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1、烟草基因组中NBS类抗性基因的分析专 业 作 物 学答 辩 人 冷 晓 东指导教师 樊龙江教授综 述烟草是一种重要的经济作物，烟草行业一方面能够为国家增加税收，同时对发展国民经济和满足人民生活需要，都起了重大的作用。烟草作为模式植物，对于植物科学发展来说，无论是在基础研究还是在应用方面都起了很大作用，尤其是在遗传、育种、生理、生化以及采收后代谢方面。烟草也是研究植物病原互作最好的模式作物之一。抗性基因在植物与病原互作过程中，起到非常重要的作用。所以对抗性基因的研究，无论对植物本身，还是对指导育种都有非常重要的意义。在烟草基因组测序的背景下，我们对烟草抗性基因进行了一些基础性的研究。研究过程 烟
2、草基因组的分析 (基于TGI基因组序列) NBS类抗性基因的 生物信息学分析 烟草NBS类抗性基因 遗传多态性分析 NBS类抗性 与抗性基因连锁的 基因家族分析 SSR分子标记的开发 关于TGI（Tobacco Genome Initiative http:/tgi.ncsu.edu/） 数据类型数据类型条数条数/平均长度平均长度累计长度（累计长度（Mb）占基因组占基因组比例比例经甲基化筛选的克隆序列 1,082,523 (5 files) 682.2bp 738.5 16.4未经筛选的克隆序列 16885+25023=41908746.2+682.3bp 12.6+17.1=29.7 0.7
3、%BAC克隆末端序列 1628 360.7bp 0.587BAC序列 140,156 (93 BACs) 726.9bp 101.9 2.3合计 1,266,215 870.7 19.3拼接去冗余后信息数据类型数据类型序列条数序列条数/平均长度平均长度数数量量（Mb）占占基基因因组组比例比例覆覆盖盖功功能能基基因因（比例）（比例）&基基因因密密度度（个个/Mb）经甲基化筛选的克隆序列 465433 984.9bp458.4Mb10.22387（18.1）（包括BAC序列） 5.10未经筛选的克隆序列 10777+13912 927.8+926.1bp10.0+12.9=22.9Mb0.5% 2
4、0 0.87BAC克隆末端序列 647 432.1bp0.28Mb 1BAC序列（5X覆盖） 3,285 (92BACs) 3047.2bp35.7contigs per BACs; 108.7kb per BAC10.0Mb0.2 / / 合计 494054 491.2Mb 10.9% 2408(18.2%)所有数据来源 基因组序列：TGI EST序列：TGI Genebank ESTobacco (European Sequencing of Tobacco Project http:/www.estobacco.info/) TAB (Transcriptome Analysis of
5、BY-2， http:/mrg.psc.riken.go.jp/strc/) RGA（ Reistance gene analogue）的背景介绍IIIIIIIVVPKNBSLRRLZ/CCTIRTMPKPtoMi/PrfXa21Cf4/Cf9NNBSLRRLRRLRRTMRepresentative gene分析流程已知的NBS抗性基因同源序列搜索清理拼接基因预测蛋白预测寻找结构域系统发育树已知的NBS类抗性基因ClassmotifR genePlantPathigenAvr geneAccessionLZ-NBS-LRRCC NB-ARC LRR5RPS2Arabidopsis thali
6、anaPseudomonas syringae pv.tomato & maculicolaavrRpt2Q42484，P49597LZ-NBS-LRRTIR NB-ARC LRR9RPP1Arabidopsis thalianaPeranospora parasiticaAAC72979，LZ-NBS-LRRCC NB-ARC LRR2RPP8Arabidopsis thalianaPeranospora parasiticaAAC83165，LZ-NBS-LRRNB-ARCRPP13Arabidopsis thalianaPeranospora parasiticaQ9M667，T5118
