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1、基因克隆的几种常用方法基因克隆的几种常用方法n根据已知序列克隆基因n未知序列的基因打靶n根据已知探针克隆基因 n用特异抗体克隆基因 n特异基因的功能克隆 呀笺蓄椅呜噪电蝶拈折殖脉酱骇俘傻颊顿窝弃验曹积记益氯户儡亚举祈奸基因克隆常用的方法基因克隆常用的方法1 1、根据已知序列克隆基因、根据已知序列克隆基因 对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。获取基因序列多从文献中查取,即将别人报道的基因序列直接作为自己克隆的依据。 目前,世界上主要的基因库有: (1)EMBLEMBLEMBLEMBL,为设在欧洲分子生物学实验室的基因库, 其网上地址为:http:/www.ebi.ac.uk/eb
2、i-home.html; (2)GenbankGenbankGenbankGenbank,为设在美国国家卫生研究院(NIH)的基因库, 其网上地址为:http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/web/search/index.html; (3)SwissportSwissportSwissportSwissport和TREMBLTREMBLTREMBLTREMBL,SwissportSwissportSwissportSwissport是一蛋白质序列库,其所含序列的准确度比较高,而 TREMBLTREMBLTREMBLTREMBL只含有从EMBLEMBLEMBLEMBL库中翻译过来
3、的序列。 轴弥怯羹更媳殿嚷玉肥诺崭堆瘟尔浚禄守蔫欣奶妇欢芒晓蹄闰规味括向迅基因克隆常用的方法基因克隆常用的方法 目前,以Genbank的应用最频繁。这些基因库是相互联系的,在Genbank注册的基因序列,也可能在Swissport注册。要克隆某个基因可首先通过Internet查询一下该基因或相关基因是否已经在基因库中注存。查询所有基因文库都是免费的,因而极易将所感兴趣的基因从库中拿出来,根据整个基因序列设计特异的引物,通过PCR从基因组中克隆该基因，也可以通过RT-PCR克隆cDNA。值得注意的是,由于物种和分离株之间的差异,为了保证PCR扩增的准确性,有必要采用两步扩增法,即nested P
4、CR。 届阑都孰形样沙龚弟角呵硷绕避映蓖座色蛹桐收葱类李珠娇膜而米绥海咱基因克隆常用的方法基因克隆常用的方法PCR反应模式图：反应模式图：PCR反应模式图：反应模式图：PCR反应模式图：反应模式图：Nested PCR反应模式图反应模式图撩洲片佛臃吴混柳状爽毅柱雁染叁衍市播涕猴俏粱惶赦剁悉介玩愧旭捏隔基因克隆常用的方法基因克隆常用的方法 根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质的基因扩增出来。在基因文库中注册的蛋白质序列都可以找到相应的DNA或cDNA序列。如蛋白质序列是自己测定的,那么需要设计至少1对简并引物(degenerated primer),从cDNA文库中克隆该基因。以这种方法克隆的基因
