《分子生物学实验课：定量PCR-2015》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分子生物学实验课：定量PCR-2015（41页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、实时荧光定量实时荧光定量PCR原理及应用原理及应用普通普通PCRTime consumingPCR, 制胶, 上样, 泡胶, 染色, 软件分析实时定量实时定量PCR技术：技术：在在PCR反应体系中加入荧光基团，利用反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号荧光信号的变化实时检测的变化实时检测PCR扩增反应中扩增反应中每一个循环扩增每一个循环扩增产物量的变化产物量的变化，通过，通过Ct值和标准曲线的关系对值和标准曲线的关系对起起始模板始模板进行定量分析进行定量分析常规常规 PCR技术：技术：对对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对扩增反应实时检测无法
2、对扩增反应实时检测 ，无法对起始模板准确定无法对起始模板准确定量量i.e. 小量模板+过量的Taq和dNTPs在平台期的量与大量模板+不足量的Taq和dNTPs相差无几。荧光定量荧光定量PCR原理原理定义定义与普通与普通PCR的区别的区别普通PCR技术： 在PCR结束后对终点产物进行定量分析。实时定量PCR技术：实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量。Real time PCR定义定义传统传统PCR基础上加入荧光基团，利用荧光信号积累对基础上加入荧光基团，利用荧光信号积累对PCR反应的过程反应的过程进行实时监控进行实时监控目的目的对起始模板进行精确定量对起始模板进行精确定量优点优
3、点 灵敏度灵敏度, 精确度精确度, 重复性重复性, 动态范围动态范围应用应用 基因定量基因定量, 病原微生物侦测病原微生物侦测, GMO检测，检测，SNP分型等分型等荧光定量PCR常用概念Baseline(基线)：扩增曲线中的水平部分，在PCR开始几个循环内所发散的荧光信号，这段时间内定量PCR仪器还未能检测到PCR产物的扩增，缺省设置为3-15个循环的荧光信号。 （背景荧光信号)Baseline（基线）基线）荧光定量PCR常用概念Threshold(阈值)：用来确定Ct的荧光强度。是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是 基线（背景
4、）荧光信号的标准偏差的 10 倍。 Ct：到达阈值荧光信号所需要的循环数。Baseline（基线）基线）C(t)Threshold（阈值）阈值）Dissociation curve(融解曲线)：在使用SYBR Green染料进行实验，需要分析融解曲线，以识别不同的产物。原始数据：SYBR染料从双链产物解离染料从双链产物解离基线基线Tm(融解温度融解温度)：此温度有：此温度有50%的双链产物解链的双链产物解链SYBR Green与双链PCR产物结合后荧光越来越强，当PCR反应结束时，荧光强度达到最大，此时对PCR产物进行缓慢加热，在此过程中PCR产物按照Tm值的大小双链被依次打开，荧光强度也随着
5、双链的打开依次减弱。 Tm值时，核酸双链全部打开，荧光强度急剧降低SYBR染料的热淬灭染料的热淬灭荧光定量PCR常用概念Dissociation curve(融解曲线) 求导数据目的产物目的产物Tm(融解温度融解温度)荧光定量PCR常用概念Dissociation curve(融解曲线) 引物二聚体和非特异性扩增目的产物目的产物引物二聚体引物二聚体/非特异性扩增非特异性扩增SYBR Green 熔解曲线分析荧光化学原理荧光化学原理染料法：SYBR Green 探针法： TaqMan 分子信标 FRET1、SYBR Green 法SYBR Green 染料法染料法作用机理作用机理SYBR Gre
6、en 2、TaqMan探针法TaqMan探针PCR体系的建立 TaqMan探针法探针法工作机理工作机理热变性热变性引物和探针与模板退火引物和探针与模板退火延伸反应延伸反应探探探探针针针针报告基团报告基团报告基团报告基团淬灭基淬灭基淬灭基淬灭基团团团团探针探针探针探针DNADNADNADNA聚合聚合聚合聚合酶酶酶酶引物引物引物引物R RR RR RR R每扩增一条每扩增一条DNA分子，释分子，释放一个荧光信放一个荧光信号，可以在循号，可以在循环过程中任一环过程中任一点检测荧光点检测荧光TaqMan探针实时荧光定量实时荧光定量PCR的分类的分类几种方法的比较几种方法的比较方方 法法优点优点缺缺 点
7、点适适 用用 范范 围围SYBR Green 方法方法适用性广适用性广灵敏灵敏方便方便便宜便宜引物要求高引物要求高易出现非特异性易出现非特异性带带适合科研中对各种目的适合科研中对各种目的基因定量分析，基因表基因定量分析，基因表达量的研究，转基因重达量的研究，转基因重组动植物的研究组动植物的研究TaqMan 方方法法特异性高特异性高重复性好重复性好价格高价格高只适合特定目标只适合特定目标病原体检测，疾病耐药病原体检测，疾病耐药基因研究基因研究,药物疗效考核药物疗效考核,遗传疾病的诊断遗传疾病的诊断PCR反应反应XnX0 （1e）n*Xn：第：第n次循环后扩增产物数量次循环后扩增产物数量X0 ：起
