度高，复发率高，预后差。近二倍体和二倍体肿瘤近二倍体和二倍体肿瘤 : : 预后好。预后好。 但少数肿瘤的但少数肿瘤的DNADNA分析对预后无判断价值。分析对预后无判断价值。S S期期细细胞胞比比例例的的评评估估对对肿肿瘤
31、瘤恶恶性性程程度度和和预预后后有有意意义义(yy),(yy),高高S S期肿瘤一般比低期肿瘤一般比低S S期对化疗敏感。期对化疗敏感。第42页/共45页第四十二页，共46页。DNA的倍体和DNA指数(zhsh)的关系DI=DI=样品样品样品样品G G G G0/10/10/10/1细胞峰均道值细胞峰均道值细胞峰均道值细胞峰均道值正常二倍体标准细胞正常二倍体标准细胞正常二倍体标准细胞正常二倍体标准细胞G G G G0/10/10/10/1期细胞均道值期细胞均道值期细胞均道值期细胞均道值第43页/共45页第四十三页，共46页。 辅辅助助诊诊断断(zhndun)肿瘤肿瘤 估计肿瘤的预后估计肿瘤的预后
32、 监测疗效监测疗效细胞(xbo)DNA分析的临床意义第44页/共45页第四十四页，共46页。感谢您的观看(gunkn)！第45页/共45页第四十五页，共46页。内容(nirng)总结流式细胞术(flow cytometry FCM)是利用流式细胞仪对单个生物颗粒(kl)(红细胞、白细胞、各类组织细胞、血小板、微生物等)以及人工合成微球的物理和生物学特性进行多参数定量分析，并能对特定细胞群体加以分选的分析技术。激光是较常用的光源, 稳定性好、单色性好。荧光信号反映被染上荧光的细胞数量多少。双标记或多标记分析：目前使用的流式细胞仪能用一个激光束激发检测三色甚至四色荧光信号。感谢您的观看第四十六页，共46页。
