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1、第十章第十章蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定第一节第一节 概述概述1 1，蛋白质是生命的物质根底：，蛋白质是生命的物质根底：是构成细胞的组成成分：细胞膜中的蛋白质，线粒体、内质网等细是构成细胞的组成成分：细胞膜中的蛋白质，线粒体、内质网等细胞器上的构造蛋白或酶，染色体中的核蛋白，血液中的血红蛋白，也是激素胞器上的构造蛋白或酶，染色体中的核蛋白，血液中的血红蛋白，也是激素和抗体的根本成分。和抗体的根本成分。2 2，担当重要的生理功能：担当重要的生理功能：是生物体发育及修补组织时所需氨基酸的来源，是生物体发育及修补组织时所需氨基酸的来源，物质代谢的生物催化剂，物质代谢的生物催化剂，营养物质
2、及气体的运输营养物质及气体的运输遗传信息的传送与表达遗传信息的传送与表达人体内的组质液人体内的组质液pHpH安康安康pHpH在在7.37.37.57.5之间及水分的平衡之间及水分的平衡为免疫系统制造对抗细菌和感染的抗体；为免疫系统制造对抗细菌和感染的抗体；普通以为成人每人每天营养需求量为：普通以为成人每人每天营养需求量为：7575克蛋白质。克蛋白质。蛋白质的组成及特性蛋白质的组成及特性蛋白蛋白质的的组成成: : 蛋蛋白白质由由很很多多的的AAAA单体体以以肽键结合合而而成成的的具具有有一一定定空空间构构造造的的含含氮氮有有机机化化合合物物，有有的的含含有有P P、S S、 CuCu、FeFe、
3、I I等等元元素素，分分子子量量高高达达数数万万数数百百万万。含含氮氮是是蛋白蛋白质区区别于其它有机化合物的主要于其它有机化合物的主要标志。志。蛋蛋白白质系系数数：普普通通而而言言，蛋蛋白白质含含氮氮量量约为16%16%，即即1 1份份氮氮相相当当于于6.256.25份份蛋蛋白白质，此数，此数值6.256.25称称为蛋白蛋白质系数。系数。 氨基酸的种氨基酸的种类: :自自然然界界中中曾曾经发现的的氨氨基基酸酸约有有170170多多种种，其其中中组成成蛋蛋白白的的氨氨基基酸酸只只需需2222种种都是都是-AA-AA，其中，其中对人而言的必需氨基酸有人而言的必需氨基酸有8 8种犬的必需氨基酸有种犬
4、的必需氨基酸有9 9种。种。组成蛋白的氨基酸成蛋白的氨基酸-AA-AA的通式及的通式及AAAA两性两性电解解质特性：特性：部分食品的蛋白质含量部分食品的蛋白质含量谷类和面食：谷类和面食： % %大米糙米、长粒、生大米糙米、长粒、生 7.9 7.9大米白米、长粒、生大米白米、长粒、生 7.1 7.1小麦粉整粒小麦粉整粒 13.7 13.7玉米粉整粒、黄色玉米粉整粒、黄色 6.9 6.9玉米淀粉玉米淀粉 0.3 0.3豆类：豆类：大豆成熟的种子、生大豆成熟的种子、生 36.5 36.5豆腰子状、一切种类豆腰子状、一切种类 23.6 23.6豆腐生、普通豆腐生、普通 8.1 8.1水果和蔬菜：水果和
5、蔬菜：苹果生、带皮苹果生、带皮 0.2 0.2芦笋生芦笋生 2.3 2.3草莓生草莓生 0.6 0.6莴苣冰、生莴苣冰、生 1.0 1.0肉、家禽、肉、家禽、鱼：牛肉牛肉颈肉、烤前腿肉、烤前腿 18.5 18.5牛肉腌制、干牛肉牛肉腌制、干牛肉 29.1 29.1鸡可供煎炸的可供煎炸的鸡胸肉、生胸肉、生 23.1 23.1火腿切片、普通的火腿切片、普通的 17.6 17.6鸡蛋生、全蛋蛋生、全蛋 12.5 12.5鱼太平洋太平洋鳕鱼、生、生 17.9 17.9鱼罐装金罐装金枪鱼滴干的固体滴干的固体 26.5 26.5乳制品：乳制品：牛乳全脂、液体牛乳全脂、液体 3.3 3.3牛乳脱脂、干牛乳脱
6、脂、干 36.2 36.2干酪干酪 24.9 24.9酸奶普通的、低脂酸奶普通的、低脂 5.3 5.3优质蛋白蛋白质对人人类而言而言必需氨基酸：必需氨基酸：在在组成蛋白的氨基酸中，在人体内不能合成或合成速度很慢的氨基酸。成蛋白的氨基酸中，在人体内不能合成或合成速度很慢的氨基酸。人人类而言而言,优质蛋白蛋白质的定的定义:l蛋白蛋白质中必需氨基酸的含量高中必需氨基酸的含量高,且且总体氨基酸的体氨基酸的组成比例接近母乳蛋白氨基成比例接近母乳蛋白氨基酸比例的蛋白酸比例的蛋白质。动物来源和豆物来源和豆类食品是很好的食品是很好的优质蛋白蛋白质。普通而言：普通而言：动物性蛋白所含必需氨基酸的种物性蛋白所含必
7、需氨基酸的种类及数量及数量较多多,而植物性蛋白而植物性蛋白所含必需氨基酸的种所含必需氨基酸的种类及数量及数量较少。少。假假设蛋白蛋白质或某些必需氨基酸供或某些必需氨基酸供应缺乏：缺乏： l l 会会导生物体生生物体生长发育育缓慢，体重减慢，体重减轻，抵抗力下降，容易患病；，抵抗力下降，容易患病；l l 男性精液男性精液质量下降，精子数量减少，性欲降低；量下降，精子数量减少，性欲降低；l l 女性引起不孕，即使女性引起不孕，即使怀孕，胎儿也常孕，胎儿也常发育不良而育不良而发生死胎或畸胎。生死胎或畸胎。 开开发蛋白蛋白质的生理效价高的食品及合理配膳等的生理效价高的食品及合理配膳等 是食品科学从是食
