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1、第六章 蛋白质的结构和功能主要内容肌红蛋白和血红蛋白肌红蛋白和血红蛋白免疫球蛋白免疫球蛋白6.16.1、肌红蛋白和血红蛋白、肌红蛋白和血红蛋白肌红蛋白（肌红蛋白（myoglobinmyoglobin，MbMb）是哺乳动是哺乳动物细胞主要是肌细胞贮存和分配氧的蛋物细胞主要是肌细胞贮存和分配氧的蛋白质。白质。血红蛋白（血红蛋白（hemoglobinhemoglobin，HbHb）的主要功的主要功能是在血液中结合并转运氧气。能是在血液中结合并转运氧气。肌红蛋白的结构肌红蛋白的结构一级结构：有一级结构：有153153个氨基个氨基酸残基组成的多肽链，含酸残基组成的多肽链，含有一分子血红素辅基，分有一分子
2、血红素辅基，分子量子量16.716.7K K。 二级结构：八条二级结构：八条-右手右手螺旋（螺旋（A-HA-H），），中间由无中间由无规卷曲来连接。规卷曲来连接。三级结构：扁平的菱形，三级结构：扁平的菱形，属于球蛋白。属于球蛋白。 肌红蛋白与氧的结合肌红蛋白与氧的结合血红素非共价血红素非共价的结合于肌红的结合于肌红蛋白分子的疏蛋白分子的疏水空穴中。水空穴中。血红素分子结构血红素分子结构肌红蛋白与氧的结合肌红蛋白与氧的结合O O2 2的结合依赖于血红素分子上铁原子的价态。的结合依赖于血红素分子上铁原子的价态。血红素铁在第血红素铁在第5 5配位键与珠蛋白配位键与珠蛋白F8F8位位HisHis残基残
3、基（近侧组氨酸）（近侧组氨酸）上的咪唑上的咪唑N N结合。结合。肌红蛋白与氧的结合肌红蛋白与氧的结合氧结合部位是一个空间位阻区域。位阻的提供氧结合部位是一个空间位阻区域。位阻的提供者是者是E7 HisE7 His残基（远侧残基（远侧HisHis）MbMb和和HbHb多肽微环境的作用多肽微环境的作用固定血红素基。固定血红素基。保护血红素铁免遭氧化。保护血红素铁免遭氧化。为氧分子提供一个合适的结合部位。为氧分子提供一个合适的结合部位。氧的结合改变了肌红蛋白的构型氧的结合改变了肌红蛋白的构型肌红蛋白血红素与肌红蛋白血红素与氧结合后，铁原子氧结合后，铁原子从离卟啉环平面上从离卟啉环平面上方方0.055
4、0.055nmnm处，被处，被拉到离卟啉环平面拉到离卟啉环平面上方上方0.0260.026nmnm处。处。血红蛋白的结构血红蛋白的结构成人的血红蛋白是一个成人的血红蛋白是一个2 22 2四聚体蛋白。四聚体蛋白。和和亚基具有和肌红蛋白非常相似的构亚基具有和肌红蛋白非常相似的构象。象。血红蛋白是一个高对称性蛋白。血红蛋白是一个高对称性蛋白。Hb分子分子近似球形，近似球形，4个亚基占据相当于四面体的个亚基占据相当于四面体的4个顶角。个顶角。4个血红素基分别位于每个多个血红素基分别位于每个多肽链的肽链的E和和F螺旋之间的裂隙处，并暴露螺旋之间的裂隙处，并暴露在分子的表面。在分子的表面。氧结合引起的血红
5、蛋白构象变化氧结合引起的血红蛋白构象变化氧合作用显著改变血红蛋白的四级结构。氧合作用显著改变血红蛋白的四级结构。血红素铁血红素铁0.0390.039nmnm的微小位的微小位移导致血移导致血红蛋白构红蛋白构象的改变。象的改变。氧合血红蛋白和去氧血红蛋白代表不同的构象氧合血红蛋白和去氧血红蛋白代表不同的构象态。（态。（T态和态和R态）态）氧合导致稳定氧合导致稳定T态的离子键和盐桥的断裂，血态的离子键和盐桥的断裂，血红蛋白的氧结合过程是一协同过程。红蛋白的氧结合过程是一协同过程。血红蛋白结合氧的协同作用示意图血红蛋白结合氧的协同作用示意图MbMb和和HbHb的氧结合曲线的氧结合曲线H+H+、COCO
