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1、单基因遗传病的研究单基因遗传病的研究策略策略宋书娟宋书娟医学遗传学系细胞楼医学遗传学系细胞楼304304电话：电话：如如如如果果果果一一一一种种种种遗遗遗遗传传传传病病病病的的的的发发发发病病病病仅仅仅仅仅仅仅仅涉涉涉涉及及及及到到到到一一一一个个个个基基基基因因因因，这这这这个个个个基基基基因因因因称称称称为为为为主主主主基基基基因因因因(major (major (major (major gene)gene)gene)gene)，其其其其导致的疾病称为单基因病。导致的疾病称为单基因病。导致的疾病称为单基因病。导致的疾病称为单基因病。单基因单基因遗传遗传病病单基因遗传病发病的复杂性单基因遗
2、传病发病的复杂性vv外显率：一定基因型个体表现出疾病表型的比例外显率：一定基因型个体表现出疾病表型的比例外显率：一定基因型个体表现出疾病表型的比例外显率：一定基因型个体表现出疾病表型的比例vv表现度：相同表现度：相同表现度：相同表现度：相同基因型不同个体在疾病表现程度的差异基因型不同个体在疾病表现程度的差异基因型不同个体在疾病表现程度的差异基因型不同个体在疾病表现程度的差异vv基因多效性：基因多效性：基因多效性：基因多效性：一个基因有多种生物学效一个基因有多种生物学效一个基因有多种生物学效一个基因有多种生物学效应应vv遗传异质性：遗传异质性：遗传异质性：遗传异质性：表型相似而基因型不同的表型相
3、似而基因型不同的表型相似而基因型不同的表型相似而基因型不同的现现象象象象vv从性遗传和限性遗传：从性遗传和限性遗传：从性遗传和限性遗传：从性遗传和限性遗传：常染色体上的基因在不同的性别常染色体上的基因在不同的性别常染色体上的基因在不同的性别常染色体上的基因在不同的性别有不同的表达程度和表达方式，从而造成男女性状分布有不同的表达程度和表达方式，从而造成男女性状分布有不同的表达程度和表达方式，从而造成男女性状分布有不同的表达程度和表达方式，从而造成男女性状分布上的差异上的差异上的差异上的差异vv遗传早现现象：遗传早现现象：遗传早现现象：遗传早现现象：疾病在世代中存在发病年龄逐渐提前或疾病在世代中存
4、在发病年龄逐渐提前或疾病在世代中存在发病年龄逐渐提前或疾病在世代中存在发病年龄逐渐提前或病情逐代加重的情况病情逐代加重的情况病情逐代加重的情况病情逐代加重的情况研究策略与方法研究策略与方法vv临床诊断、家系调查与材料收集临床诊断、家系调查与材料收集vv侯选基因的确定侯选基因的确定vv已知致病基因突变位点的确定已知致病基因突变位点的确定vv连锁分析与未知基因的基因定位连锁分析与未知基因的基因定位vv基因型与表现型相关性研究基因型与表现型相关性研究vv发病机制的研究发病机制的研究临床诊断、家系调查与材临床诊断、家系调查与材料收集料收集临床诊断临床诊断l l查阅相关资料，认识不同遗传病患查阅相关资料
5、，认识不同遗传病患者临床表现及其辅助诊断措施者临床表现及其辅助诊断措施l l临床诊断：症状和体征临床诊断：症状和体征l l常规辅助检测指标常规辅助检测指标l l特殊诊断指标特殊诊断指标家系调查与系谱分析家系调查与系谱分析l l调查家系三代以上所有相关成员的信息调查家系三代以上所有相关成员的信息调查家系三代以上所有相关成员的信息调查家系三代以上所有相关成员的信息l l根据调查资料，用系谱中常用的符号绘制成根据调查资料，用系谱中常用的符号绘制成根据调查资料，用系谱中常用的符号绘制成根据调查资料，用系谱中常用的符号绘制成系谱系谱系谱系谱l l系谱分析：区别遗传病与非遗传病系谱分析：区别遗传病与非遗传
6、病系谱分析：区别遗传病与非遗传病系谱分析：区别遗传病与非遗传病 区别单基因与多基因病区别单基因与多基因病区别单基因与多基因病区别单基因与多基因病 判断遗传方式判断遗传方式判断遗传方式判断遗传方式大家系大家系散发病例散发病例临床遗传病家系特点临床遗传病家系特点l l散发病例：对于遗传病，包括单基因遗散发病例：对于遗传病，包括单基因遗传病，多数病例表现为散发。传病，多数病例表现为散发。l l小家系病例：在有家族史的病例中，多小家系病例：在有家族史的病例中，多数也是小家系。数也是小家系。l l大家系病例：极少数家系发病个体多，大家系病例：极少数家系发病个体多，涉及涉及3-43-4代都有患者。代都有患
7、者。收集材料收集材料l l采集样品：采集样品：采集样品：采集样品： 外周血，颊粘膜脱落细胞，毛囊外周血，颊粘膜脱落细胞，毛囊, , 病人组织（如可以取材），病人组织（如可以取材）， 羊水（产前诊断）羊水（产前诊断）l l采集家系应做到尽可能完整采集家系应做到尽可能完整采集家系应做到尽可能完整采集家系应做到尽可能完整患者、同一家系中有相同遗传背景的患者、同一家系中有相同遗传背景的表型正常的其他个体、该家系中其他遗传背表型正常的其他个体、该家系中其他遗传背景的成员景的成员收集临床资料收集临床资料l l病人临床上一系列指标的检测l l保存相关信息和影象资料l l病人血清或组织的保存及其酶、病理或免疫