8、品科学从业者的一者的一项重要重要义务！常用的蛋白质和氨基酸的测定方法常用的蛋白质和氨基酸的测定方法常用的蛋白常用的蛋白质和氨基酸的和氨基酸的测定方法：定方法：蛋白蛋白质含量含量测定最常用的方法是定最常用的方法是凯氏定氮法，准确、操作氏定氮法，准确、操作较费时，在国内外运用普遍。，在国内外运用普遍。双双缩脲法、染料法、染料结合法、酚合法、酚试剂法等也常用于蛋白法等也常用于蛋白质含量含量测定，定，由于方法由于方法简便快速，故多用于消便快速，故多用于消费单位位质量控制分析。量控制分析。另外，国外采用近另外，国外采用近红外分析外分析仪，利用波，利用波长在在0.753m范范围内的内的近近红外外线具有被蛋
9、白具有被蛋白质组分吸收及反射的特性，建立了近分吸收及反射的特性，建立了近红外外光光谱快速定量方法。快速定量方法。在普通的常在普通的常规检验中多中多进展氨基酸展氨基酸总量的量的测定，通常采用酸碱定，通常采用酸碱滴定法来完成。滴定法来完成。本章重点：本章重点：凯氏定氮法的原理及本卷氏定氮法的原理及本卷须知，双知，双缩脲法、印三法、印三酮法及氨基酸法及氨基酸自自动分析分析仪的原理及本卷的原理及本卷须知，知，动物物实验法，氨基酸法，氨基酸总量的量的测定。定。第二节第二节 蛋白质的定性测定蛋白质的定性测定考考马斯亮斯亮蓝法法 (Stain with Coomassie blue) (Stain with
10、 Coomassie blue)：考：考马斯亮斯亮蓝法灵法灵敏度比氨基黑高五倍，尤其适用于敏度比氨基黑高五倍，尤其适用于SDSSDS电泳的微量蛋白泳的微量蛋白质的染色。的染色。在在549nm549nm有最大吸收有最大吸收值，蛋白，蛋白质在在1 110g10g呈呈线性关系。可以性关系。可以检测出出0.1 ug 0.1 ug 的蛋白的蛋白质条条带. . 但但银染法可以染法可以检测出出 2 ng 2 ng的蛋白的蛋白质条条带. .CoomassieBlueSTAININGPROCEDURES1.ReagentsCoomassieBlueR-250MethanolGlacialaceticacid2.
11、GelStainningsolution,1L1.0gCommassieBlueR-250450mlwater450mlmethanol100mlGlacialaceticacid3.Geldestainingsolution,1L100mlMethanol100mlGlacialaceticacid800mlWater4.StainingProcedure1.Pickupthegelinto(20ml,usuallyenough)Stainingsolutioninacontainerandagitatefor10minfor0.75mmGeland20minand1.5mmgel.Thes
12、tainingsolutioncanbereusedseveraltimes.2.Takethegeloutandrinsethegelwithafewchangesofwaterinanewcontainer3.Add50mldestainingsolution.Strongbandsarevisiableimmediatelyonalightbox,and1hourusuallyisenough.4.Todestaincompletely,changedestainingsolution2-3timesandagitateovernight.5.Scanortakephototorecor
13、dtheresult.CoomassieBlueSTAININGPROCEDURES4.银银染法染法(Silverstaining):candetectaslittleas2ngofproteininasinglebandinSDS-PAGEGel.Reagents:SilvernitrateSodilumhydroxide30%ammoniumhydroxidecitricacid38%formaldehydeMethanolAceticacidStainingprocedure1.Sockgelin50%Methanol-10%aceticacidforatleast1hourwith2-
14、3changesofsockingsolution2.Rinsegelwith3changesofwaterfortotal30minutes.3.silverstainingfor15mins4.Rinsegelwithtwiceindeionizedwater5.Developgelwithdevelopingsolution6.stopdevelopmentbyringsingin1%aceticacid.7。washgelinwaterforatleast1hour.2DE2-DE:thetechniquetoseparateproteinsinthefirstdimensionacc