7、5，AAF42832，LZ-NBS-LRRNB-ARC LRR5RPM1Arabidopsis thalianaPseudomonas syringae pv.maculitolaavrB,avrRpmlCAA61131TIR-NBS-LRRTIR NB-ARC LRR7RPS4Arabidopsis thalianaPseudomonas syringaeavrRps4CAB53785，TIR-NBS-LRRTIR NB-ARC LRR9RPP5Arabidopsis thalianaPeranospora parasiticaavrRp5AAF08790 LZ- NBS- LRRCC NB
8、-ARC LRR4RPS5Arabidopsis thalianaPseudomonas syringae,Peranospora parasiticaavrRphBQ8L3R3，NBS-LRRNB-ARCBs2Capsicum annuumXanthomonas campestris pv.resicatoriaavrBs2CAC32382, CC-NBS-LRRMla1Hordeum vulgareErysiphe graminis f.sp.hordeiAAG37356TIR-NBS-LRRTIR NB-ARCL6Linum usitatissimumMelampsora liniAL6
9、Q40253, Q40254TIR-NBS-LRRTIR NB-ARC LRR5MLinum usitatissimumMelampsora liniAMAAB47618,LZ-NBS-LRRNB-ARC LRR3Rx2Lycopersicon esculentumTomato virus XPVXCAB56299,LZ-NBS-LRRNB-ARCPrfLycopersicon esculentumPseudomanas syringae pv.tomatoavrPtoAAC49408LZ-NBS-LRRNB-ARC LRR2MiLycopersicon esculentumMeloidogy
10、ne javanicaunknownAAC67238,AAC67237,AAC32252NBS-LRRCC NB-ARC LRR11I2C-1Lycopersicon esculentumFusarium oxysporumunknownAAB63274NBS-LRRNB-ARCSw-5Lycopersicon esculentumTomato spotted silt virus(TSWV)AAG31013TIR-NBS-LRRTIR NB-ARC LRR8NNicotiana tabacumTobacco Masaic VirusTMVQ40392NBS-LRRCC NB-ARC LRR1
11、0XalOryza sativaXanthomonas oryzae pv.oryzaeavrXooO48647NBS-LRRNB-ARC2 LRR2PibOryza sativaMagnaporthe griseaBAA76281,NBS-LRRNBS-LRRPi-taOryza sativaMagnaporthe griseaAAK00132NBS-LRRCC NB-ARCCre3Triticum aestivumHeterodera avenaeAAC05834LZ-NBS-LRRRPP4 Arabidopsis thalianaAAM18462 LZ-NBS-LRRRPM1Arabid
12、opsis thalianaPseudomonas syringaeQ39214 CC-NBS-LRRI2Lycopersicon esculentumFusarium oxysporum f. sp. lycopersici race 2AAD27815NBS-LRRI2C-2Lycopersicon esculentumFusarium oxysporumunknownAAB63275I2C-3Lycopersicon esculentumFusarium oxysporumunknownAAB63276RVigna mungoAAQ75745Data SourceSpecies Cult
13、ivar/TypeSeq.No.(Mb)IntactPartial ClusterReads ClusterReads GenomeGenomeTGI DNAN.tabacumHicks broadleaf 1,441,358 (807.4) 30 2349 14 549ESTESTTGIN.tabacumHicks broadleaf 14,475 (7.6) 0 0 3 4ESTobaccoN.tabacumFlue-cured (K326), Burley (Burley 21 and TN86) 46,546 (30.4) 0 0 2 2TABN.tabacumBright-Yello
