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1、第三节 基因突变与诱变育种8.3.1 基因突变类型和遗传效应8.3.2 基因的自发突变机制8.3.3 基因的诱发突变机制8.3.4 突变型菌株及应用8.3.5 诱变育种技术28.3.1 基因突变类型和遗传效应l染色体的畸变： DNA复制时出错，使子代DNA上大段碱基序列缺失、重复、倒位，通常导致细胞死亡；l染色体的突变： DNA复制时出错，使子代DNA上少数碱基序列出现缺失、添加、置换；l基因突变（gene mutation）：突变出现在基因序列内，影响了基因编码产物的功能，或者基因的表达特性，并产生遗传效应；l点突变：仅在一个碱基位点发生的基因突变，是常见的基因突变；3基因突变的类型l碱基的
2、置换：转换：一种嘌呤（嘧啶）变为另一种嘌呤（嘧啶）；颠换：嘌呤变为嘧啶，或嘧啶变为嘌呤；l碱基数量的突变：分为缺失和添加，如果发生在编码序列中，称为移码突变；4非编码序列基因突变的遗传效应l基因的表达元件发生基因突变，可能优化表达元件，也可能损伤表达元件，而影响基因的表达水平；l基因的调控元件发生基因突变，一般破坏其固有的表达调控机制，例如：由诱导型表达变为组成型表达；5编码序列基因突变的遗传效应l同义突变：碱基置换不改变密码子的含义；l错义突变；碱基置换改变了密码子的含义；l无义突变：碱基置换产生终止密码子UAA、UAG或UGA，使转译在突变处终止；l移玛突变：碱基的缺失或添加，使改变，使突
3、变点以后的密码子的阅读框完全错位；但是缺失或添加三个碱基，或缺失和添加数相等，则不会发生移码突变，而可能发生错义突变；678.2.2 基因的自发突变机制l自发突变：由DNA固有的物化特性决定，以及胞内环境因素影响，在DNA复制时，偶然引发的基因突变；一般发生频率极低，约在10-610-9 之间；碱基互变：碱基在酮式/烯醇式，氨式/亚氨式等异构体之间相互转变的特性；胞嘧啶的自然脱氨基作用，使胞嘧啶变为尿嘧啶；环出效应： DNA复制时，模板链与子链之间出现相对滑动而成环，造成子链发生碱基缺失或添加；8亚氨式C-A烯醇式T-G亚氨式A-C烯醇式G-T碱基的异构体及配对方式l碱基通常以常态结构存在，但
4、也有一定几率，以异构体形态存在；l碱基异构体配对方式与常态碱基配对方式不同；如果在DNA复制时，某个碱基处于异构体形态，则发生错配；9碱基互变导致基因的自发突变l在DNA复制过程中，如果某个G以烯醇式异构体存在，则与T配对，在子链中形成G-T错配；在下一次复制时，在子链中出现由G-C到A-T基因突变；10环出效应引起的基因自发突变lDNA复制时，子链滑动出现环出，则子链发生碱基添加；如果母链滑动出现环出，则子链发生碱基缺失；l子链再次复制时，其子链发生突变；118.3.3 基因的诱发突变机制l诱发突变：由外界的物理、化学或生物因素直接或间接作用于胞内DNA 分子，而导致的基因突变；一般发生频率
5、显著高于自发突变；l诱变剂：能够直接或间接增加胞内DNA的不稳定性，提高DNA复制出错几率的物理、化学、生物因素；化学诱变剂：碱基类似物、氧化剂、烷化剂、插入染料等；物理诱变剂：紫外线和电离辐射；生物诱变剂：温和性噬菌体、转座因子等；12碱基类似物及诱变机制l碱基类似物：组成DNA的四种正常嘌呤或嘧啶碱基的结构类似物；如：5-溴尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、8-氮鸟嘌呤、6-巯基嘌呤、2-氨基嘌呤等；l碱基类似物的诱变机制：在DNA复制时，碱基类可替代正常碱基掺入到新合成的子链中；但碱基类似物更容易发生常态结构和异构体之间的互变，在DNA下次复制时，提高错配的几率； 135-溴尿嘧啶的异构体和配对方式