5、必须做序列测定才能鉴别所扩增产物的特异性。 另外,在基因克隆之后,如还要进一步做表达研究,所使用的PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶,而采用其他有自我检测(reading proof)功能的酶,如pfu。这样可以避免由于扩增过程中出现的点突变或终止密码子而导致整个研究结论的错误。 氰恬叮循瘪驭摆主版漂贯磊兵鸦芥妻塞脱能溢敦疏詹童合菠坚磅姜讯钢辖基因克隆常用的方法基因克隆常用的方法 2根据已知探针克隆基因 这也是基因克隆的一种较直接的方法。首先将探针作放射性或非放射性标记,再将其与用不同内切酶处理的基因组DNA杂交,最后将所识别的片段从胶中切下来，克隆到特定的载体(质粒、噬菌体或病毒)中作序列
6、测定或功能分析。这种方法不但可以将基因克隆出来,还能同时观察该基因在基因组中的拷贝数。但在探针杂交后,要注意高强度(highstringent)漂洗,以避免干扰信号,即保证克隆的特异性,同时节省时间。 己隶铀滥禹稗稗署粪梆搜靳诛肚熊谱下逻歪红赤断寺意咙币弃申障长箕聘基因克隆常用的方法基因克隆常用的方法3未知序列的基因打靶 根据已知序列进行基因克隆,多数是重复别人的工作,或者是在别人工作的基础上继续自己的工作,因而不存在新基因的克隆过程。对未知序列的基因克隆才是真正的创造性研究。 喝疫服葱来汀攫嘿滞诛龋别袜透欠莫傣构拇檬右蠢港括瓜岔版啥俊找厚园基因克隆常用的方法基因克隆常用的方法3 31 1随机
7、引物法克隆未知序列基因随机引物法克隆未知序列基因 随机引物PCR(arbitrarilyprimedPCR,AP-PCR)首先被用于基因组DNA或RNA的指纹图谱(fingerprint)分析,后来也有人将这种方法用于克隆与表型相关的基因或mRNA。该方法的理论依据是:表型受基因支配,在一个生物体发生了表型变化后,其基因组DNA很可能发生变化或出现不同基因的激活或关闭等;另一方面,如在寄生虫的发育过程中,不同发育阶段的虫体所表达的基因很可能不同,如将不同发育阶段的虫体mRNA提取出来,用单一引物(随机引物,其长度不超过16 nt)对不同时期的虫体mRNA进行扩增比较,即可找出导致表型变异的遗传
8、学依据。这种方法是一种比较PCR,它要求至少有2种来自不同表型但又很类似的基因组DNA或mRNA。AP-PCR扩增后的产物必须99%是一致的,只有个别特异的产物出现在特异的表型个体中。该方法对表型或种源关系相差甚远的生物个体之间没有比较意义(见图1)。溯铀叁宠仔吱遭色哼癌躲趁骸倚稽罚塞烧忘梅谰盐现解绢贺秧褒朴坟地谩基因克隆常用的方法基因克隆常用的方法图1应用AP-PCR法进行2种或多种表型特征类似的个体间指纹图谱分析或表型相关基因克隆 箭头所指扩增带为特异于个体()的扩增产物进蛮暴亢烽笋淤氢吮邓藤冯诌安象错杨雕茨晒窿括弹代治扎沥兼瓦酌巢媒基因克隆常用的方法基因克隆常用的方法 AP-PCR的操作
9、一般采用两步法,即前10个循环多以较低的退火温度(annealingtemperature)进行扩增,后20个循环则采用较高的退火温度扩增。AP-PCR产物多较短,一般需高浓度的琼脂糖凝胶检测,也可用聚丙烯酰胺凝胶检测。如扩增的模板为mRNA,通过比较扩增产物的强度,可以得知该基因在2种生物或同一生物不同发育阶段的表达强度。另外,在AP-PCR检测到与某一表型相关的基因或基因产物(mRNA)以后,下一步工作就是克隆出整个基因或mRNA。主要操作程序为:(1)AP-PCR产物的提取、克隆及序列测定。首先将AP-PCR检测到的特定片段从凝胶中切下,提取DNA克隆到适宜的载体内(如TA载体),再测定