14、w No.2(BY-2 cells) 18,851 (9.3) 0 0 2 2烟草基因组中鉴定出的NBS类基因结果统计烟草基因组中30个NBS类基因的分类StructureNumberAverage CDS length (bp)No. with EST hits CC-NBS-LRR 11 2,779 8TIR-NBS-LRR 1 2,604 1TIR-NBS 2 1,536 1NBS-LRR 7 2,554 6NBS 9 1,612 1Total 30 2,288 16烟草和其他植物间NBS类基因的系统发育关系 蓝色，绿色，紫色和黄色分别代表烟草，拟南芥，番茄和杨树实验部分 PCR扩增产物
15、直接测序克隆测序遗传多态性分析基因家族系统进化分析30对引物24个材料本研究使用的烟草材料品种名称品种名称（野生（野生为物种名）物种名）杂交交组合合类型型黑黑胫病病青枯病青枯病根根结线虫虫病病CMV烟蚜烟蚜样品品类型型原原产地地长脖黄脖黄烤烟感病感病地方品种河南小黄金小黄金1025小黄金系选烤烟感病感病中感高感抗虫选育山东Speight G-28(Oxford 1-181Coker139)F4NC95烤烟中抗感病抗病抗虫国外美国红花大金元花大金元大金元系选烤烟中感感病中抗中抗高感选育云南云烟云烟87云烟2号K326烤烟中感中抗中抗选育云南大白筋大白筋599大白筋系选烤烟中感中感高感选育山东Co
16、ker176(Coker258(61-10Coker319)Coker258(Coker13959-84)(Coker258(61-10Coker319)Coker258(Coker13959-84)DWARF烤烟中抗中抗中抗中感高感国外美国N.repanda野生感病感病抗病国外墨西哥Coker371-Gold烤烟抗病国外美国净叶黄叶黄长脖黄系选烤烟中感感病中感抗病抗虫选育河南K326McNair225(McNair30NC95)烤烟中感感病中抗中感中抗国外美国T.I.245烤烟抗病国外美国Ambalema晒烟中感感病中抗感病高感国外美国Beinhart 1000-1雪茄抗病感病中感国外美国T
17、I 晒烟中抗感病感病感病高感国外国外Florida 301雪茄抗病感病感病国外美国C151Ti24575-81烤烟耐病选育广东N.plumbaginifolia野生抗病感病中感国外阿根廷Coker 86烤烟感病中抗抗病中抗感虫国外美国NC826129Coker319烤烟中感中感感病中感感虫国外美国K346烤烟抗病抗病抗病国外美国N.undulata野生国外秘鲁N.glutinosa野生感病中抗中感国外秘鲁N.sylvestris野生感病感病国外阿根廷北部Hicks(Broad Leaf)烤烟感病感病中感感虫国外美国香料国外土耳其Komotini Basma香料国外土耳其samsun白肋感病感病
18、感病国外阿尔巴尼亚burley 21白肋感病中感高感国外德国TN86白肋感病国外美国注：抗性等信息来自中国作物种质信息网（http:/）引物设计位点植物抗性基因结构和本研究引物设计位点。图中标出了NBS功能域三个主要基序和C-和N-端通常具有的功能域，箭头为本研究引物设计位点本研究设计的30对烟草RGA引物序号序号引物引物名称名称序列序列(5to3)碱基数碱基数1133_nbs_FTCTTCTTACTTCCCAATACCGTAG24133_nbs_RCCTTCATCACTTCCTCTTCATCC232141_nbs_FGATCGTTGACCAAATTTCCAAG22141_nbs_RCAACT
19、CTTGAGAACTTGCATGATG243147_nbs_FGCAATCCACAACTGAATGACTTG23147_nbs_RTGGAAAAGCAAATTGGTAGGC214148_nbs_FGGCAAATGCTTATAGCTATGCTC23148_nbs_RCAGAGGTACCAAAGATCCAGC215155_nbs_FTGGTAAACAAGAAACTAGAGGACC24155_nbs_RGACCATTAGCAATCCACAACTG226162_nbs_FGACATGTTGAAGATCACCCGG21162_nbs_RGCCTTTGTGACATGGTTTGAC217173_nbs_FA
