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1、多克隆抗体的制备及抗体活性测定 2021/6/161主要内容主要内容多克隆抗体制备的基本原理多克隆抗体制备的基本原理多克隆抗体制备的操作步骤多克隆抗体制备的操作步骤抗体活性的实验原理、操作流程和结果判断抗体活性的实验原理、操作流程和结果判断2021/6/162原原 理理1、克隆克隆(clone)： 是指无性繁殖是指无性繁殖细胞系，由胞系，由单一个祖先一个祖先细胞胞分裂繁殖而形成的一簇分裂繁殖而形成的一簇细胞系。在胞系。在这个家族的所有成个家族的所有成员中，中，如无如无发生突生突变其基因是完全相同的。其基因是完全相同的。2、多克隆抗体（、多克隆抗体（polyclonal antibody, pA
2、b）：用一种包含多）：用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激机体物，可刺激机体多个多个B细胞克胞克隆隆产生生针对多种抗原表位多种抗原表位的不同抗体。所的不同抗体。所获得的免疫血清得的免疫血清实际上是含有上是含有多种抗体的混合物，即多克隆抗体多种抗体的混合物，即多克隆抗体。3、单克隆抗体（、单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAb）：由一个）：由一个识别一种抗原表位识别一种抗原表位的的B细胞克隆产生的同源抗体。高度均细胞克隆产生的同源抗体。高度均一、特异性强、效价高、少或无交叉反应性。一、特异性强、效价高、少或无交叉反应性。2021/6/16
3、3第一代抗体是传统的抗体制备方法即利用抗原免疫动物第一代抗体是传统的抗体制备方法即利用抗原免疫动物后获得抗体，称为多克隆抗体（后获得抗体，称为多克隆抗体（polyclonal antibody）；）；第二代抗体是通过杂交瘤技术制备出针对抗原中某一抗第二代抗体是通过杂交瘤技术制备出针对抗原中某一抗原决定簇的抗体称为单克隆抗体原决定簇的抗体称为单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb)；第三代抗体是利用基因工程技术制备而来，称为基因工第三代抗体是利用基因工程技术制备而来，称为基因工程抗体程抗体(genetic engineering antibody)。抗体发展历史抗体发展历
4、史2021/6/164 多克隆抗体制备流程多克隆抗体制备流程免疫原的制备免疫原的制备免疫动物免疫动物免疫血清的收集免疫血清的收集免疫血清的鉴定免疫血清的鉴定免疫血清的保存免疫血清的保存2021/6/165 免疫原（免疫原（immunogen）： 指能刺激机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞指能刺激机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞 的抗原最重要的性质是的抗原最重要的性质是免疫原性（免疫原性（immunogenicity）. 免疫原种类：免疫原种类： 天然抗原、人工合成抗原；天然抗原、人工合成抗原； 蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原。蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原。 免疫原的制备免疫原的制备
5、2021/6/166 细胞性抗原制备：细胞性抗原制备： 绵羊红细胞（绵羊红细胞（SRBC）- 溶血素；溶血素； 细菌细菌- 抗菌抗体（动物免疫血清）。抗菌抗体（动物免疫血清）。 可溶性抗原制备：可溶性抗原制备： 指蛋白质、多糖和脂类等。指蛋白质、多糖和脂类等。2021/6/167细胞破碎细胞破碎反复冻融法反复冻融法超声破碎法超声破碎法自溶法自溶法酶处理法酶处理法表面活性剂处理法表面活性剂处理法2021/6/168 超速离心分离超速离心分离： 是一种根据分离物质的比重特点，通过差速或梯度密是一种根据分离物质的比重特点，通过差速或梯度密 度离心，将分子大小不同的抗原颗粒分开的方法，只度离心，将分子