8、学研究侯选基因的确定侯选基因的确定文献检索文献检索数据库数据库v www.ncbi.nlm.nih.gov中的OMIM（Online Mendelian Inheritance in Man ）数据库中整合了目前已定位的单基因病的信息v 确定自己所研究家系的可能已知候选基因或已定位的染色体候选区域根据疾病名称检索根据疾病名称检索根据基因检索根据基因检索检索最新文献检索最新文献确定已知致病基因突变确定已知致病基因突变l l获得已知基因基因组序列获得已知基因基因组序列获得已知基因基因组序列获得已知基因基因组序列l l设计引物或参考文献中引物设计引物或参考文献中引物设计引物或参考文献中引物设计引物或
9、参考文献中引物l l根据文献，采用合适的技术方法进行基因根据文献，采用合适的技术方法进行基因根据文献，采用合适的技术方法进行基因根据文献，采用合适的技术方法进行基因突变分析（在后面课程中详细介绍）突变分析（在后面课程中详细介绍）突变分析（在后面课程中详细介绍）突变分析（在后面课程中详细介绍）从数据库中查阅目的基因从数据库中查阅目的基因的相关信息的相关信息 PCR-测序分析测序分析MFN2基因基因结结果果发现错义发现错义突突变变:c.281:c.281 GA,GA,其所在密其所在密码码子由子由CGGCGG变为变为CAG,CAG,导导致其致其编码编码氨基酸由精氨酸氨基酸由精氨酸变为变为谷氨谷氨酰酰
10、胺胺. .结论结论：经查阅经查阅文献文献资资料，料，c.281c.281 GAGA为为已知致病突已知致病突变变位点，可判断其位点，可判断其为该为该患者的致病突患者的致病突变变位点。位点。 l l根据变异导致的结果判断根据变异导致的结果判断根据变异导致的结果判断根据变异导致的结果判断l l根据突变数据库和文献资料根据突变数据库和文献资料根据突变数据库和文献资料根据突变数据库和文献资料l l排除已知排除已知排除已知排除已知SNPSNPSNPSNPl l根据家系共分离与否判断根据家系共分离与否判断根据家系共分离与否判断根据家系共分离与否判断l l在正常对照人群中分析在正常对照人群中分析在正常对照人群
11、中分析在正常对照人群中分析l l保守性分析保守性分析保守性分析保守性分析l l基因功能分析基因功能分析基因功能分析基因功能分析突变分析结果的判断突变分析结果的判断连锁分析与未知基因的连锁分析与未知基因的基因定位基因定位 利利用用被被定定位位的的基基因因与与在在同同一一染染色色体体上上另另一一遗遗传传座座位位相相连连锁锁的的特特点点，将将该该基基因因定定位位在在某某一一染色体或染色体某一区带上。染色体或染色体某一区带上。连锁分析连锁分析注：适于分析较大的遗传病家系，不适于注：适于分析较大的遗传病家系，不适于散发病例和小家系病例散发病例和小家系病例 连锁连锁 重组重组遗传标记遗传标记进进行行连连锁
12、锁分分析析时时需需要要的的一一些些已已知知遗遗传传位位点点，这这些些位位点点应应按按孟孟德德尔尔方方式式遗遗传传，且且具具有有多多态态性性以以便便显显示示连连锁锁关关系系，这这些些标标记位点称为记位点称为遗传标记遗传标记vvRFLP，STR, SNP连连锁锁分分析析结结果果连连锁锁分分析析结结果果基基因因定定位位：将将致致病病基基因因确确定定到到染染色色体体的实际位置的实际位置未知致病基因定位克隆研究未知致病基因定位克隆研究基因克隆基因克隆：确定致病：确定致病基因基因定位克隆定位克隆vv基本方法和步骤基本方法和步骤OO收收集集家家系系，选选择择遗遗传传标标记记进进行行连连锁锁分分析，对目的基因
13、作图定位析，对目的基因作图定位OO确确定定候候选选位位置置，对对目目的的基基因因进进行行精精细细定位定位OO从从候候选选基基因因中中确确定定正正确确的的基基因因 （二二代代测序技术）测序技术）例：一个例：一个X连锁肌肉病家系致病基因连锁肌肉病家系致病基因的定位克隆研究的定位克隆研究家系情况及前期研究基础家系情况及前期研究基础先证者先证者2 2临床表现近似临床表现近似DMDDMD排除了排除了DMD/EMD/FHL1DMD/EMD/FHL1基因突变基因突变研究策略研究策略SNPSNP芯片分芯片分析析精细定位精细定位分析分析基因查阅基因查阅外显子组外显子组测序测序全基因组全基因组9090万万个个SN
14、PSNP位点；位点；8 8例样本；例样本；商业公司完成商业公司完成选选 取取 数数 个个 SNPSNP点；点；增加增加3 3个成员个成员连连锁锁区区域域内内的的基基基基 因因因因 ： Map Map ViewerViewer；基基 因因 表表表表 达达达达 ：UniGeneUniGene数数 据据库及库及HGNCHGNC网站；网站；基基 因因 功功功功 能能能能 ：OMIMOMIM数据库数据库1 1例样本例样本(I2)(I2)；商业公司完成商业公司完成SNPSNPSNPSNP芯片数据分析芯片数据分析芯片数据分析芯片数据分析 连锁分析连锁分析连锁分析连锁分析 提示提示X X染色体有三段连锁区域：
15、染色体有三段连锁区域：单体型分析单体型分析单体型分析单体型分析GenemaplocusGRCh37.p5PrimaryAssembly(STS)Physicaldistance(Mb)GeneticDistance(cM)GeneticMap(Marshfield)(cM)Xp22.32-p22.25,761,897-12,538,7316.785.0715.42-20.49Xp21.2-p21.131,289,217-32,011,2660.720.5733.05-33.62Xq24-q27.2117,088,056-140,038,59422.9515.2670.80-86.06三段连锁区