20、TCAAGCACAGTCCGAACAAC21173_nbs_RCTCCTGAGCATTGTTGATAAGC228178_nbs_FCGATTCAACTATATCCATGCAACC24178_nbs_RCCCATTGCTTATCCTTCTAGTTTC249182_nbs_FAAGGCGCATGCAATATCGAGG21182_nbs_RTCATCCCACTGTGTTATGTCTTGG2410191_nbs_FCTGAAACCAATTATAGACATGCCC24191_nbs_RCACTGTGGTACAAAGTTCATTGG2311209_nbs_FGGTGATCCGATAAATGGTCATAAC
21、24209_nbs_RTTCTTGTCAGAGATCATGGTCTC2312224_nbs_FAGTGGTCGAGGTTGACTTAGTATC24224_nbs_RGGCTTAAGATGACATGGTAAATCC2413226_nbs_FGGCAATTCAAAACAAGCTCAAG22226_nbs_RTGCATTGGACATTAACCTCTG2114228_nbs_FGGAGAAGTTGGAAGGCACCAC21228_nbs_RCGGGAAGATCATTGTAGCTCAAC2315265_nbs_FCATGAAGATTCAACACAAAGGC22265_nbs_RCCCAAGTACATGC
22、AAACATTG2116267_nbs_FCAGCAAATTGGTTGTCTTGGC21267_nbs_RAACATCAACGCTGGTAATATGC2217270_nbs_FCTCCTAAGCATTTATCTGGATGAC2418271_nbs_FGTCCTCTCTGGTGCCTTGAG20271_nbs_RCACACGGTCCTCTAAAAATGC2119329_nbs_FGCTGAGCTGCTTAACAATTTCTTC24329_nbs_RCATCGACAGGATTTCTGGTTAC2220334_nbs_FAAGGAGAAGTTGGAAGGCACC21334_nbs_RGTAGCTCA
23、ACATTAACGCCGG2121345_nbs_FTCGAGGAACAGATTCTGTACATC23345_nbs_RCAATCCAATTTTCAGGTGTGAGTC2422358_nbs_FCTTCTTGTTGTGAACTCTCCCAG23358_nbs_RGGCTTGAGGTGATTAGATAGATGG2423359_nbs_FGAATCCAATCACAGACATGGTC22359_nbs_RCACTCTGGTACAAAGTTCTTTGG2324374_nbs_FCTCTATCATAGCCTTTGCGTCAC23374_nbs_RGAAGAAAACACCTGCAGTTGAC2225383
24、_nbs_FGCAATGCAATGAACACTGACATAG24383_nbs_RTCCACAACCATGTCAACTTTG2126390_nbs_FCAGCAACAACTTATTTACCTCCC23390_nbs_RCCACCCAAATTCTAATCAACG2127391_nbs_FTCAACAACTGACATGGACGTAG22391_nbs_RTACCTTCATGCTCTGCTCTCC2128410_nbs_FCTCTTTTGTATCGATTAGTCCCTC24410_nbs_RGGATCTGCCTATGTGTTAAACTTC2429414_nbs_FGCAATCTTCTCTCCCTTT
25、CCC21414_nbs_RTGGGCTCTAATCCATCATAACTG2330TGAACAAGTTGGGCCATGTA2030RGGTTCTCTTCGTTTCCCCTTA21基因基因栽培品种数栽培品种数野生种数野生种数NBS133212NBS14821NBS2709NBS16283NBS26581NBS39062NBS3916NBS305NBS15542NBS1913NBS41432NBS20942NBS22832NBS14741NBS35811NBS22421NBS4102NBS3832NBS1412合计11419PCR产物直接测序鉴定的烟草RGA基因 得到如下遗传多态性分析结论： 1、