6、l5-溴尿嘧啶是嘧啶碱基类似物，可代替嘧啶核苷酸参与DNA复制；l酮式5-溴尿嘧啶替代T与A配对（5-BU-A）；l稀醇式5-溴尿嘧啶则替代C与G配对（5-BUe-G）；145-溴尿嘧啶的诱变机制l5-溴尿嘧啶比正常碱基更容易发生酮式到稀醇式的互变，在DNA复制时，更容易产生错配，提高T-A到C-G的突变几率；烯醇式酮式15亚硝基胍（NTG）的诱变机制lN-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍是超强的鸟嘌呤烷化剂，使鸟嘌呤甲基化为O6-甲基鸟嘌呤；lDNA复制时，O6-甲基鸟嘌呤与T配对；再次复制时，产生C-G到A-T的基因突变；16常用烷化剂-硫酸酯和磺酸烷酯17常用烷化剂-亚硝基化合物类18常用烷
7、化剂-环氧类和乙烯亚胺类19常用烷化剂-其它类l重氮甲烷（diazomethane ）lb-丙酸内酯（ b- ptopylactone）l芥子气（mustard gas）l氮芥（nitrogen mustard ）20插入染料及诱变机制l插入染料是一类具有扁平形状的有机分子，如：溴化乙锭（EB）、丫啶橙、丫啶黄、原黄素等；l插入染料能够插入到双螺旋DNA中间堆积的碱基之间，在复制时引起DNA滑动，造成碱基的缺失或添加突变；EB21紫外线的诱变机制l紫外线照射可使胞内DNA上相邻的两个嘧啶之间形成二聚体；当DNA复制时，影响其模板功能，导致碱基对置换，诱发基因突变；l细胞都存在DNA损伤的暗修复
8、和光修复机制，使一般剂量紫外线的照射不足以引起较高频率的基因突变；22电离辐射的诱变机制l电离辐射：带有较高能量的能引起物质电离的电磁波，如：c射线、a射线、b射线、g射线等；l在温和剂量下，受电离辐射的胞内DNA电离发生损伤，导致基因突变；或者使胞内其它物质电离产生强氧化物，再作用于DNA分子，诱发基因突变；l各种诱变剂与DNA发生作用的位点是高度随机的，由此产生的DNA突变也是随机分布的，诱变剂与特定基因突变没有对应关系基因突变的不对应性；238.3.4 突变型菌株及应用l野生型菌株：从自然环境中分离得到的，基因型和表型为其固有的菌株；l突变型菌株（突变型）：由野生型菌株发生基因突变，而衍
9、生出的具有新的基因型和表型的菌株；l突变型菌株主要用于代谢和分子遗传学研究，以及用作工业发酵菌种；l突变型的类型：营养缺陷型、抗性突变型、条件致死突变型、形态突变型、产量突变型；24营养缺陷型（auxotroph）l营养缺陷型：由于基因发生突变而不能正常表达所编码的酶，导致某种必需代谢物的合成能力缺陷的突变型菌株；l常见营养缺陷型：氨基酸缺陷型、维生素缺陷型、核苷酸（碱基）缺陷型等；需要从营养物质中提供所缺陷的代谢物，营养缺陷型才能正常生长；l例：细胞因基因突变而不能合成二氢蝶酸合成酶，使叶酸合成能力缺陷，细胞则成为叶酸缺陷型突变株；25抗性突变型（resistant mutant）l抗性突变
10、型：因基因突变，导致该基因表达水平改变，或者导致细胞结构或代谢途径发生改变，使细胞对某种化学因子和环境因素的耐受性提高的突变株；l常见抗性突变株：抗药性突变株、耐渗透压突变株、耐高温突变株、耐酸或耐碱突变株、耐有机溶剂突变株等；l例如：可以耐受高浓度乙醇的乙醇耐受型突变株用于工业乙醇发酵的菌种；26 条件致死突变型（conditional lethal ）l条件致死突变型：因基因突变，而丧失在某种特定物化条件下的生长能力，表现为死亡的突变型；l例如：野生型E.coli在42时可以正常生长，其温度敏感突变型（temperature sensitive,ts）突变株在42时不能生长，但低于42可正