6、大小不同的抗原颗粒分开的方法，只 适宜少数大分子物质的分离。适宜少数大分子物质的分离。 选择性沉淀：选择性沉淀： 选择某抗原理化特性，采用相应沉淀剂或溶液环境，选择某抗原理化特性，采用相应沉淀剂或溶液环境， 如：如： 核酸去除核酸去除 盐析沉淀法盐析沉淀法 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 高分子聚合物沉淀法高分子聚合物沉淀法 50% 50%饱和硫酸铵盐溶液可沉淀析出血清球蛋白；饱和硫酸铵盐溶液可沉淀析出血清球蛋白； 8% 8%12%PEG600012%PEG6000可沉淀可沉淀IgGIgG。粗分离粗分离2021/6/169 超滤法：超滤法： 利用孔径大小不同的特制薄膜对不同分子大小的抗原利用孔径
7、大小不同的特制薄膜对不同分子大小的抗原物质进行滤筛。物质进行滤筛。 电泳电泳2021/6/1610精分离精分离 层析法：层析法： 凝胶过滤层析凝胶过滤层析 离子交换层析离子交换层析 亲和层析亲和层析 疏水层析疏水层析 反相层析反相层析2021/6/1611 鉴定纯化蛋白的含量、相对分子的质量、纯度以及鉴定纯化蛋白的含量、相对分子的质量、纯度以及免疫学活性。免疫学活性。蛋白含量蛋白含量凯氏定氮（紫外光凯氏定氮（紫外光280nm等），等），Lowry分子质量分子质量电泳、质谱电泳、质谱蛋白纯度蛋白纯度电泳、电泳、HPLC免疫原性免疫原性免疫印迹免疫印迹 、免疫双扩散、免疫组化、免疫双扩散、免疫组化
8、蛋白活性蛋白活性 ELISA、XTT蛋白结构蛋白结构红外光谱、氨基酸测序红外光谱、氨基酸测序蛋白等电点蛋白等电点IEF蛋白鉴定蛋白鉴定2021/6/1612免疫佐剂免疫佐剂 某些物质与抗原一起或先于抗原注入机体，可增某些物质与抗原一起或先于抗原注入机体，可增强机体对该抗原的特异性免疫应答或改变免疫应强机体对该抗原的特异性免疫应答或改变免疫应答类型，此类物质称为答类型，此类物质称为免疫佐剂免疫佐剂(immunoadjuvant)，简称佐剂。，简称佐剂。 2021/6/1613佐剂的种类佐剂的种类佐剂一般包括以下几类：佐剂一般包括以下几类： 无机佐剂：无机佐剂：如氢氧化铝、明钒等；如氢氧化铝、明钒
9、等； 生物性佐剂：生物性佐剂：如结核分枝杆菌、卡介苗、小棒状杆菌、百日如结核分枝杆菌、卡介苗、小棒状杆菌、百日咳杆菌、革兰阴性杆菌内毒素、霍乱毒素的咳杆菌、革兰阴性杆菌内毒素、霍乱毒素的B B亚单位、胞壁酰亚单位、胞壁酰二肽和细胞因子等；二肽和细胞因子等； 人工合成佐剂：人工合成佐剂：如双链多聚肌苷酸：胞苷酸（如双链多聚肌苷酸：胞苷酸（poly Ipoly I：C C）、）、双链多聚腺苷酸：尿苷酸（双链多聚腺苷酸：尿苷酸（poly Apoly A：U U）；油剂：如弗氏完全）；油剂：如弗氏完全佐剂、花生油乳剂等；佐剂、花生油乳剂等； 纳米佐剂纳米佐剂 2021/6/1614弗氏佐剂（弗氏佐剂（
10、Freunds adjuvant）分为弗氏不完全佐剂和完全佐剂两种：分为弗氏不完全佐剂和完全佐剂两种： 前者是由油剂（矿物油或花生油）和乳化剂（羊毛脂前者是由油剂（矿物油或花生油）和乳化剂（羊毛脂或吐温或吐温-80）按）按1：11：5比例混合而成；比例混合而成； 后者由弗氏不完全佐剂加卡介苗组成。在免疫动物时，后者由弗氏不完全佐剂加卡介苗组成。在免疫动物时，先将弗氏佐剂与抗原等比混匀，制成先将弗氏佐剂与抗原等比混匀，制成“油包水油包水”乳化乳化液。液。 2021/6/1615 佐剂与抗原混合乳化的方法：佐剂与抗原混合乳化的方法： 研磨法研磨法 搅拌混合法搅拌混合法2021/6/1616 佐剂的