26、栽培与野生烟草之间存在明显的遗传多态性基因基因位点位点栽培品种栽培品种数量数量长度度(bp)个数个数密度（个数密度（个数/Kb）SNPINDELSNPINDELNBS1332173036 8（75）49.3 11.0（102.7） NBS162887952 3（6）59.2 3.4（6.8） NBS390659723 038.5 0（0） NBS155482494 2（7）114.1 2.4（8.5） 平均值9.8757.551.3 3.3（22） 65.3 4.2（29.5）栽培烟草与其野生祖先种（N.sylvestris）之间的分子多态性注：括号中为累计长度（bp） 2、栽培烟草RGA基因
27、的遗传多态性表现出极端的同质性基因家族基因家族基因基因组特异克隆特异克隆克隆克隆测序序总数数NBS226Coker1761415HHDJY1621NBS271Shamxun1115HHDJY1833NBS173HHDJY1425NBS374HHDJY1323NBS329HHDJY1515NBS345HHDJY1515NBS359HHDJY1315NBS334HHDJY1315NBS267HHDJY1515NBS182HHDJY1515NBS178HHDJY测序中测序中合计172222克隆测序鉴定的烟草RGA基因家族 HHDJY:红花大金元烟草RGA基因亚家族的遗传分化与进化1 遗传分化分析 对
28、11个RGA家族内成员遗传分化程度进行了分析：对这些 RGA基因家族成员分别进行建系统进化树，根据树型，有些树分化程度明显较大（如NBS334），表明这些亚家族内部分化明显。A B CDE FGH基于RGA核苷酸序列和临接法（NJ）构建的烟草RGA基因4个亚家族的系统进化树。A: NBS226; B: NBS173; C: NBS271; D: NBS374; E: Nbs359; F: NBS182; G: NBS334; H: NBS267 2 进化分析 进一步对RGA亚家族选择进化进行分析。RGA基因进化历程可能是处于一种中性随机突变状况（M1a和M7模型）或受到正向或负向（又称净化）的
29、选择（M2a和M8模型）。根据Yang等（2005）方法(Yang et al., 2005)，我们可以估计烟草RGA基因亚家族成员的序列构成符合哪个进化模式。结果表明 在测验的8个RGA基因中，大多受到强烈的净化选择，同时部分基因在其个别位点上受到明显的正向选择。 烟草RGA基因亚家族进化选择测验（似然比）结果考虑到测序等误差，所选用的每个RGA亚家族成员间序列差异度1% (Couch et al., 2006)烟草基因组RGA基因的系统进化关系 通过PCR产物直接测序和克隆测序，共获得426条特异RGA基因序列，包括来自栽培烟草11个RGA家族的293条基因序列和19条野生烟草的基因序列。
30、经注释，除了部分由于移码、终止子等导致的假基因，其中绝大多数序列可以获得完整的NBS蛋白质序列。为了确定这些基因序列的系统进化关系和亚家族归属，我们对获得的所有序列和已知烟草和其他主要类型抗性基因进行了系统进化分析。从系统进化树可以看出，我们鉴定的烟草RGA几乎覆盖了所以类型的已知抗性类型，包括TIR-NBS类和大量非TIR-NBS类基因。非TIR-NBS类基因中，烟草中一个烟草亚家族（I2，红色部分）已进行一定数量的测序调查(Couch et al., 2006)，我们获得的数据也同样包含了这类RGA基因序列。同时，与已知抗性基因有较大差异的一批烟草RGA被发现，这部分RGA基因表现出烟草R
31、GA的特异性，其中部分可能是烟草特有的RGA。基于RGA蛋白质序列和临接法（NJ）构建的烟草RGA基因系统进化树图中包括本研究获得的烟草NBS类抗性基因（黑色）、GeneBank数据库中已有烟草RGA基因序列（红色）和目前已克隆抗性基因（其他颜色）。 烟草RGA类抗性基因SSR分子标记开发前期对烟草RGA基因进行了基因组分析，发现了一大批烟草RGA基因，遗传多态性分析结果表明，烟草RGA基因存在高度的遗传同质化，这给发现与抗性相关RGA增加了难度。为了探索获得与抗性相关RGA或相应标记的高效途径，本研究利用烟草基因组序列开发了与RGA紧密连锁的SSR标记。分子标记开发流程在基因组中查找含有RG
32、A区段的序列在其上下游寻找SSR序列设计引物23个烟草材料中进行PCR扩增用于开发烟草SSR标记的23个栽培烟草品种及其野生种基本信息序号序号品种名称品种名称类型型抗性抗性原原产地地黑黑青青根根CMV蚜蚜1小黄金1025烤烟山东2红花大金元烤烟-+-云南3K326烤烟-+-+美国4Hicks Broad Leaf烤烟-美国5301雪茄+-美国6（沙姆逊）白肋-阿尔巴尼亚7burley 21（白肋 21）白肋-德国8TN86白肋-美国9土耳其巴斯玛香料土耳其10N.undulata野生秘鲁11N.glutinosa野生-+-秘鲁12N.sylvestris野生-阿根廷13N.repanda野生-