15、ordingtotheir isoelectric point, by Isoelectric Focusing(IEF), and in the seconddimension according to their molecular weight, by SDS-PAGE. 2-DEcombinedwithproteinidentificationbasingonmicrosequencing,aminoacidcomposition and Mass spectrometry, provides an invaluable tool forproteomicstudies.Step1Sa
16、mplePrepStep2First-Dimension(IEF)SeparationStep3Second-Dimension(SDS-PAGE)SeparationStep4ProteinDetectionbyStaining/Destaining凯氏定氮法凯氏定氮法 凯氏定氮法是先测定总氮量凯氏定氮法是先测定总氮量, , 然后乘以蛋白质换算系然后乘以蛋白质换算系数，即可得到粗蛋白质含量。可用于一切动、植物食数，即可得到粗蛋白质含量。可用于一切动、植物食品的蛋白质含量测定。但因样品中常含有核酸、生物品的蛋白质含量测定。但因样品中常含有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮
17、碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物，故结果称为粗蛋白质含量。化合物，故结果称为粗蛋白质含量。凯氏定氮法由凯氏定氮法由KieldahlKieldahl于于18331833年首先提出，经过长期年首先提出，经过长期改良，迄今已演化成常量法、微量法、自动定氮仪法、改良，迄今已演化成常量法、微量法、自动定氮仪法、半微量法及改良凯氏法等多种，至今仍被作为规范检半微量法及改良凯氏法等多种，至今仍被作为规范检验方法。在此主要引见常量凯氏定氮法的原理及步骤。验方法。在此主要引见常量凯氏定氮法的原理及步骤。原理原理: : 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，样品与浓硫酸和催化剂一同加
18、热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化成二氧化碳和水逸出，而部分硫酸其中碳和氢被氧化成二氧化碳和水逸出，而部分硫酸被复原成二氧化硫，样品中的有机氮转化为氨与过量被复原成二氧化硫，样品中的有机氮转化为氨与过量的硫酸结合成硫酸铵的硫酸结合成硫酸铵; ; 然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用弱酸硼酸吸收后再以规范强酸如盐酸或硫酸溶液滴定，弱酸硼酸吸收后再以规范强酸如盐酸或硫酸溶液滴定，根据规范酸耗费量可计算出蛋白质的含量。根据规范酸耗费量可计算出蛋白质的含量。 催化剂催化剂煮沸煮沸1、消化：、消化：NCOC+浓浓H2SO4 NH4 2SO4+CO2+SO2+H2O2、氨化：、氨化：2
19、NaOH+ NH4 2SO42NH3+Na2SO4+2H2O3、吸收、吸收:2NH3+4H3BO3 NH4 2B4O7+5H2O4、滴定：、滴定： NH4 2B4O7+5H2O+2HCl2NH4Cl+4H3BO3(注注:NCOC,Nitrogencontainingorganiccompounds)凯氏定氮法原理方程式凯氏定氮法原理方程式凯氏定氮法本卷须知凯氏定氮法本卷须知图：常量凯氏定氮消化及蒸馏安装图：常量凯氏定氮消化及蒸馏安装 a a消化安装消化安装 b b蒸馏吸收安装蒸馏吸收安装1 1、硫酸钾、硫酸钾 及及硫酸铜的作用硫酸铜的作用2 2、火候控制、火候控制3 3、安装的气、安装的气密性
20、密性4 4、何时加碱、何时加碱5 5、难消化的、难消化的 对策对策6 6、停顿蒸馏、停顿蒸馏 阐明及本卷明及本卷须知知0: 0: 当当浓硫酸的用量硫酸的用量为30ml30ml时，硫酸，硫酸铜，硫酸，硫酸钾，氢氧化氧化钠等等试剂应按比例添加。按比例添加。所用所用试剂溶液运用无氨蒸溶液运用无氨蒸馏水配制。水配制。 消化消化时不要用不要用强火，火，应坚持和持和缓沸沸腾，以免粘附在，以免粘附在凯氏瓶内壁上的含氮化合物未消氏瓶内壁上的含氮化合物未消化完全而呵斥氮化完全而呵斥氮损失。失。消化消化过程中程中应留意不留意不时转动凯氏氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上