11、免疫生物学作用佐剂的免疫生物学作用 增增强强抗原免疫原性：使无或微弱免疫原性的物抗原免疫原性：使无或微弱免疫原性的物质变成持成持久或久或强强的免疫原；的免疫原； 增增强强机体机体对抗原刺激的反抗原刺激的反应性，提高初次性，提高初次应答和再次答和再次应答所答所产生的抗体滴度；生的抗体滴度； 改改变抗体抗体类型，使型，使产生抗体由生抗体由IgM型型转变为IgG型；型； 引起或增引起或增强强迟发性超敏反性超敏反应。2021/6/1617佐剂的作用机制佐剂的作用机制佐剂的作用机制归纳起来主要有如下几种：佐剂的作用机制归纳起来主要有如下几种： 可增强抗原的表面积和改变抗原活性基团构型，从而增强可增强抗原
12、的表面积和改变抗原活性基团构型，从而增强 抗原的免疫原性。抗原的免疫原性。 佐剂与抗原混合一起注入机体，可改变抗原的物理性状，佐剂与抗原混合一起注入机体，可改变抗原的物理性状，形成抗原储存库，延长抗原在局部组织的滞留时间，有利于形成抗原储存库，延长抗原在局部组织的滞留时间，有利于抗原的缓慢释放。抗原的缓慢释放。 增强吞噬细胞的吞噬作用（被佐剂吸附的抗原易被吞噬细增强吞噬细胞的吞噬作用（被佐剂吸附的抗原易被吞噬细胞吞噬），促进对抗原的处理，刺激淋巴细胞增生，从而增胞吞噬），促进对抗原的处理，刺激淋巴细胞增生，从而增强和扩大免疫应答的效应。强和扩大免疫应答的效应。 2021/6/1618动物免疫物
13、免疫免疫动物的选择：免疫动物的选择： 抗原来源与动物种属的关系：抗原的来源与免疫动物种抗原来源与动物种属的关系：抗原的来源与免疫动物种属差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越好，而同种系属差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越好，而同种系或亲缘关系越近，免疫效果越差。或亲缘关系越近，免疫效果越差。 动物个体的选择：适龄、健康、体重符合要求的正常动物个体的选择：适龄、健康、体重符合要求的正常动物（以雄性为佳）；抗体需要量少时，选用家兔、豚鼠动物（以雄性为佳）；抗体需要量少时，选用家兔、豚鼠和鸡等小动物；抗体需要量大时，可选用绵羊、山羊、马、和鸡等小动物；抗体需要量大时，可选用绵羊、山羊、马、驴等大动
14、物。驴等大动物。2021/6/1619 免疫方法免疫方法 选定动物后，在免疫过程中应考虑免疫剂量、免疫途径、选定动物后，在免疫过程中应考虑免疫剂量、免疫途径、免疫次数、免疫间隔等因素。免疫次数、免疫间隔等因素。 免疫原的剂量：免疫原的接种剂量按免疫原性的强弱、免疫原的剂量：免疫原的接种剂量按免疫原性的强弱、动物的个体状态和免疫时间来确定。首次免疫时，剂量不宜动物的个体状态和免疫时间来确定。首次免疫时，剂量不宜过大，以免产生免疫麻痹。过大，以免产生免疫麻痹。 免疫途径通常有皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴免疫途径通常有皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴 结结等，视不同的免疫方案而异。对于不易获
15、取的宝贵抗原可采等，视不同的免疫方案而异。对于不易获取的宝贵抗原可采用淋巴结免疫法。用淋巴结免疫法。免疫免疫间隔隔时间是影响抗体是影响抗体产生的重要因素，其中首次与第二生的重要因素，其中首次与第二次免疫的次免疫的间隔隔时间尤尤为重要，一般以重要，一般以1020天天为佳，二次后佳，二次后间隔隔时间一般一般为710天，若天，若间隔隔时间太太长，则刺激减弱，刺激减弱，抗体效价不高。抗体效价不高。 2021/6/1620动物采血物采血 采集免疫血清前，要预先测试抗体效价测定，若效价达到采集免疫血清前，要预先测试抗体效价测定，若效价达到要求，应在末次免疫后一周及时采血，否则抗体效价会下降。要求，应在末次