6、2 2和和BPGBPG对血红蛋白结合氧的影响对血红蛋白结合氧的影响血红蛋白与血红蛋白与O O2 2的结合受环境中其他分子的的结合受环境中其他分子的影响，如影响，如H+H+、COCO2 2和和BPGBPG等。虽然它们在蛋等。虽然它们在蛋白质分子上的结合部位离血红素基很远，白质分子上的结合部位离血红素基很远，但这些分子极大的影响血红蛋白的氧合性但这些分子极大的影响血红蛋白的氧合性质。这种空间上相隔的部位之间的相互作质。这种空间上相隔的部位之间的相互作用就是用就是别构效应（别构效应（allostericallosteric effect effect）。H+H+和和COCO2 2促进促进O O2 2
7、的释放（的释放（BohrBohr效应）效应）pHpH下降时，下降时，HbHb的的氧饱和曲线向右移动。这氧饱和曲线向右移动。这种种pHpH对血红蛋白对氧的亲和力的影响被称对血红蛋白对氧的亲和力的影响被称为为BohrBohr效应效应。BPGBPG降低降低HbHb对对O2O2的亲和力的亲和力BPGBPG是是HbHb的的一个重要一个重要别构效应物别构效应物。HbHb四聚体分四聚体分子只有一个子只有一个BPGBPG结合部位，位于由四个亚基缔结合部位，位于由四个亚基缔合形成的中央孔穴内。合形成的中央孔穴内。BPGBPG和两个和两个链之间的离子键有助于稳定去氧链之间的离子键有助于稳定去氧形式（形式（T T态
8、）的血红蛋白构象，促进氧的释放。态）的血红蛋白构象，促进氧的释放。人的某些生理性和病理性的缺氧可以通过红人的某些生理性和病理性的缺氧可以通过红细胞中细胞中BPGBPG浓度的改变来调节对组织的供氧量。浓度的改变来调节对组织的供氧量。胎儿红细胞中胎儿红细胞中Hb Hb F F与与BPGBPG结合力比结合力比Hb Hb A A弱，这弱，这有助于胎儿从母体获得有助于胎儿从母体获得O O2 2。H Hb b和和两两个个亚亚基基之之间间的的离离子子键键结结合合B BP PG G和和二二氧氧化化碳碳对对H Hb b氧氧合合曲曲线线的的影影响响BPG对Hb氧合曲线的影响胎胎儿儿和和成成人人的的血血红红蛋蛋白白
9、氧氧合合曲曲线线镰刀状细胞贫血是分子病镰刀状细胞贫血是分子病镰刀状细胞贫血病是血红蛋白分子突变引起的。镰刀状细胞血红蛋白可形成纤维状沉淀镰刀状细胞血红蛋白可形成纤维状沉淀6.26.2、免疫球蛋白、免疫球蛋白（ImmunoglobulinImmunoglobulin，IgIg）1 1、免疫球蛋白是指具有抗体、免疫球蛋白是指具有抗体（antibodyantibody）活性，或化学结构与抗体相活性，或化学结构与抗体相似的球蛋白。一般情况下，免疫球蛋白指似的球蛋白。一般情况下，免疫球蛋白指的就是抗体。的就是抗体。2 2、抗体具有两个显著特点：高度的特异、抗体具有两个显著特点：高度的特异性和庞大的多样性
10、。性和庞大的多样性。6.2.1、抗体的产生：、抗体的产生：免疫功能免疫功能外来物质外来物质( (抗原抗原) )在在T T细胞的协助细胞的协助下激活下激活B B细胞细胞B B细胞分化成细胞分化成记忆记忆B B细胞和细胞和浆细胞浆细胞浆细胞进浆细胞进一步发育一步发育成熟成熟成熟浆细胞成熟浆细胞合成并分泌合成并分泌特异性抗体特异性抗体6.2.2、免疫球蛋白的类别、免疫球蛋白的类别根据免疫根据免疫球蛋白分球蛋白分子结构的子结构的不同可分不同可分为为5 5类：类：IgGIgG、IgMIgM、IgAIgA、IgDIgD、IgEIgE。IgGIgG是血清中最丰富的免疫球蛋白。是血清中最丰富的免疫球蛋白。6.