21、的固体残渣洗下并促洗下并促进其消化完全。其消化完全。样品中假品中假设含脂肪或糖含脂肪或糖较多多时，消化，消化过程中易程中易产生大量泡沫，生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，防止泡沫溢出瓶外，在开在开场消化消化时运用小火加运用小火加热，并不停地，并不停地摇动；或者参与少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡；或者参与少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同并同时留意控制留意控制热源源强度。度。当当样品消化液不易廓清透明品消化液不易廓清透明时，可将，可将凯氏氏烧瓶冷却，参与瓶冷却，参与30%30%过氧化氧化氢2 23mL3mL后再后再继续加加热消化。消化。假假设取取样量量较大，如干大，如干试样超越超越5g5g，可按每
22、克，可按每克试样5mL5mL的比例添加硫酸用量何的比例添加硫酸用量何时会会必要？。必要？。普通消化至呈透明后，普通消化至呈透明后，继续消化消化30min30min即可，但即可，但对于含有特于含有特别难以氨化的氮化合物的以氨化的氮化合物的样品，如含品，如含赖氨酸、氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延伸消化，需适当延伸消化时间。有机。有机物如分解完全，消化液呈物如分解完全，消化液呈蓝色或浅色或浅绿色，但含色，但含铁量多量多时，呈，呈较深深绿色。色。蒸蒸馏安装不能漏气。安装不能漏气。蒸蒸馏前假前假设加碱量缺乏，消化液呈加碱量缺乏，消化液呈蓝色不生成色不生成
23、氢氧化氧化铜沉淀，此沉淀，此时需再添加需再添加氢氧化氧化钠用量。用量。硼酸吸收液的温度不硼酸吸收液的温度不应超越超越4040，否那么，否那么对氨的吸收作用减弱而呵斥氨的吸收作用减弱而呵斥损失，此失，此时可可置于冷水浴中运用。置于冷水浴中运用。1111蒸蒸馏终了后，了后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1min1min后关掉后关掉热源，否那么源，否那么能能够呵斥吸收液倒吸。呵斥吸收液倒吸。 (12)(12)混合指示混合指示剂在碱性溶液中呈在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。色。 氨基酸的分析什
24、么是氨基酸?氨基酸的分类氨基酸的化学构造?氨基酸的两性电解质的特性氨基酸的构造氨基酸的构造氨氨基酸的普通氨氨基酸的普通显色反响色反响 茚三三酮法、法、吲哚醌法和法和邻苯二甲苯二甲醛法。前二种是法。前二种是经典的常用典的常用显色法，后一种是近年来开展起来的色法，后一种是近年来开展起来的荧光光显色法，具有灵敏度高色法，具有灵敏度高的特点。的特点。1. 1. 茚三三酮法法原理原理: : 氨基酸或蛋白氨基酸或蛋白质能与能与茚三三酮作用，生成作用，生成蓝紫色化合物紫色化合物. .步步骤：将点有将点有样品的品的层析析滤纸充分除尽溶充分除尽溶剂，用用5g/L5g/L茚三三酮无水丙无水丙酮溶液溶液喷雾，充分吹
25、干，充分吹干，65,30min65,30min空气中的氨可使背景泛空气中的氨可使背景泛红色，氨基酸斑点呈紫色，氨基酸斑点呈紫红色。色。为了使各种氨基酸呈了使各种氨基酸呈现不同不同颜色，可用以下方法：色，可用以下方法：用用0.4g0.4g茚三三酮，10g10g酚和酚和90g90g正丁醇的混合液正丁醇的混合液显色。色。用用1g/L1g/L茚三三酮无水丙无水丙酮溶液溶液显色色终了后，再用了后，再用盐酸蒸汽熏酸蒸汽熏1min (HOW ?)1min (HOW ?)。为了使了使显色色稳定，可用以下方法：定，可用以下方法： ( (何何谓储存液及任存液及任务液液?)?)储存液存液A A：醋酸：醋酸镉2g2g
26、、冰醋酸、冰醋酸40mL40mL、蒸、蒸馏水水200mL 200mL 储存液存液B B：茚三三酮2g2g、丙、丙酮200mL200mL显色液：色液：A/B=1.2:1 (A/B=1.2:1 (按需制按需制备) )点有点有样品的品的滤纸上浸有此上浸有此显色液后，放置于盛有一小杯色液后，放置于盛有一小杯浓硫酸硫酸的密的密闭玻璃容器中玻璃容器中2525，18h18h，或，或较高温度下适当高温度下适当缩短短时间。背。背风光浅，氨基酸斑点也比光浅，氨基酸斑点也比较稳定。拍照定。拍照记录! !2 2吲哚醌吲哚醌法法各种氨基酸与各种氨基酸与吲哚醌试剂吲哚醌试剂能能显显示不同示不同颜颜色，因此可借此色，因此可