16、免疫后一周及时采血，否则抗体效价会下降。 颈动脉采血法颈动脉采血法 心脏采血法心脏采血法 静脉采血法静脉采血法2021/6/1621免疫血清的免疫血清的鉴定定 表达量的测定：表达量的测定：颗粒性抗原可采用凝集试验，可溶性颗粒性抗原可采用凝集试验，可溶性抗原常用双向免疫扩散试验、抗原常用双向免疫扩散试验、ELISA等方法。等方法。 玻片凝集试验玻片凝集试验 肥达试验（微量法）肥达试验（微量法） ELISA2021/6/1622玻片凝集玻片凝集试验 玻片凝集试验为定性试验方法，一般用已知抗体作为诊断玻片凝集试验为定性试验方法，一般用已知抗体作为诊断血清、与受检颗粒抗原如菌液或红细胞悬液各加血清、与
17、受检颗粒抗原如菌液或红细胞悬液各加1滴在玻片滴在玻片上，混匀，数分钟后即可用肉眼观察凝集结果，出现颗粒上，混匀，数分钟后即可用肉眼观察凝集结果，出现颗粒凝集的为阳性反应。凝集的为阳性反应。 此法简便、快速，一般用来鉴定菌种或分型，也用于人此法简便、快速，一般用来鉴定菌种或分型，也用于人类类ABO血型的鉴定。血型的鉴定。2021/6/1623肥达肥达试验（Widal test）是用已知的）是用已知的伤寒杆菌寒杆菌O、H抗原和抗原和甲、乙型副甲、乙型副伤寒杆菌寒杆菌H抗原与病人血清做定量凝集抗原与病人血清做定量凝集试验，以以测定患者血清中有无相定患者血清中有无相应抗体，根据抗体含量的多少以抗体，根
18、据抗体含量的多少以及增及增长情况判断阳性。情况判断阳性。此法一般用来帮助此法一般用来帮助诊断断伤寒及副寒及副伤寒。寒。 肥达试验肥达试验2021/6/1624ELISA酶酶联免疫吸附免疫吸附实验(ELISA) 即将已知的抗原或抗体吸附即将已知的抗原或抗体吸附在固相在固相载体表面，使体表面，使酶酶标记的抗原抗体反的抗原抗体反应在固相表面在固相表面进行的技行的技术。该技技术可用于可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，具有快大分子抗原和特异性抗体等，具有快速、灵敏、速、灵敏、简便、便、载体易于体易于标准化等准化等优点。点。2021/6/1625 特异性特异性鉴定：定：抗体特异性抗体特异性鉴定常用双向免
19、疫定常用双向免疫扩散法、免疫散法、免疫电泳法。泳法。 纯度度鉴定：定： 抗体抗体纯度的度的鉴定可采用定可采用SDS-聚丙聚丙酰胺凝胶胺凝胶电泳（泳（SDS-PAGE）、）、双向双向扩散散试验、免疫、免疫电泳等方法。泳等方法。 IgG含有重含有重链和和轻链，纯IgG的的SDS-PAGE结果果应有两条蛋白有两条蛋白电泳泳带（分子量（分子量约53kD和和22kD），若出），若出现多条多条电泳泳带则表明制表明制备的抗的抗体混有体混有杂蛋白，需蛋白，需进一步一步纯化。化。 结合活性合活性鉴定：定：测定抗体定抗体亲力的方法力的方法较多，如平衡透析法、多，如平衡透析法、ELISA或或RIA竞争争结合合试验等
20、。等。2021/6/1626抗体亲合常数测定抗体亲合常数测定 亲合常数测定采用非竞争酶免疫试验法：亲合常数测定采用非竞争酶免疫试验法： 先确定在某一抗原浓度时抗体可以达到饱和；先确定在某一抗原浓度时抗体可以达到饱和； 以该抗原浓度为实验条件，饱和时的以该抗原浓度为实验条件，饱和时的OD值作为值作为OD-100，找出找出OD-50时的抗体浓度和相应的抗原浓度；时的抗体浓度和相应的抗原浓度； 根据公式根据公式Ka= n-1 计算抗体的计算抗体的Ka值。值。 2(nAbt-Ab t)t代表测定时的温度；代表测定时的温度；n=Abt/Abt；Abt 表示抗原浓度较高的表示抗原浓度较高的Amax的一半；