16、域三段连锁区域三段连锁区域三段连锁区域精细定位分析精细定位分析精细定位分析精细定位分析将将将将Xp22.32-p22.2Xp22.32-p22.2Xp22.32-p22.2Xp22.32-p22.2连锁连锁连锁连锁区域区域区域区域由由由由6.78Mb 6.78Mb 6.78Mb 6.78Mb 缩短为缩短为缩短为缩短为4.18Mb4.18Mb4.18Mb4.18Mb 排除排除排除排除Xp21.2-p21.1Xp21.2-p21.1Xp21.2-p21.1Xp21.2-p21.1连连连连锁区域锁区域锁区域锁区域肯定肯定肯定肯定Xq24-q27.2Xq24-q27.2Xq24-q27.2Xq24-q
17、27.2连锁区域连锁区域连锁区域连锁区域最终确定两段连锁区域最终确定两段连锁区域最终确定两段连锁区域最终确定两段连锁区域GenemaplocusGRCh37.p5PrimaryAssembly(STS)Physicaldistance(Mb)GeneticDistance(cM)Marshfield(cM)Xp22.32-p22.25,761,897-9,946,6564.182.1015.42-17.52Xq24-q27.2117,088,056-140,038,59422.9515.2670.80-86.06连锁区域内包含的连锁区域内包含的连锁区域内包含的连锁区域内包含的基因基因基因基因X
18、p22.32-p22.2Xp22.32-p22.2Xp22.32-p22.2Xp22.32-p22.2连锁区域连锁区域连锁区域连锁区域共共2828个个基因基因：1414个个已知基因已知基因, ,1414个个预测基因预测基因1414个已知基因：个已知基因： 6 6个基因在肌肉组织中表达个基因在肌肉组织中表达 （3 3个基因表型已知，均个基因表型已知，均与肌肉与肌肉病病无关）无关） 7 7个基因不在肌肉组织表达个基因不在肌肉组织表达 1 1个基因表达情况未知个基因表达情况未知 Xq24-q27.2Xq24-q27.2Xq24-q27.2Xq24-q27.2连锁区域连锁区域连锁区域连锁区域共共272
19、272个个基因基因：122122个个已知基因已知基因, ,150150个个未知基因未知基因122122个已知基因：个已知基因： 79 79个个基因基因在肌肉组织在肌肉组织中中表达表达 （1818个基因表型个基因表型已知已知，其中其中包括前期已经排除包括前期已经排除的的FHL1FHL1基因）基因） 41 41个基因不在肌肉组织表达个基因不在肌肉组织表达 2 2个基因表达情况不清楚个基因表达情况不清楚外显子组测序外显子组测序外显子组测序外显子组测序平均覆盖度：平均覆盖度：23.823.8 ；覆盖度大于；覆盖度大于2020位点占位点占53.7%53.7%在上述在上述两两个个连锁连锁区域区域测序测序深
20、度深度均很均很低低对测序深度对测序深度2020的变异位点进行验证，结果均无变异的变异位点进行验证，结果均无变异存在的问题及解决办法存在的问题及解决办法存在的问题及解决办法存在的问题及解决办法本家系本家系患者患者未进行未进行肌肉活检肌肉活检将将进行多个样本进行多个样本的的外显子组测序外显子组测序Genotype和和Phenotype相关性研究相关性研究例：非综合征型先天缺牙的分子遗例：非综合征型先天缺牙的分子遗传学研究传学研究J Dent Res,J Dent Res, 2009; 88:126-131 2009; 88:126-131 Eur J Med Genet, Eur J Med Ge
21、net, 2008; 51: 536-546 2008; 51: 536-546 Eur J Med Genet Eur J Med Genet, 2011; 54: 377-382, 2011; 54: 377-382单基因遗传病发病机制的单基因遗传病发病机制的研究研究 隐性突变隐性突变往往导致失去功能（loss of function） 显性突变可导致获得功能（gain of function）和失去功能 失去功能：单倍剂量不足（halpoinsufficency） 获得功能：显性负效应（dominant negtive） 隐性突变和显性突变的致病机制隐性突变和显性突变的致病机制Gain
22、of function ： Loricrin基因突变获得核转位的新功能基因突变获得核转位的新功能 Br J Dermatol, 2008; 159:714-719 Loricrin 角皮病角皮病连锁分析与连锁分析与1q21区域连锁区域连锁发现发现Loricrin基因新突变基因新突变特殊的临床表现特殊的临床表现突变蛋白序列新功能的预测突变蛋白序列新功能的预测GFP表达载体的构建表达载体的构建细细胞胞亚亚定定位位分分析析动物模型动物模型l l过表达和基因敲除小鼠模型均表现正常表型l l转基因小鼠表现出与人类疾病相似的疾病表型，提示突变基因获得功能为其发病机制。基因敲除小鼠表型基本正常基因敲除小鼠表