27、借此辩认辩认氨基酸。氨氨基酸。氨对吲哚醌显对吲哚醌显色没色没有妨碍，但其灵敏度有妨碍，但其灵敏度较茚较茚三三酮酮法稍差，法稍差，显显色不色不稳稳定，定，颜颜色只需在色只需在绝对绝对枯燥的枯燥的环环境中才干境中才干保管。保管。3 3邻邻苯二甲苯二甲醛醛法法邻邻苯二甲苯二甲醛醛在在2-2-巯巯基乙醇存在下，在碱性溶液中与氨基酸作用基乙醇存在下，在碱性溶液中与氨基酸作用产产生生荧荧光化合物，最适的光化合物，最适的激激发发光和光和发发射光波射光波长长分分别为别为340nm340nm和和455nm455nm。在手提式紫外灯。在手提式紫外灯(254/365)(254/365)下察看下察看. .* * 邻邻
28、苯二甲苯二甲醛醛法是目前法是目前纸纸上上层层析、硅胶薄析、硅胶薄层层层层析析荧荧光光显显色氨基酸最灵敏的方法之一，也色氨基酸最灵敏的方法之一，也可用于氨基酸溶液定量可用于氨基酸溶液定量. .氨基酸氨基酸纸纸上上层层析灵敏度达析灵敏度达0.5moL0.5moL，在硅胶薄，在硅胶薄层层层层析上析上为为0.050.050.2moL (0.2moL (不不严严密密, ,由于各种氨基酸由于各种氨基酸显现显现的的荧荧光光强强度不同度不同, ,所以因指明是什么所以因指明是什么AA.)AA.)* * 各种氨基酸各种氨基酸显现显现的的荧荧光光强强度不同，其相度不同，其相对荧对荧光光强强度由大到小大致度由大到小大
29、致顺顺序如下：天序如下：天门门冬氨冬氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，组组氨酸，亮氨酸，氨酸，亮氨酸，丝丝氨酸，氨酸，缬缬氨酸，谷氨酸，氨酸，谷氨酸，苏苏氨氨酸，甘氨酸，色氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，酸，甘氨酸，色氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，赖赖氨酸，酪氨酸，氨酸，酪氨酸，NH3NH3，脯氨酸和半胱氨酸。，脯氨酸和半胱氨酸。阐阐明明在在滤纸滤纸上上显现显现氨基酸氨基酸时时，邻邻苯二甲苯二甲醛浓醛浓度以度以0.1%0.1%为为宜。宜。显显色色时时必需有一定的湿度，以便必需有一定的湿度，以便氨基酸溶解，提高分子碰撞机率，并使极性基氨基酸溶解，提高分子碰撞机率，并使极性基团团
30、解离，促解离，促进进反响反响趋趋于完全。湿度太低，于完全。湿度太低，显显不出不出荧荧光。温度光。温度对显现对显现的的荧荧光延光延时时有有显显著影响，温度高著影响，温度高荧荧光延光延时时短，温度低短，温度低荧荧光延光延时时长长。个别氨基酸的显色反响个别氨基酸的显色反响利用个别氨基酸与某些试剂具有特殊的显色反响定利用个别氨基酸与某些试剂具有特殊的显色反响定性氨基酸可运用于纸层析和纸电泳显色。性氨基酸可运用于纸层析和纸电泳显色。 精氨酸，胱氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝精氨酸，胱氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和羟赖氨酸、羟脯氨酸氨酸和羟赖氨酸、羟脯氨酸, ,色氨酸、酪氨酸、酪氨色氨酸、酪
31、氨酸、酪氨酸、组氨酸。酸、组氨酸。氨基酸定量氨基酸定量一、氨基酸的普通定量一、氨基酸的普通定量测定定一甲一甲醛滴定法滴定法氨基酸具有酸性的氨基酸具有酸性的-COOH基和碱性的基和碱性的-NH2基。它基。它们相互作用而使氨基酸成相互作用而使氨基酸成为中性的内中性的内盐。当参与甲。当参与甲醛溶液溶液时，-NH2基与甲基与甲醛结合，从而使其碱性消合，从而使其碱性消逝。逝。这样就可以用就可以用规范范强强碱溶液来滴定碱溶液来滴定-COOH基，并用基，并用间接的方法接的方法测定氨定氨基酸基酸总量。量。反响式如下：反响式如下： 3 3操作方法操作方法 汲汲取取含含氨氨基基酸酸约20mg20mg的的样品品溶溶
32、液液于于100mL100mL容容量量瓶瓶中中，加加水水至至标线，混混匀匀后后汲汲取取20.0mL20.0mL置置于于200mL200mL烧杯杯中中，加加水水60mL60mL，开开动磁磁力力搅拌拌器器，用用0.05mol/L0.05mol/L氢氧氧化化钠规范范溶溶液液滴滴定定至至酸酸度度计指示指示pH8.2pH8.2，记录耗耗费氢氧化氧化钠规范溶液范溶液mLmL数，供数，供计算算总酸含量。酸含量。参参与与10.0mL10.0mL甲甲醛溶溶液液，混混匀匀。再再用用上上述述氢氧氧化化钠规范范溶溶液液继续滴滴定定至至pH9.2pH9.2，记录耗耗费氢氧化氧化钠规范溶液毫升数范溶液毫升数(V1)(V1)
33、。同同时取取80mL80mL蒸蒸馏水水置置于于另另一一200mL200mL干干净烧瓶瓶中中，先先用用氢氧氧化化钠规范范溶溶液液调至至pH8pH82 2，此此时不不计碱碱耗耗费量量，再再参参与与10.0mL10.0mL中中性性甲甲醛溶溶液液，用用0.05mol/L0.05mol/L氢氧氧化化钠规范范溶溶液液滴滴定定至至pH9.2pH9.2，记录耗耗费氢氧化氧化钠规范溶液毫升数范溶液毫升数(V2),(V2),作作为试剂空白空白实验。4 4结果果计算算 氨基酸氨基酸态氮氮质量分数量分数% %= f(V1-V2)= f(V1-V2)式中：式中：V1V1样品稀品稀释液在参与甲液在参与甲醛后滴定至后滴定至