11、2.3、IgG的结构的结构IgGIgG是呈是呈Y Y型结构的球蛋白。型结构的球蛋白。根据组成多肽链的大小可分为轻链（根据组成多肽链的大小可分为轻链（Light Light chain, Lchain, L）和重链（和重链（Heavy chain, HHeavy chain, H）根据根据L L链和链和H H链一级结构的序列同源性可分链一级结构的序列同源性可分为可变区（为可变区（Variable domain, VVariable domain, V）和恒定和恒定区（区（Constant domain, CConstant domain, C）轻链和重链轻链和重链 轻链：轻链：25KD25KD，
12、214214个个氨基酸氨基酸重链：重链：50KD50KD，450-450-570570个氨基酸个氨基酸二硫键HLGerald M. Edelman- -ssss- - -ssss- - -ssss- -IgGIgG巯基乙醇巯基乙醇+ +脲脲+ +37 37 ，PBPB可变区和恒定区可变区和恒定区可变区可变区 VL & VHVL & VH恒定区恒定区 CH1, CH2, CH3CH1, CH2, CH3铰链区铰链区VLVLCLCLVHVHCH1CH1CH2CH2CH3CH3 铰链区铰链区V VC1C1C2C2C3C3N NC CC C可变区又可进一步分为超变区（或称互可变区又可进一步分为超变区（
13、或称互补决定区）和骨架区。补决定区）和骨架区。由于富含由于富含ProPro，所以铰链区具有很强的柔所以铰链区具有很强的柔性。性。209Thr Lys Val Asp Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr HisArgLys215220Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val225230235240人人IgGIgG铰链区氨基酸序列铰链区氨基酸序列6.2.4、免疫球蛋白的功能、免疫球蛋白的功能1.识别抗原识别抗原2.效应功能效应功能 激活补体激活补体 结合细胞结合细胞 穿
14、过胎盘穿过胎盘VC1C2C3免疫球蛋白对抗原的识别免疫球蛋白对抗原的识别抗体的抗原结合部位与抗原决定簇在抗体的抗原结合部位与抗原决定簇在空空间结构上是互补的。间结构上是互补的。抗体的抗原结合部位与抗原决定簇分子抗体的抗原结合部位与抗原决定簇分子表面基团的相互作用，包括表面基团的相互作用，包括静电引力、静电引力、氢键、范德华力、疏水作用氢键、范德华力、疏水作用等。等。抗原与抗体的结合需要合适的抗原与抗体的结合需要合适的温度、温度、pHpH、缓冲体系缓冲体系，这种结合是可逆的。，这种结合是可逆的。激活补体激活补体：激活补体功能是抗体对微生物或靶细胞杀伤的主要机制之一。只有免疫球蛋白与抗原结合后，才
15、有激活补体的功能。结合细胞：结合细胞：免疫球蛋白的C3区存在可以和多种细胞（巨噬细胞、肥大细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞）的表面Fc受体结合的位点，从而发挥调理作用、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用、介导I型超敏反应等。CH1VLCLVHCH2 CH3介导介导I I型超敏反应型超敏反应6.2.56.2.5、多克隆抗体与单克隆抗体、多克隆抗体与单克隆抗体多克隆抗体是识别一个抗原的不同部分多克隆抗体是识别一个抗原的不同部分的多种抗体的混合物。的多种抗体的混合物。单克隆抗体单克隆抗体是由生长在是由生长在细胞培养物细胞培养物中的同一中的同一B B细胞的群体细胞的群体（一个克隆）（一个克隆）合成并分泌合成
16、并分泌的、均一的、的、均一的、识别同一抗识别同一抗原表位的抗原表位的抗体。体。6.2.66.2.6、基于免疫反应的生化分析方法、基于免疫反应的生化分析方法酶联免疫吸附测定（酶联免疫吸附测定（ELISAELISA）：以待测抗以待测抗原（或抗体）与酶标抗体（或抗原）的特原（或抗体）与酶标抗体（或抗原）的特异结合反应为基础，通过酶活力测定来确异结合反应为基础，通过酶活力测定来确定抗原（或抗体）含量。定抗原（或抗体）含量。因为结合了免疫反应和酶催化反应，所以因为结合了免疫反应和酶催化反应，所以是一种特异而又敏感的技术。是一种特异而又敏感的技术。酶标仪和酶标板酶标仪和酶标板基本原理基本原理先将已知的抗体