23、型基本正常转基因小鼠表型与人类疾病相似转基因小鼠表型与人类疾病相似结结 论论 l lLoricrinLoricrinLoricrinLoricrin基因突变可引起新的疾病表型基因突变可引起新的疾病表型基因突变可引起新的疾病表型基因突变可引起新的疾病表型l lLoricrinLoricrinLoricrinLoricrin突变蛋白获得新功能，通过其核突变蛋白获得新功能，通过其核突变蛋白获得新功能，通过其核突变蛋白获得新功能，通过其核定位信号介导了突变蛋白的核转位定位信号介导了突变蛋白的核转位定位信号介导了突变蛋白的核转位定位信号介导了突变蛋白的核转位Haploinsufficiency ： PA
24、X6基因单倍剂量不足影响胰岛素成基因单倍剂量不足影响胰岛素成熟过程导致糖耐受异常熟过程导致糖耐受异常 Diabetologia. 2009; 52:504-13先天性无虹膜家系先天性无虹膜家系在该家系发现在该家系发现PAX6 突变突变(c.1080CT)导致单倍剂量不足导致单倍剂量不足 SSCP analysisDNA sequencingTon et al. Cell 67, 1991Ton et al. Cell 67, 1991PAX6 基因及其基因及其 cDNAEssential for the development of the eye & brainEssential for t
25、he development of the eye & brain homozygoushomozygous mutants mutants no no eyes, no brain, die eyes, no brain, die heterozygous mutants heterozygous mutants small eyes in mice small eyes in mice aniridia in humans aniridia in humansEssential for the development of pancreasEssential for the develop
26、ment of pancreas homozygoushomozygous mutants mutants abnormal pancreatic structureabnormal pancreatic structurePAX6的功能的功能Hill et al. Nature 354, 1991;St-Onge et al. Nature 387, 1997; Sander et al. Genes Dev 11,1997PAX6 在胰腺发育中的功能在胰腺发育中的功能Mansouri et al. TEM 10, 1999Dohrmann et al. Mech Dev 92, 2000
27、PAX6 在成体胰腺中的功能在成体胰腺中的功能Homozygous mice with conditional k/o PAX6 in Homozygous mice with conditional k/o PAX6 in the pancreas caused diabetesthe pancreas caused diabetesFour aniridia patients with PAX6 mutations Four aniridia patients with PAX6 mutations were reported to suffer from glucose intolera
28、nce were reported to suffer from glucose intolerance Ashery-Padan et al. Dev Biol 269, 2004Ashery-Padan et al. Dev Biol 269, 2004 Yasuda et al. Diabetes 51, 2002 Yasuda et al. Diabetes 51, 2002 假假 说说 PAX6 mutation?abnormal glucose homeostasisOGTTAnalysisintheAniridiaPedigreeIDIDAgeAgeBMIBMI(kg m(kg
29、m-2-2) )Glucose levels (mmol LGlucose levels (mmol L-1-1) )Clinical Clinical statusstatusAniridiaAniridiaGenotypeGenotype 0 0 120 120 -6-6-7-7-2-2-3-3-5-5-6-6-8-8-9-9-10-10-11-11-13-137070686850504343414133333030404038383636323217.5817.5820.2220.2217.8817.8820.8620.8621.1521.1520.4220.4220.9920.9920
30、.4320.4320.9620.9622.9322.9320.8320.834.554.554.084.084.864.865.255.253.693.694.274.274.914.916.056.055.275.277.747.744.664.668.048.0412.9912.9911.4111.418.658.657.807.806.626.625.885.8814.5714.579.789.7815.6115.617.317.31IGTIGTD DD DIGTIGTIGTIGTNGTNGTNGTNGTD DIGTIGTD DIGTIGT+ + + + + + + + + + + +m