34、pH9.2pH9.2时所耗所耗费氢氧化氧化钠溶液的体溶液的体积； V2 V2空白空白实验参与甲参与甲醛后滴定至后滴定至pH9.2pH9.2时所耗所耗费的的氢氧化氧化钠规范溶液的体范溶液的体积5.5.阐明明本法准确快速，可用于各本法准确快速，可用于各类样品游离氨基酸含量品游离氨基酸含量测定定, ,浑浊和色深和色深样液可不液可不经处置而直接置而直接测定定, ,在在发酵酵工工业中中常常用用此此法法测定定发酵酵液液中中氨氨基基氮氮含含量量的的变化化，来来了了解解可可被被微微生生物物利利用用的的氮氮源源的量及利用情况，并以此作的量及利用情况，并以此作为控制控制发酵消酵消费的目的之一。的目的之一。脯脯氨氨
35、酸酸与与甲甲醛作作用用时产生生不不稳定定的的化化合合物物，使使结果果偏偏低低；酪酪氨氨酸酸含含有有酚酚羧基基，滴滴定定时也也会耗会耗费一些碱而致使一些碱而致使结果偏高；溶液中假果偏高；溶液中假设有有铵存在也可与甲存在也可与甲醛反响，往往使反响，往往使结果偏高果偏高茚三三酮比色法比色法 1 1原理原理氨氨基基酸酸在在碱碱性性溶溶液液中中能能与与茚三三酮作作用用，生生成成蓝紫紫色色化化合合物物脯脯氨氨酸酸反反响响成成黄黄色色，该蓝紫紫色色化化合合物物的的颜色色深深浅浅与与氨氨基基酸酸含含量量成成正正比比，其其最最大大吸吸收收波波长为570nm570nm，故故据据此此可可以以测定定样品中氨基酸含量。
36、品中氨基酸含量。2 2操作方法操作方法(1)(1)规范曲范曲线绘制制准准确确汲汲取取相相当当于于0 0、100100、200200、300300、400400、500500、600g600g氨氨基基酸酸( (单或或混混合合氨氨基基酸酸) )规范范溶溶液液，分分别置置于于25mL25mL容容量量瓶瓶或或比比色色管管中中，各各加加水水补充充至至容容积为4.0mL4.0mL，然然后后参参与与茚三三酮溶溶液液20g/L20g/L和和磷磷酸酸盐缓冲冲溶溶液液pHpH为8.048.04各各1mL1mL，混混合合均均匀匀，于于水水浴浴上上加加热15min15min，取取出出迅迅速速冷冷至至室室温温，加加水水
37、至至标线，摇匀匀。静静置置15min15min后后，在在570nm570nm波波长下下，以以试剂空空白白为参参比比液液测定各溶液的吸光度定各溶液的吸光度A A。绘制制规范曲范曲线。(2)(2)样品品测定定汲汲取取廓廓清清的的样品品溶溶液液1 14mL4mL，按按规范范曲曲线制制造造步步骤，在在一一样条条件件下下测定定吸吸光光度度A A值，用用测得的得的A A值在在规范曲范曲线上可上可查得得对应的氨基酸微克数。的氨基酸微克数。3 3结果果计算算4 4阐明及本卷明及本卷须知知通通常常采采用用的的样品品处置置方方法法为：准准确确称称取取粉粉碎碎样品品5 510g10g或或汲汲取取样液液样品品5 51
38、0mL10mL，置置于于烧杯杯中中，参参与与50mL50mL蒸蒸馏水水和和5g5g左左右右活活性性炭炭，加加热煮煮沸沸，过滤，用用303040mL40mL热水水( (磷磷酸酸缓冲液效果如何呢冲液效果如何呢?)?)洗洗涤活性炭，搜集活性炭，搜集滤液于液于100mL100mL容量瓶中，加水至容量瓶中，加水至标线，摇匀匀备测。 茚三三酮受受阳阳光光、空空气气、温温度度、湿湿度度等等影影响响而而被被氧氧化化呈呈淡淡红色色或或深深红色色，运运用用前前须进展展纯化化. .茚三酮茚三酮 (四)邻苯二甲醛法(OPT法)1原理邻苯二甲醛在2-巯基乙醇存在下，于碱性溶液中与氨基酸作用产生荧光化合物，最适的激发光和
39、发射光波长分别为340和455nm。能够产物为：各种氨基酸显现的荧光强度不同，其相对荧光强度由大到小大致顺序如下：天门冬氨酸，-赖氨酸，酪氨酸，NH3,半胱氨酸和脯氨酸，。本法可用于测定游离氨基酸的含量。灵敏度较茚三酮法约高100倍以上，可测到0.11104mol氨基酸。如用于血清中-氨基氮的测定，每次血清用量只需510L。与另一种荧光试剂萤光胺一样，空白无荧光，只需与氨基酸结合才产生荧光。缺陷是与脯氨酸不产生荧光，邻苯二甲醛与半胱氨酸荧光值太低。荧光胺已有用于氨基酸自动分析定量分析，但由于试剂昂贵及个别氨基酸反响不称心，目前还未普遍运用。二、个别氨基酸的定量测定二色氨酸的测定二色氨酸的测定原