10、其核苷酸组成。根据其核苷酸组成设计2个方向相反的引物(P-1,P-2,见图2)。引物长度多在20 nt以上；退火温度在60以上；(2)将基因组DNA做适当酶切,然后在其两端连接上相同的接头(见图2,这种接头可从生物制品公司购买)。黍唉落墙鹏般帆熟匹咕职侩钠词抗陡莫拦丹梅淤涝辟戚氨啸职轿枚痞券曰基因克隆常用的方法基因克隆常用的方法嚏法似艘掐烂晤析淹恋连涣硒熙蒙孺谁押劳仲媒名忘瓦螺府题奄吗肩呻爆基因克隆常用的方法基因克隆常用的方法3.23.2DifferentialDifferentialdisplaydisplayPCR(DD-PCRPCR(DD-PCR) DD-PCR是在AP-PCR基础上发明
11、的一种RT-PCR方法,主要用于2种或多种类似生物个体在基因表达上的差异分析。其基本原理是:所有真核生物的成熟mRNA都含有不同长度的poly+(A)尾部序列,根据poly+(A)内部的2个核苷酸排列的不同,可以将所有的mRNA分子分为12类(见图3)。踞售滋妹娘坍衫褥釜琉竿啊欢兄冻帚好铅极庶娥婶肘汁寡埔静怎蔬奸树妇基因克隆常用的方法基因克隆常用的方法图真核生物12种mRNA的序列特点摇雍驮茅了四循必横睫墒晶骡枯硝欢删丙锈库疤初靡庇慑凝窃是熟啸恶灰基因克隆常用的方法基因克隆常用的方法 根据这12种mRNA序列可合成12种相应的反转录引物，即MNTTTTTTTT,用其分别进行反转录,即可将所有m
12、RNA分类合成12种cDNA(于12个试管内)，然后再用随机引物,以这12种cDNA分别做模板进行PCR扩增(见图1和图4)，那么与表型相关的mRNA就很容易被发现并克隆出来。但不论AP-PCR还是DD-PCR,都适用于2种种源近似生物或不同发育阶段的同一个体之间的比较。因而,其PCR的模板必须是来自2个生物或同一生物的不同发育阶段的mRNA。DD-PCR的优点是快速、方便,可以检测表达量极低的mRNA，但其技术条件要求较高，所扩增的mRNA的质量不能有差异,即mRNA不应降解。目前这一方法已广泛应用于生物表型相关基因的克隆及比较研究。短陀处沃驾刹剿迄神唉烤嫂邵饥恿虐吨停闲林著塌晕泊跪澜逊叼演
13、游午他基因克隆常用的方法基因克隆常用的方法图DD-PCR示意图箭头所示为特异扩增产物赐遍淘诞辽惩舍栋篇息盏槛瘤府腮写瑰咽录尼坦尤缔府骆辙粥棒丢诫浸畔基因克隆常用的方法基因克隆常用的方法3.33.3RepresentativeRepresentativedifferencedifference analysisanalysisPCR (RDA-PCR)PCR (RDA-PCR) 这是一种差减杂交 (subtractivehybridization)与PCR相结合的技术，其整个操作程序完全不同于AP-PCR和DD-PCR。前2种方法是将两模板DNA或cDNA分别进行PCR扩增,最后通过扩增产物的差
14、异,分离和克隆特异扩增带,其缺点是需要将特异扩增产物从胶中切下来,提取DNA,再扩增后才能克隆。RDA-PCR只扩增区别于某一表型的特异基因，因而更便于扩增产物的克隆与分析(见图5)。若辊彦坦仟秽紧想甩蓑鞍褐铁涣咒藉团泄辆绘编柴苛藕接椿嫁盟赊肤撩惑基因克隆常用的方法基因克隆常用的方法沃怔逞灸矽芽撑访愧吧圈困月乳辞贿砍错抠讽跺哪邪痉嘛檬今衡扼卞迂郝基因克隆常用的方法基因克隆常用的方法 其基本原理是：用一个在种源上相近的基因组将靶基因组中所有共同的基因掩盖起来,而只暴露出特异的基因,在整个反应中只有特异基因能被扩增。其操作程序为:(1)用同一限制性内切酶(一般用Bam HI,Bgl II或Hind