31、/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/N-1-1-2-2-5-5-7-7-9-91717181811111616141419.4119.4120.3320.3315.2815.2819.4119.4116.1916.194.174.173.983.984.724.725.145.144.584.587.957.956.856.855.665.666.216.217.077.07IGTIGTNGT NGT NGTNGTNGTNGTNGTNGT+ + + + + +m/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm
32、/Nm/Nm/N-15-15-15-15-16-16-16-16-17-17-17-17-18-18-18-18-19-19-19-19-3-3-4-4-6-6-8-841413838343433333030151511117 7121219.9319.9321.1921.1922.3022.3020.4320.4322.8322.8317.3117.3115.4215.4215.0615.0616.5416.544.414.414.894.894.254.254.014.014.384.384.154.155.245.244.814.814.714.716.766.765.335.335.0
33、35.036.006.006.636.635.485.485.085.086.186.186.236.23NGTNGTNGTNGTNGTNGTNGTNGTNGTNGTNGTNGTNGTNGTNGTNGTNGTNGT- - - - - - - - - -N/NN/NN/NN/NN/NN/NN/NN/NN/NN/NN/NN/NN/NN/NN/NN/NN/NN/N 血糖和胰岛素水平血糖和胰岛素水平总结总结 1Aniridia caused by Aniridia caused by PAX6PAX6 gene mutation gene mutation PAX6PAX6 mutation caus
34、ed impaired glucose tolerance (IGT) mutation caused impaired glucose tolerance (IGT)PAX6PAX6-related IGT was associated with age -related IGT was associated with age 问问 题题Does IGT come from deficiency of insulin?Does IGT come from deficiency of insulin?Do these patients have insulin resistance?Do th
35、ese patients have insulin resistance?Do patients have a defect in insulin processing?Do patients have a defect in insulin processing? PAX6 Had No Effect on the Transcriptional Activity of the Insulin Promoter胰岛素耐受没有异常胰岛素耐受没有异常胰岛素原显著高胰岛素原显著高总结总结 2PAX6 PAX6 had no effect on the had no effect on the in
36、sulininsulin t transcriptionranscription IGT was not result from insulin resistanceIGT was not result from insulin resistanceIGT may come from a defect in insulin processingIGT may come from a defect in insulin processingPC1 的功能的功能Proinsulininsulinin Pancreas POMCACTHalpha-MSHin Hypothalamus Marcink
37、iewicz et al. Proc Natl Acad Sci 90, 1993 Naggert et al. Nature Genetics 10, 1995ACTH和和Alpha-MSH水平水平总结总结3 Deficiency of PC1 caused by Deficiency of PC1 caused by PAX6 PAX6 mutation was indicatedmutation was indicated假假 说说 PAX6 mutation?PC1deficiencyabnormal glucose homeostasisPAX6突变小鼠表现与人相符突变小鼠表现与人相符PAX6突变导致突变导致PC1缺乏缺乏可能的调控模型可能的调控模型Thank you!