11、常生长；l条件致死突变型作为一种方便选择培养（淘汰）的菌株，在微生物的分子遗传学研究许多应用；27形态突变型和产量突变型l形态突变型：基因突变导致形态特征明显改变的突变株；例如：肺炎链球菌野生型（S型菌株）和形态突变型（R型菌株），菌落分别呈现大而湿润和小而干燥的特征；因荚膜合成能力缺陷所致；l产量突变型：由于多基因影响某种代谢物的过量合成，不清楚的基因突变导致代谢物的合成能力提高的突变株；传统工业发酵菌株基本上都是产量突变株；例如：产青霉素的产黄青霉的产量突变型，其产青霉素的能力较野生型大幅度提高；288.3.5 诱变育种技术l诱变育种技术：使用诱变剂，通过诱变，提高基因突变发生几率的技术；
12、以及将诱变产生的少数目的突变株从混杂群体中筛选（选择）出来的技术；l诱变育种技术是改变微生物基因型的传统手段，用于为微生物分子遗传学提供材料，也用于工业微生物的遗传育种；l微生物遗传育种：通过人工技术手段改变微生物的基因型，获得性状优良的工业发酵菌株；29诱变技术规范l出发菌株的选择：基本性状优良，对诱变剂敏感，使用指数期细胞，丝状菌使用单孢子；l诱变剂的选择：一般遵循先简易，后繁杂；先温和后强烈，先单一后复合的原则；可进行多轮诱变；l诱变强度的选择：以细胞致死率或存活率为诱变强度的指标，可选择致死率为90%的诱变强度，也可以选择致死率为10%的诱变强度： 诱变强度= 剂量 处理时间30突变株
13、筛选方法l诱变虽然能够提高总基因突变几率，但是特定基因突变的出现几率相对依然很低，可能在10-310-6之间；l设计有效的目的突变株的筛选方法，是决定诱变育种效率的关键；l一般采用选择性培养基或培养条件选择目的突变型，或淘汰野生型，浓缩目的突变型；l或采用鉴别培养基，将不便直接观察的突变表型特征转化为可观察的菌落特征，透明圈、变色圈；31P233苯丙氨酸产量突变株的选择（筛选）方法l苯丙氨酸的合成代谢受苯丙氨酸反馈阻遏调节；苯丙氨酸结构类似物氟苯丙氨酸抑制野生型的生长；l用含有抑制浓度氟苯丙氨酸的平板培养基，培养诱变处理后的菌悬液，野生型与其它突变型不能生长，只有苯丙氨酸产量突变株可以生长，而
14、从混合菌群中被选择出来；l原理：苯丙氨酸合成酶基因的调控元件发生突变，成为组成型表达，不再受苯丙氨酸或结构类似物氟苯丙氨酸的反馈阻遏调控，苯丙氨酸过量合成；32营养缺陷型的筛选培养基l营养缺陷型因为有缺陷，容易使用培养基或培养条件淘汰，而不利于选择；一般使用基本培养基与补充培养基菌落生长对照方法筛选；l基本培养基：能够满足野生型最低生长需要的培养基，一般是合成培养基，营养缺陷型不能生长；l补充培养基：在基本培养基中，补充某一种营养物质，能够满足某种营养缺陷型的生长需要；l完全培养基：一般是天然培养基或半合成培养基，营养丰富，能够满足野生型和营养缺陷型的生长需要；33营养缺陷型的筛选方法l诱变处理后的菌悬液涂布在完全培养基上，培养至长出单菌落；l将长出的所有单菌落都逐个点种至基本培养基和补充培养基的对应位置，培养至长出菌苔；l如果在基本培养基上不生长，而在对应位置的补充培养基上生长的单菌落，可能是目的营养缺陷型；基本培养基补充培养基34提高营养缺陷型筛选操作效率的影印法l制作略小于培养皿直径的“印章”，包灭菌丝绒布，先印完全培养基菌落，然后分别转印基本和补充培养基；35赖氨酸产量突变株的筛选策略l筛选高丝氨酸营养缺陷型，即高丝氨酸脱氢酶缺陷型菌株，可获得赖氨酸产量突变株；l赖氨酸是分支合成代谢的末端产物之一，合成受苏氨酸和赖氨酸的协同反馈抑制调节；