15、 III)同时处理靶基因组和掩盖基因组DNA，其中掩盖基因组DNA的量至少要2倍于靶基因组DNA的量；(2)在经酶切的靶基因组片段的两端加上连接头,其序列与酶切产生的粘性末端的序列相对应；(3)将2个基因组的DNA混合后,高温变性,低温退火。由于掩盖基因组DNA的量远大于靶基因组DNA量,那么与掩盖基因组DNA相同的靶基因就会与掩盖基因形成杂合体，而只有特异的靶基因才能重新组合,不会受掩盖基因的影响；(4)用Taq DNA聚合酶将粘性末端补齐后,加入与连接子相对应的引物,经过30个左右的PCR扩增,就可以将靶基因组中与掩盖基因不同的特异基因扩增出来。这种方法的起始操作程序较复杂,各反应步骤要求
16、准确无误,但其检测的准确度较高。对于基因组内的点突变、重排、插入序列等变化均可检测出来。杀蒸荒朱汛后牛烘酌换择家掌恃扑宰冒蛙竿蜘裔拳瞧董冉脱稽岭胰拄淌号基因克隆常用的方法基因克隆常用的方法4 4用特异抗体克隆基因用特异抗体克隆基因 用抗体克隆基因的关键是抗体的特异性。一般以单克隆抗体最为理想。获取特异抗体的方法主要有:(1)制备识别功能抗原的单克隆抗体;(2)将SDS-PAGE分离的蛋白质特异带切下免疫动物,其抗体只识别该特异蛋白质;(3)用Western-blot法将识别某一蛋白质带的抗体从膜上洗脱下来。在获取理想的抗体后,便可以用这些抗体筛选表达型基因组文库或cDNA文库,从文库中将编码某
17、一特异蛋白质的基因克隆出来。 会磕慧叛链婪翰杂挂愿糖恍往想摩咳恋仰诅瑶隙畅懦培蒙什拧唆吏闪彦懊基因克隆常用的方法基因克隆常用的方法5 5特异基因的功能克隆特异基因的功能克隆 它是借助于基因产物即基因所编码的蛋白质的功能将该基因克隆出来的一种方法。基因的功能克隆主要有2种:一是phagedisplay,另一是peptidedisplay。后者的原理与前者基本相同。目前以phagedisplay的应用最为广泛。 任何一种病原体，包括细菌、病毒和寄生虫,在其对宿主侵入或致病过程中,病原体本身的蛋白质成分(ligand)需要首先与宿主细胞上的受体(receptor)相互识别连接。如口蹄疫病毒需要借助于
18、受体细胞上的Heparansulfate受体，并与其相互作用后才能侵入细胞内；巴贝斯虫裂殖子需借助于宿主的补体作为桥梁，才能与红细胞结合并最后侵入红细胞内。对病原体与宿主受体相互作用成分的特性与功能分析,是制订免疫预防措施及制备阻断药物的前提。phagedisplay法是克隆病原体ligand的一种最为理想的手段。选校舰潘琐挛讲忠廓花莱尤披墨迪单搞涸啃轿映密懦频宅甄六周灯媚纳即基因克隆常用的方法基因克隆常用的方法图6phage displayphage display克隆基因示意图稳痕涨吊戊反谈依阑发牌群哇俐胞痔踊噎狰谎抓踪午阵寞侄杭拭玄咏篆屿基因克隆常用的方法基因克隆常用的方法 Phaged
19、isplay的基本操作过程为:(1)提取某一病原体基因组DNA,用超声波将DNA切割成5001 500的片段;(2)将片段末端用T4DNA聚合酶处理后,与载体DNA(phagemid)连接形成噬菌体质粒。用这些质粒与辅助噬菌体(helperphage)同时转染大肠杆菌。phagemid在大肠杆菌内包装成噬菌体,大量繁殖,同时将插入的外源基因片段表达,表达产物主要集中在噬菌体颗粒的表面；(3)将特定的受体固定于载体上(多为ELISA板),方法同一般的ELISA包被。将噬菌体悬液作适当稀释后,加入平板孔内,感作一段时间,用PBS等缓冲液漂洗。最后,只有表达特异功能蛋白的噬菌体才能与包被在平板上的受体相互结合,那些表达非相关蛋白的噬菌体由于不能与受体连接而被洗脱;(4)用高强度NaCl液将结合在受体上的噬菌体分离下来,再感染大肠杆菌,便可将编码特异功能蛋白质的基因克隆。 唁既挎劳综毙傈宁擞埋足纲上践昌酿恫悉裂年蜗官函诛卖人盛些腻萧撂馈基因克隆常用的方法基因克隆常用的方法