21、的一半；Abt表示抗原浓度较低的表示抗原浓度较低的Amax的一半。的一半。 对于单克隆抗体，一般亲合力要求对于单克隆抗体，一般亲合力要求107L/mol，好的单抗多，好的单抗多大于大于109 L/mol。 2021/6/1627多克隆抗体的保存多克隆抗体的保存 4保存（保存（6个月）个月）低温保存（低温保存（-70 -20 ，5年）年）真空干燥保存（真空干燥保存（5 10年）年）注意点：保存前需注意点：保存前需经除菌除菌 保存液含防腐保存液含防腐剂 避免反复避免反复冻融（分装）融（分装） 2021/6/1628半抗原性免疫原的制备半抗原性免疫原的制备 载体体选择：（1）蛋白）蛋白质类：常用的有
22、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、血蛋：常用的有人血清白蛋白、牛血清白蛋白、血蛋白等，其中以牛血清白蛋白最白等，其中以牛血清白蛋白最为常用。常用。（2）多）多肽类聚合物：是由人工合成的多聚合物：是由人工合成的多肽聚合物，也是一聚合物，也是一类良良好的好的载体，常用的有多聚体，常用的有多聚赖氨酸。氨酸。（3）大分子聚合物：聚乙）大分子聚合物：聚乙烯吡咯吡咯烷酮（PVP）、）、羧甲基甲基纤维素素(CMC)等皆可与半抗原等皆可与半抗原结合，加入福氏完全佐合，加入福氏完全佐剂可可诱导动物物产生良好的抗体。生良好的抗体。2021/6/1629 连接方法：连接方法： 物理法：是用物理吸附法将载体与半抗原连接，其
23、物理法：是用物理吸附法将载体与半抗原连接，其原理是通过电荷和微孔来吸半抗原，吸附载体主要有原理是通过电荷和微孔来吸半抗原，吸附载体主要有PVP和和CMC等；等； 化学法：是利用某些功能基团把半抗原连接到蛋白化学法：是利用某些功能基团把半抗原连接到蛋白质类或多肽类聚合物载体上。不同的半抗原应选用不质类或多肽类聚合物载体上。不同的半抗原应选用不同的方法进行连接。同的方法进行连接。2021/6/1630 根据化学基团不同，连接方法主要有以下几类：根据化学基团不同，连接方法主要有以下几类： 带游离氨基或羧基以及二种基团皆有的半抗原：羧基可用混合酸酐带游离氨基或羧基以及二种基团皆有的半抗原：羧基可用混合
24、酸酐法和碳二亚胺法与载体氨基形成稳定的肽键，带氨基的半抗原则可与法和碳二亚胺法与载体氨基形成稳定的肽键，带氨基的半抗原则可与载体羧基缩合。载体羧基缩合。 带有羟基、酮基、醛基的半抗原：不能直接与载体连接，需要用化带有羟基、酮基、醛基的半抗原：不能直接与载体连接，需要用化学方法如琥珀酸酐法、学方法如琥珀酸酐法、O-羧甲基、羟胺法等方法将之转变为带有羧基羧甲基、羟胺法等方法将之转变为带有羧基的的 半抗原衍生物后才能与载体连接。半抗原衍生物后才能与载体连接。 带有酚基的半抗原，可用一氯醋酸钠法或重氮化的对氨基苯甲酸法，带有酚基的半抗原，可用一氯醋酸钠法或重氮化的对氨基苯甲酸法，生成带有羧基的半抗原衍
25、生物。生成带有羧基的半抗原衍生物。2021/6/1631谢谢 谢谢 请提出您的宝贵意见！ 2021/6/1632Ab1Ab3Ab4单克隆抗体单克隆抗体抗原抗原Ab1抗血清抗血清Ab1Ab2Ab3Ab4Ab2Ab3Ab4普通抗血清（多克隆抗体）普通抗血清（多克隆抗体）脾脾B细细胞胞骨髓瘤小鼠骨髓瘤小鼠取腹水取腹水骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞HAT培养，培养，稀释稀释单单克克隆隆抗抗体体和和多多克克隆隆抗抗体体产产生生区区别别示示意意图图杂交瘤细胞杂交瘤细胞+ PEG, 融合融合Ab22021/6/1633盐析法沉淀抗原的机理盐析法沉淀抗原的机理 2021/6/1634 凝胶过滤层析凝胶过滤层析( 分子筛分子筛)的作用机理的作用机理2021/6/1635 亲和层析的作用机理亲和层析的作用机理2021/6/1636 颈动脉分离图颈动脉分离图 2021/6/1637ELISA技术路线技术路线2021/6/1638 结束语结束语若有不当之处，请指正，谢谢！若有不当之处，请指正，谢谢！