33、+墨西哥14N.plumbaginifolia野生+-阿根廷15Ambalema晒烟-+-美国16TI 晒烟+-国外17Beinhart 1000-1雪茄+-美国18长脖黄烤烟-+河南19斯佩特 基-28烤烟+-美国20云烟87烤烟-+云南21Coker 176烤烟+-美国22C151烤烟O广东23NC82烤烟-美国注：黑：黑茎病；青：青枯病；根：根结线虫病；CMV:烟草花叶病毒病；蚜：烟蚜； -：感病；-：中感；-：高感。+：抗病；+：中抗。O：耐病。开发烟草中与RGA相关的SSR标记设计的引物引物名称引物名称正向引物（正向引物（FWD_PRIMER）反向引物（反向引物（REV_PRIMER
34、）重复基元重复基元目的片段（目的片段（bp）退火温度（退火温度（）TSN1001GGCCTGCATGAATAAAAGAAAGAACCTCCCATGAAGATTGTATGAACAGA15855TSN1002CAGAGGTTAAACCAACCCAAAATCACCCATGGAGGAATGGCTAGTAG16055TSN1003ATTGTTTTCACCCATGGAGGATTAGTCTGACGATCACTGAAAACACGTC13655TSN1004GTCCAATTAGAGGGGAGGGAACTACCTCCAGTGTCAACATCATCTACGGAA15355TSN1005CTAGACGGCACGACA
35、CTGTGTTAACAAACTCGATTCAGAACATGCAACTAT14855TSN1006CTGGCTTACCTCCATGAAGATTGTGCCTGCATGAATAAAGCAAGAAATCT13455TSN1007TCTTCCAAAAAGAGTACGCAATCACAGATGTTCAAACAAATACAGATGTCGAAT15355TSN1008GTGCGTAAGAAGTTGAGCTTACCCAGTTTTCTGGCATATGAGGAGGTGTA13655TSN1009ATCTCTCCTGTCAAGTGTGGGAAATCTTCGAGACCTGCACTTAGAAGGAG14555TSN1010
36、CGGGTACATTTTCTTGATTCAACTGCAACAAAATAGATAACTTACCACGTCAT23055TSN1011TTAAAATGTTGTTTCCTCATGATTTTTTTTTAAACACAAGACAATTGTACCCAAG14755TSN1012CAGCACAACGAAGATGAAGAAAATTTTGGGGAGTTTTATTTTATAAGGGATA15955TSN1013TTAACTGCTCGTCTCGTCAGTTTGTTCCTTATGCCACGTCACCTCTATTC14855TSN1014CATCACTATTTATCAAGTTAAACCGGAACTTGTGTCCAAGTG
37、GTGTAGTTTAGTTAT15855TSN1015AGTAGGTTTGTGTACAACTGTCAATAGCATCGAATACCGAAGTACCAAATCATA15955TSN1016GCATCCTCTCAAGCCCTTTTTAATGGTTTGGTTTTGTCCATGAGTAGGTC13055TSN1017TTTCAAATAGCAGTAGCATTTCATCATGTCCAAACAACATTCATTTTATTCATCT14355TSN1018CCCCAAACCCCTAAAACCCTGGTTTCGGGTTTCGGGTTACAAACCCG20155TSN1019AACACTGAGTCCATGTCAT
38、CATCATTCCCCTATCATTCAAGACTTCGTTCT15155TSN1020ACTAGTTGTGTGAAGGGGATGTGATTCTGAAGGTCAAGGGCTAGATTGAGA12255TSN1021AGGTCTAGCTCAGAATGCACAATGAATCATATACACACATGGCACAGGAAT13155TSN1022TAAGAAAGAAGACAACGACGACGACGGAGTAGGGGCAAGATCTATGTAACA11555TSN1023CTTTTGGGCTCTCTTCTCTCATTGCACATAAGCTCATTGGATTTGCAGTTC13755TSN1024GTTT