40、原理理: :样样品品中中的的蛋蛋白白质质经经碱碱水水解解后后，游游离离的的色色氨氨酸酸与与甲甲醛醛和和含含铁铁离离子子的的三三氯氯乙乙酸酸溶溶液液作作用用，生生成成哈哈尔尔满满化化合合物物norharmannorharman，具具有有特特征征荧荧光光值值，可可以进展定量测定。反响式如下：以进展定量测定。反响式如下：一赖氨酸的测定一赖氨酸的测定二色氨酸的测定二色氨酸的测定三苯丙氨酸的测定三苯丙氨酸的测定四酪氨酸的测定四酪氨酸的测定五脯氨酸的测定五脯氨酸的测定1 1原理原理在在丙丙酮酮溶溶剂剂中中，脯脯氨氨酸酸与与吲吲哚哚醌醌反反响响构构成成蓝蓝色色化化合合物物，能能用用以以测测定定蛋蛋白白质质水
41、水解解液液中中的的脯脯氨氨酸酸含含量量，在在一一定定条条件件下下包包括括pHpH、缓缓冲冲液液浓浓度度和和吲吲哚哚醌醌浓浓度度，可可以以在在其其他他氨氨基基酸酸存存在在下直接进展测定，不受羟脯氨酸的干扰。下直接进展测定，不受羟脯氨酸的干扰。( (六六) )羟脯氨酸的测定羟脯氨酸的测定 七胱氨酸的测定七胱氨酸的测定 八谷氨酸的测定八谷氨酸的测定1 1原理原理L-L-谷谷氨氨酸酸在在大大肠肠杆杆菌菌的的谷谷氨氨酸酸脱脱羧羧酶酶作作用用下下脱脱羧羧释释放放出出二二氧氧化化碳碳，由由测测压压法法测测得得二二氧氧化化碳放出量，计算出谷氨酸含量。碳放出量，计算出谷氨酸含量。附附 8 8种氨基酸：种氨基酸：
42、 亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、 色氨酸、色氨酸、 缬氨酸缬氨酸第七节第七节 氨基酸的分别及测定氨基酸的分别及测定一、薄一、薄层色色谱法法1原理原理取一定量取一定量经水解的水解的样品溶液，滴在制好的薄品溶液，滴在制好的薄层板上，在溶板上，在溶剂系系统中中进展双向上行法展开展双向上行法展开，样品各品各组分在薄分在薄层板上板上经过多次的被吸附、解吸、交多次的被吸附、解吸、交换等作用，同一物等作用，同一物质具有一具有一样的的Rf值，不同成分那么有不同的，不同成分那么有不同的Rf值，因此各种氨基酸可到达彼此分，因此各种氨基酸可到
43、达彼此分别的目的。然后用的目的。然后用茚三三酮显色，与色，与规范氨基酸范氨基酸进展展对比，即可比，即可鉴别样品中所含氨基酸的种品中所含氨基酸的种类，从，从显色斑点色斑点颜色的深色的深浅可大致确定其含量。浅可大致确定其含量。D1D1D2D2ABC如何进展如何进展TLCTLC刮样刮样法分别氨基酸法分别氨基酸2DTLC二、氨基酸自动分析仪法二、氨基酸自动分析仪法1 1原理原理氨基酸的组分分析，如今广泛地采用离子交换法，并由自动化的仪器来完成。其氨基酸的组分分析，如今广泛地采用离子交换法，并由自动化的仪器来完成。其原理是利用各种氨基酸的酸碱性、极性和分子量大小不同等性质，运用阳离子交换原理是利用各种氨
44、基酸的酸碱性、极性和分子量大小不同等性质，运用阳离子交换树脂在色谱柱上进展分别。当样液参与色谱柱顶端后，采用不同的树脂在色谱柱上进展分别。当样液参与色谱柱顶端后，采用不同的pHpH值和离子浓度值和离子浓度的缓冲溶液即可将它们依次洗脱下来，即先是酸性氨基酸和极性较大的氨基酸，其的缓冲溶液即可将它们依次洗脱下来，即先是酸性氨基酸和极性较大的氨基酸，其次是非极性的芳香性氨基酸，最后是碱性氨基酸；摩尔质量小的比摩尔质量大的先次是非极性的芳香性氨基酸，最后是碱性氨基酸；摩尔质量小的比摩尔质量大的先被洗脱下来，洗脱下来的氨基酸可用茚三酮显色，从而定量各种氨基酸。被洗脱下来，洗脱下来的氨基酸可用茚三酮显色，
45、从而定量各种氨基酸。定量测定的根据是氨基酸和茚三酮反响生成蓝紫色化合物定量测定的根据是氨基酸和茚三酮反响生成蓝紫色化合物570nm570nm的颜色深浅的颜色深浅与各有关氨基酸的含量成正比。但脯氨酸和羟脯氨酸那么生成黄棕色化合物与各有关氨基酸的含量成正比。但脯氨酸和羟脯氨酸那么生成黄棕色化合物440nm440nm，故需在另外波优点定量测定。，故需在另外波优点定量测定。氨基酸自动分析仪3操作方法 样品处置：测定样品中各种游离氨基酸含量，可以除去脂肪杂质后，直接上柱进展分析；测定蛋白质的氨基酸组成时样品必需经酸水解称取枯燥的蛋白质样品数毫克，参与2mL5.7mol/L盐酸，置于110烘箱内水解24h
46、，然后除去过量的盐酸，加缓冲溶液稀释到一定体积，摇匀，使蛋白质完全变成氨基酸后才干上柱进展分析。假设样品中含有糖和淀粉、脂肪、核酸、无机盐等杂质，必需将样品预先除去杂质后再进展酸水解处置。去杂质的方法如下：去糖和淀粉：把样品用淀粉酶水解，然后用乙醇溶液洗涤，得蛋白质沉淀物。去脂肪：先把枯燥的样品经研碎后用丙酮或乙醚等有机溶剂离心或过滤抽提，得蛋白质沉淀物。去核酸：将样品在100g/L氯化钠溶液中，85加热6h，然后用热水洗涤，过滤后将固形物用丙酮枯燥即可。去无机盐：样品经水解后含有大量无机盐时还必需用阳离子交换树脂进展去盐处置。样品分析：经过处置后的样品上柱进展分析。上柱的样品量根据所用自动分