17、或抗原结合在某种固相裁体上，先将已知的抗体或抗原结合在某种固相裁体上，并保持其免疫活性。测定时，将待检标本和酶并保持其免疫活性。测定时，将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。用洗涤的方法分离抗的抗体或抗原发生反应。用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离成分。然后加入酶的作用原抗体复合物和游离成分。然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定量测定。底物催化显色，进行定性或定量测定。根据检测目的和操作步骤不同，有间接法、双根据检测目的和操作步骤不同，有间接法、双抗体夹心法、竞争法三种类型的常用方法。抗体夹心法、竞争法三种类
18、型的常用方法。ELISAELISA的基本类型的基本类型间接法。此法是测定抗体最常用的方法。将已间接法。此法是测定抗体最常用的方法。将已知抗原吸附于固相载体，加入待检标本知抗原吸附于固相载体，加入待检标本( (含相含相应抗体应抗体) )与之结合。洗涤后，加入酶标抗球蛋与之结合。洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体白抗体( (酶标抗抗体酶标抗抗体) )和底物进行测定。和底物进行测定。 ELISAELISA的基本类型的基本类型双抗体夹心法。此法常用于测定抗原双抗体夹心法。此法常用于测定抗原, , 将已知将已知抗体吸附于固相载体抗体吸附于固相载体, , 加入待检标本加入待检标本( (含相应含相应抗原抗原) )
19、与之结合。温育后洗涤，加入酶标抗体与之结合。温育后洗涤，加入酶标抗体和底物进行测定。和底物进行测定。ELISAELISA的基本类型的基本类型竞争法。此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可竞争法。此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。以测定抗原为例用于测定抗体。以测定抗原为例, , 将特异性抗体吸附将特异性抗体吸附于固相载体；加入待测抗原和一定量的酶标已知抗原，于固相载体；加入待测抗原和一定量的酶标已知抗原，使二者竞争与固相抗体结合；经过洗涤分离，最后结使二者竞争与固相抗体结合；经过洗涤分离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关。合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关。
20、免疫印迹测定（免疫印迹测定（Western blottingWestern blotting）是是一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效方法。一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效方法。将含有目标蛋白将含有目标蛋白( (抗原抗原) )的样品首先用电泳分的样品首先用电泳分离后，通过转移电泳转印至硝酸纤维素膜或离后，通过转移电泳转印至硝酸纤维素膜或其它膜的表面，然后将膜表面的蛋白质再用其它膜的表面，然后将膜表面的蛋白质再用抗原抗体反应进行特异性检测。抗原抗体反应进行特异性检测。Western blottingWestern blotting免疫亲和层析（免疫亲和层析（ImmunoaffinityImmunoa
21、ffinity chromatographychromatography）是利用抗原和抗体所具有的专一是利用抗原和抗体所具有的专一亲和力而设计的层析技术。抗原和抗体在一定条件亲和力而设计的层析技术。抗原和抗体在一定条件下能紧密结合成复合物，而这种结合又是可逆的，下能紧密结合成复合物，而这种结合又是可逆的，改变条件可将抗原抗体解离。当把抗原和抗体的一改变条件可将抗原抗体解离。当把抗原和抗体的一方方( (称配体称配体) )结合在惰性载体上使其固相化，另一方结合在惰性载体上使其固相化，另一方随流动相流经该载体，双方即结合为一整体。然后随流动相流经该载体，双方即结合为一整体。然后设法将它们解离，从而得到与配体有特异结合能力设法将它们解离，从而得到与配体有特异结合能力的某一特定的物质。的某一特定的物质。