8、始模板数量：起始模板数量n：扩增循环数：扩增循环数e：扩增效率扩增效率荧光定量荧光定量PCR原理原理CtCt值定量的数学原理值定量的数学原理理想的理想的PCR反应，扩增效率接近反应，扩增效率接近1在扩增产物达到荧光阈值时，所经历的循环数为在扩增产物达到荧光阈值时，所经历的循环数为CtXCtX0 （1e）CtM （1）*XCt ：在阈值设定以后，：在阈值设定以后，XCt是一个常数，可以用荧光强度表示的产物量，定为是一个常数，可以用荧光强度表示的产物量，定为M方程式（方程式（1）两边同取对数得：）两边同取对数得：LogMLogX0 *（1e）Ct （2）整理方程式（整理方程式（2）LogX0 Lo
9、g M Ct Log（1e）（3）荧光定量荧光定量PCR原理原理CtCt值定量的数学原理值定量的数学原理Cycle numberCk 104Ck 102SampleLog of DNA concentration0 起始模板量越多，荧起始模板量越多，荧光达到域值的循环数越光达到域值的循环数越少，即少，即Ct值越小。值越小。0 Log模板起始浓度与模板起始浓度与Ct值呈线性关系值呈线性关系，根据，根据样品样品Ct值，就可以计算值，就可以计算出样品中所含的模板量出样品中所含的模板量荧光定量荧光定量PCR原理原理CtCt值与模板起始量的关系值与模板起始量的关系LogX0 Log M Ct Log（1
10、e） Real-time PCR 方法应用方法应用Sample25绝对定量的定义绝对定量的定义0 Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品知起始拷贝数的标准品,可作出可作出标准曲线标准曲线,即得到该即得到该扩增反应存在的线性关系扩增反应存在的线性关系0 根据样品根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模值，就可以计算出样品中所含的模板量板量绝对定量分析绝对定量分析拷贝数计算拷贝数计算拷贝数（质量分子量）6.01023倍比梯度稀释法倍比梯度稀释法可用已知拷贝数的质粒DNA作为标准品，做系列稀释通常由5个点组成，使用的稀释系列最好每个梯
11、度选一个点.(1:10,1:100,1:1000,)绝对定量分析l R very close to 1(0.985)l Eff.应介于应介于90%110%；Eff.过小：抑制因素、引物条件过小：抑制因素、引物条件Eff.过大：加样错误、探针降解过大：加样错误、探针降解常见定量分析方法相对定量相对定量各样本间表达倍数差异分析相对定量分析相对定量分析管家基因管家基因：维持细胞基本代谢活动所必须的基因如-actin、GAPDH等纠正因取样量、RNA抽提、逆转录效率的不同引起的误差在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小内参定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量相对定量分析相对定量
12、分析对照样品：将各未知样本与对照样本进行比较，得出将各未知样本与对照样本进行比较，得出目的基因在各样本的相对表达水平目的基因在各样本的相对表达水平对照样本多取用未经处理的样本或是时间对照样本多取用未经处理的样本或是时间零点的样本零点的样本相对定量分析方法相对定量分析方法目的基因与内参基因的扩增效率是否相近(5%)?NOYESCt method双标准曲线法双标准曲线法 相对定量分析双标准曲线法: 目的基因与内参基因扩增效率不同目的基因与内参基因扩增效率不同相对定量分析双标准曲线法:相对定量分析 CT 法 前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100且偏差在且
13、偏差在 5以内以内 相对定量分析 实验步骤目的基因目的基因GAPDH样品做五个浓度稀释，做标准曲线样品做五个浓度稀释，做标准曲线DNA浓度测定0.025 ng/ul 质粒DNA 依次4倍稀释样本稀释：A样本：将稀释4倍 （取 4ul +12ul ddH2O ）B样本：将A样本稀释4倍（取A样本4ul +12ul ddH2O ）C样本：将B稀释4倍 （取B 4ul +12ul ddH2O ）D样本：将C样本稀释4倍（取C样本4ul +12ul ddH2OE样本：将D样本稀释4倍(不做)（取D样本4ul +12ul ddH2O 参比荧光按照不同品牌/型号Q-PCR仪稀释添加或不加TaKaRa QP
14、CR试剂盒质粒DNA 4ul QPCR mixture 10ul RoxII 0.4ul GAPDH引物（2uM) 2ul dd H20 3.6ul total 20ul步骤步骤:95 5min 95 5s 57 15s 40cycle熔点曲线95 1min57 30s95 30s 上机在做荧光定量实验时要注意些什么呢？为确保实验数据的有效性，每个样品都平行做2个复孔。 在操作中，应使用不含荧光物质的一次性手套（经常替换）、一次性移液器吸头（带滤嘴自卸式），并不能用手直接触摸毛细管、离心管吗底部。 操作台、移液器、离心机、PCR扩增仪等仪器设备应经常用10%次氯酸或75%乙醇擦拭消毒。每次实验前后用10%次氯酸和70%乙醇擦拭移液器、操作台。 配制反应体系时，应注意移液器的使用方法，所有的液体都要缓慢加至管底，不要加至管壁，所有液体的混匀要用振荡器进行，不能用移液器吹打，反应体系配制完毕后低速离心数秒，避免产生气泡。
