《DNA电泳实验步骤》由会员分享，可在线阅读，更多相关《DNA电泳实验步骤（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、DNA凝胶电泳凝胶电泳DNA agarose gel electrophoresis实验七实验七 琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(
2、ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNAIDNAocDNA 当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色，在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外，还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带，用于以后的克隆操作。 实验原理实验原理实验材料：实验材料：PCR产物产物,植物基因组植物基因组DNA,质粒质粒DNA等等，购买，购买 或自行提取纯化。或自行提取纯化。实验试剂：实验试剂：5TBE电泳缓冲液：电泳缓冲液： 6电电泳泳载载样样缓缓冲冲液液：0.
3、25 溴溴粉粉蓝蓝，40(w/v) 蔗蔗糖糖水水溶溶液，贮存于液，贮存于 4。 溴溴化化乙乙锭锭(EB)溶溶液液母母液液：将将EB配配制制成成10 mg/mL，用用铝铝箔箔或黑纸包裹容器或黑纸包裹容器,储于室温即可。储于室温即可。 实验材料和试剂实验材料和试剂微波炉微波炉实验仪器实验仪器凝胶电泳槽凝胶电泳槽凝胶成像凝胶成像系统系统实验步骤实验步骤1.取取5TBE缓缓冲冲液液20mL加加水水至至200mL，配配制制成成0.5TBE稀稀释释缓缓冲冲液液，待待用。用。 2.胶胶液液的的制制备备：称称取取0.4g琼琼脂脂糖糖，置置于于200mL锥锥形形瓶瓶中中，加加入入50mL 0.5TBE稀稀释释缓
4、缓冲冲液液，放放入入微微波波炉炉里里加加热热至至琼琼脂脂糖糖全全部部熔熔化化，取取出出摇摇匀匀，此此为为0.8琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶液液。加加热热过过程程中中要要不不时时摇摇动动，使使附附于于瓶瓶壁壁上上的的琼琼脂糖颗粒进入溶液。脂糖颗粒进入溶液。3.胶胶板板的的制制备备：将将有有机机玻玻璃璃胶胶槽槽两两端端分分别别用用橡橡皮皮膏膏紧紧密密封封住住。将将封封好好的的胶胶槽槽置置于于水水平平支支持持物物上上，插插上上样样品品梳梳子子，注注意意观观察察梳梳子子齿齿下下缘缘应应与与胶胶槽槽底底面面保保持持1mm左左右右的的间间隙隙。 向向冷冷却却至至50-60的的琼琼脂脂糖糖胶胶液液中中加加入入溴溴化
5、化乙乙锭锭(EB)溶溶液液使使其其终终浓浓度度为为0.5g /mL。用用移移液液器器吸吸取取少少量量融融化化的的琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶封封橡橡皮皮膏膏内内侧侧，待待琼琼脂脂糖糖溶溶液液凝凝固固后后将将剩剩余余的的琼琼脂脂糖糖小小心心地地倒倒入入胶胶槽槽内内，使使胶胶液液形形成成均均匀匀的的胶胶层层。待待胶胶完完全全凝凝固固后后拨拨出出梳梳子子，注注意意不不要要损损伤伤梳梳底底部部的的凝凝胶胶，然然后后向向槽槽内内加加入入0.5TBE稀稀释释缓缓冲冲液液至至液液面面恰恰好好没没过过胶板上表面。胶板上表面。 4.加加样样：取取10L DNA样样品品与与2L 6上上样样液液混混匀匀，用用微微量量移移液
6、液枪枪小小心心加加入入样样品品槽槽中中。若若DNA含含量量偏偏低低，则则可可依依上上述述比比例例增增加加上上样样量量，但但总总体体积积不不可可超超过过样样品品槽槽容容量量。每每加加完完一一个个样样品品要要更更换换tip头头，以以防防止止互互相相污污染染，注注意意上上样样时时要要小小心心操操作作，避避免免损损坏坏凝凝胶胶或或将将样样品品槽槽底底部部凝凝胶刺穿。胶刺穿。 5.电电泳泳：加加完完样样后后,合合上上电电泳泳槽槽盖盖，立立即即接接通通电电源源。控控制制电电压压保保持持在在60-80V，电电流流在在40mA以以上上。当当溴溴酚酚蓝蓝条条带带移移动动到到距距凝凝胶胶前前沿沿约约2cm时时，停
7、止电泳。停止电泳。6.染染色色：未未加加EB的的胶胶板板在在电电泳泳完完毕毕后后移移入入0.5g/mL的的EB溶溶液液中中，室室温温下染色下染色20-25min。 7.观观察察和和拍拍照照：在在波波长长为为254nm的的长长波波长长紫紫外外灯灯下下观观察察染染色色后后的的或或已已加加有有EB的电泳胶板。的电泳胶板。8. 琼琼脂脂糖糖通通常常用用水水平平装装置置在在强强度度和和方方向向恒恒定定的的电电场场下下电电泳泳。琼琼脂脂糖糖主主要要在在DNA制制备备电电泳泳中中作作为为一一种种固固体体支支持持基基质质，其其密密度度取取决决于于琼琼脂脂糖糖的的浓浓度度。在在电电场场中中，在在中中性性pH值值
8、下下带带负负电电荷荷的的DNA向向阳阳极极迁迁移移，其其迁迁移移速速率率由由下列多种因素决定：下列多种因素决定： 1、 DNA的分子大小的分子大小 2、 琼脂糖浓度琼脂糖浓度 3、 DNA分子的构象分子的构象 4、 电源电压电源电压 5、嵌入染料的存在、嵌入染料的存在 6、 离子强度影响离子强度影响 DNADNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带 1.EB是是强强诱诱变变剂剂并并有有中中等等毒毒性性，配配制制和和使使用用时时都都应应戴戴手手套套，并并且且不不要要把把EB洒洒到到桌桌面面或或地地面面上上。凡凡是是沾沾污污了了EB的的容容器器或或物物品品必必须须经经专专门门处处理理后后才才能能清清洗洗。沾沾染染了了EB的的垃垃圾圾要要专专门处理后才可丢弃。门处理后才可丢弃。2.当当EB太太多多, 胶胶染染色色过过深深，DNA带带看看不不清清时时，可可将将胶胶放放入入蒸蒸馏水冲泡，馏水冲泡，30min后再观察。后再观察。 3.制制备备凝凝胶胶时时，倒倒胶胶的的温温度度不不可可太太低低，否否则则凝凝固固不不均均匀匀：速速度也不可太快，否则容易出现气泡。度也不可太快，否则容易出现气泡。实验注意事项实验注意事项 琼脂糖凝胶电泳中琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率分子迁移率受哪些因素的影响？受哪些因素的影响？ 思考题思考题