39、TTGGTGAGGTGCTTTCAGATCCAATTCCAACATCATCACATAATAAAGT14755TSN1025CATGGACCAAGTAAATCACTGTCGTCAACAATGCTTTTCGATTCATTCCT15955TSN1026CCAATGGACTTCAACATAAAGCAAGTGAAAGTCCCATTTGGATCTTCTTGA10955TSN1027TAAGGTCAATGGTTAAAGCGTCGTTAAACCCAAATCTCTCTGACCCCTGA8655TSN1028AGTGCTGATAGAAGGAATGGCTTGGCCCAGTTCTGATTACCAGAGAGAGTAT1
40、3655TSN1029ATAAATGCTCTTGTCGTTTATTTCTTTTTTCCACTCTCTTCTTTACACCACAAT15555TSN1030ATGGCCATTTCTTTGGTTTTGAACTACTCTACCCAAATCGCTCCTCAACT12655TSN1031AAACCTTTTCAGAAACAGTGCCAGCTGAGGAACTTTGAACCACTCGATTTC15355TSN1032ACTTGTGGGACTACACTGGGTTTGCTTTTAAATCCAAGGTCAACGGGTGTT14755TSN1033TGTAGAGGAATTGGTTGATGGACATTCTGCAGAGG
41、CTGAATACATGAGCTG11455 引物名称引物名称正向引物正向引物（FWD_PRIMER）反向引物反向引物（REV_PRIMER）重复重复基元基元目的片段目的片段（bp）退火温度退火温度（）TSN1001ACATAAACAAAATGCGACTGGATTGGGAAACCAGACTGA30950TSN1002GAACAAAGGCTTGAGAATCCATGGAGGAATGGCTAGAG20955TSN1003TAGCCTTGACATAGCAGAAACACGAATACTCAGACATC21850TSN1004AATTAGAGGGGAGGGAACTCGTCTCCAAGGGTAGGTCGAA12
42、755TSN1005AATCAGTTAGTTAGGACGGTAATAGGTGAAAGGGGAGTCTAT22450TSN1006ATTGGGAAACCAGACTTAATTTGAATGTGGGCGAGACT15650TSN1007GTATGCCTGAAAACCAAATCCGGATTCCTATTCTACAAT23250TSN1008CACAGCAAATGACAAATCCATCTACTTTAGTCCCTCATA13050TSN1009TACGGGACCAGTAAACACTTCGAGACCTGCACTTAGAG18750TSN1012CAGCACAACGAAGATGAATGGAGATTGTTGGGCT
43、TATA20050引物引物名称名称正向引物正向引物（FWD_PRIMER）反向引物反向引物（REV_PRIMER）条条带数数TSN1004GTCCAATTAGAGGGGAGGGAACTACCTCCAGTGTCAACATCATCTACG3TSN1005AATCAGTTAGTTAGGACGGTAATAGGTGAAAGGGGAGT1TSN1006CTGGCTTACCTCCATGAAGATTGTGCCTGCATGAATAAAGCAAGAAAT3TSN1007GTATGCCTGAAAACCAAATCCGGATTCCTATTCTAC1TSN1010CGGGTACATTTTCTTGATTCAACTGCAAC
44、AAAATAGATAACTTACCACGTC2TSN1016GCATCCTCTCAAGCCCTTTTTAATGGTTTGGTTTTGTCCATGAGTAGG1TSN1022TAAGAAAGAAGACAACGACGACGACGGAGTAGGGGCAAGATCTATGTA3TSN1028AGTGCTGATAGAAGGAATGGCTTGGCCCAGTTCTGATTACCAGAGAGA1 开发的与RGA基因相关的SSR标记列表讨论： 1、实验结果表明，在设计的43对引物中，能够用于 分子标记的引物有8对，NBS连锁的SSR标记的开发 效率达到近20%,是一种开发抗性基因分子标记的 有效途径。 2、由于烟草抗性基因极端同质化，作为与抗性基因 连锁的分子标记,对研究烟草抗性基因的多态性提 供新了的途径。 致 谢 ！