47、析仪的灵敏度来确定。普通为每种氨基酸0.1mol左右水解样品干重为0.3mg左右。测定必需在pH55.5、100下进展，反响进展时间为1015min，生成的紫色物质在570nm波长下进展比色测定。而生成的黄色化合物在440nm波长下进展比色测定。* 显色反响用的茚三酮试剂，随着时间推移发色率会降低，故在较长时间测样过程中应随时采用知浓度的氨基酸规范溶液上柱测定以检验其变化情况。* 采用反相色谱原理制造的氨基酸分析仪，可使蛋白质水解出的17种氨基酸在12min内完成分别，且具有灵敏度高最小检出量可达1pmol、重现性好以及一机多用等优点。三、气相色三、气相色谱法法1 1原理原理将本身没有将本身没
48、有挥发性的氨基酸性的氨基酸转变为适宜于气相色适宜于气相色谱分析的衍生物分析的衍生物三氟乙三氟乙酰基正丁基正丁酯。它包括用正丁醇的。它包括用正丁醇的酯化和用三氟乙酸化和用三氟乙酸酐TFAATFAA的的酰化两个步化两个步骤。将。将酰化好的氨基酸衍化好的氨基酸衍生物生物进展气相色展气相色谱分析。分析。四、高效液相色四、高效液相色谱法法高效液相色高效液相色谱法适于分析沸点高、分子量大、法适于分析沸点高、分子量大、热稳定性差的物定性差的物质和生物活性物和生物活性物质。由于大多数氨基酸无紫外吸收及由于大多数氨基酸无紫外吸收及荧光光发射特性，而紫外吸收射特性，而紫外吸收检测器器UVDUVD和和荧光光检测器器
49、FDFD又是又是HPLCHPLC仪的最常用配置。故人的最常用配置。故人们需将氨基酸需将氨基酸进展衍生化，使其可以利用紫外吸展衍生化，使其可以利用紫外吸收或收或荧光光检测器器进展展测定。定。氨基酸的衍生可分氨基酸的衍生可分为柱前衍生和柱后衍生。柱后衍生需柱前衍生和柱后衍生。柱后衍生需额外的反响器和外的反响器和泵，常用于氨基，常用于氨基酸分析酸分析仪，如前文所提的，如前文所提的茚三三酮反响。此外，如反响。此外，如荧光胺光胺FluramFluram、邻苯二甲苯二甲醛OPAOPA也有被人采用。在氨基酸的也有被人采用。在氨基酸的HPLCHPLC测定中，更多的定中，更多的还是采用柱前衍生法，是采用柱前衍生
50、法，这是由于比起柱后是由于比起柱后衍生法它的衍生法它的优点有：点有：1 1固定相采用固定相采用C18C18或其它疏水物，可分辨分子构造或其它疏水物，可分辨分子构造细小的差小的差别；2 2反相洗脱，流反相洗脱，流动相相为极性溶极性溶剂，如甲醇、乙二，如甲醇、乙二腈等，防止等，防止对荧光光检测的干的干扰，可提高，可提高灵敏度及速度；灵敏度及速度；3 3一机多用。一机多用。 AAsassaybyGC1 1原理原理将本身没有将本身没有挥发挥发性的氨基酸性的氨基酸转变为转变为适宜于气相色适宜于气相色谱谱分析的衍生物分析的衍生物三氟乙三氟乙酰酰基氨基酸正丁基氨基酸正丁酯酯。它包括用正丁醇的它包括用正丁醇的
51、酯酯化和用三氟乙酸化和用三氟乙酸酐酐 TFAATFAA 的的酰酰化两个步化两个步骤骤。将。将酰酰化好的氨基酸衍生物化好的氨基酸衍生物进进展气相色展气相色谱谱分析。分析。1.1.高效液相色谱法适于分析沸点高、分子量大、热稳定性高效液相色谱法适于分析沸点高、分子量大、热稳定性差的物质和生物活性物质。差的物质和生物活性物质。2. 2. 由于大多数氨基酸无紫外吸收及荧光发射特性，而紫由于大多数氨基酸无紫外吸收及荧光发射特性，而紫外吸收检测器和荧光检测器是外吸收检测器和荧光检测器是HPLCHPLC仪的最常的检测器。仪的最常的检测器。故人们需将氨基酸进展衍生化，使其可以利用紫外吸收故人们需将氨基酸进展衍生
52、化，使其可以利用紫外吸收或荧光检测器进展测定。或荧光检测器进展测定。3.3.氨基酸的衍生可分为柱前衍生和柱后衍生。柱后衍生需氨基酸的衍生可分为柱前衍生和柱后衍生。柱后衍生需额外的反响器和泵，常用于氨基酸自动分析仪，如前文额外的反响器和泵，常用于氨基酸自动分析仪，如前文所提的茚三酮反响。所提的茚三酮反响。4. 4. 在氨基酸的在氨基酸的HPLCHPLC测定中，更多的还是采用柱前衍生法，测定中，更多的还是采用柱前衍生法，这是由于比起柱后衍生法它的优点有：这是由于比起柱后衍生法它的优点有：1 1固定相采固定相采用用C18(C18(反相色谱反相色谱) )，可分辨分子构造细小的差别；，可分辨分子构造细小
53、的差别；2 2流动相为极性溶剂，如甲醇、乙二腈等，防止对荧光检流动相为极性溶剂，如甲醇、乙二腈等，防止对荧光检测的干扰，可提高灵敏度及速度；测的干扰，可提高灵敏度及速度；3 3一机多用。一机多用。AAsassaybyHPLC蛋白蛋白质营养养价的分析方法价的分析方法1、氨基酸组成分析2、必需氨基酸组成及含量分析3、体外酶解分析：蛋白质的可消化性能4、微生物生长分析：检查比需氨基酸及蛋白质的质量5、动物实验法：喂养小鼠。Protein digestibility= N absorbed / N ingestedActual biological value= N retained/ N absorbedCoefficient of protein= N retained / N ingestedTHANKSFORYOURATTENTION！
