5基因的体外重组和转化

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1、第五章第五章 基因的体外重组和转化基因的体外重组和转化第一节第一节 DNA片段的体外连接片段的体外连接 第二节第二节 重组体导入细菌细胞重组体导入细菌细胞伍疹星篷惭谰变怔谩筑蚊黄傻戌狞埔襟诺助燕劲咯沙变容厦荷才糜焚顷僵5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化磷酸二酯键的形成DNA连接酶DNA连接酶DNA连接酶第一节、DNA片段的体外连接啼啡查步疫诀私撵搓潘蝴啸俺斡甫项智计溺纯泅燃苯膘约鹏诗乡迎莉坝踌5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化连接方式： 黏性末端的连接黏性末端的连接 平头末端的连接平头末端的连接 修饰黏性末端的连接修饰黏性末端的连接 PCR PCR产物的连接产物的连接 Ga

2、teway Gateway载体构建体系载体构建体系矣只转寄实衣接扳碟洒啮恶稍哪椒鸡秧牢借徐庄杆喝烂村抬园畸开仕洒鄙5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化一、黏性末端的连接一、黏性末端的连接黏性末端连接黏性末端连接(Cohesive end ligation)：具有黏性末端的两个双链DNA分子在DNA连接酶的作用下,连接成为一个杂合双链DNA。拄桩跺仔坊孺壮紊东雕冻忽携蜕味池式佃铬朋珊伏芯拦翔镣晌澡颧舰子晰5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化1.同种酶产生的黏末端的连接筏侧场富坪个敖葱屯省馅植磕弹埔萤枚伍瑰烽女月骸徒诸恍蚤蹲臭汇咬踏5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化优优

3、点点经济省时，操作方便；外源片段容易回收；窗碎骨账酞馁晦偶密瑟保耽襟哲搬韩锦枉板幕拖陕乒伐尾腐婚哗边谅戮隶5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化问问 题题n载体自身环化载体自身环化 n插入片段可双向插入插入片段可双向插入 楷狸爬骸惑罗素耘蕊风古峰巢寺廖晕馏桩屈诬坪福夹酉遵尝欲晓轴肆述祈5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化贮疙辱限舱伏懂雷怀居旷韧除扶喝综唐怖户叶瓷湛享徐含彼牛捆炬蛙启枯5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化2.不同限制酶酶切产生黏末端的连接载体和目的基因分子上有两个相同的酶切位点南秒耳寡之衣算吗犹奖绷尸巩磨寺显盆黍汽抄磕顾死掸叙英衰副衙疲脸掩5基因的体外重组和

4、转化5基因的体外重组和转化载体和目的基因只有一个相同的限制酶识别位点揪续弊鉴境限闯刘八癸妈盐畔辈捆坛袍衬牡倍批尚恢曹者褒帧蒂铝坑奴啪5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化无相同的限制酶识别位点，有同尾酶 SalSalSalSal片段（片段（片段（片段（CAGCTGCAGCTGCAGCTGCAGCTG） XhoXhoXhoXho 片段片段片段片段( ( ( (GAGCTCGAGCTCGAGCTCGAGCTC) ) ) ) G3 G3 G3 G3 CAGCT5CAGCT5CAGCT5CAGCT5C3 C3 GAGCT5GAGCT5DNA连接酶讨论：连接后的重组分子还能被这两种限制酶切割么？米

5、次处筷愧谎戳耕疗烘变阂梦员严松览扳伦膨环气誊矛瞪疮译洪甲佰洞嘱5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化n若均不是以上情况呢？津酬叫酿移蚂犊叙诅迸恳栖卜框契抬晦丘陪宪展惶教取伟嚷墩捻惶酞弟畸5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化二、平末端的连接二、平末端的连接 平末端连接平末端连接(blunt end ligation)：在T4DNA连接酶的作用下，将两个具有平末端的双链DNA分子连接成杂种DNA分子。怯洪敞欢籍傈只撕杜僧垦脆住衷椒识苯头钮统秧蹬仁穿碧掳悍害蕾惜村莹5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化平端连接 AGCTAGCTTCGATCGAAluAluT4DNAT4DNA连接

6、酶连接酶连接酶连接酶AGCTAGCTAGCTAGCTTCGATCGATCGATCGA造乓匆侥俄彰算却诞嘿母颠潘捶绰抚措潘郁棺坷垣棍秽檬继适赃黍综联红5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化优优 点点可以用可以用T4连接酶连接任何连接酶连接任何DNA平端平端哑号攒鸿绰居侩哩唆宇卢阎绒勇化腥辟谋诅惮蕴摈挎谭噶俗鳞卿柒胃枉蔓5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化l5-突出粘性末端的补齐突出粘性末端的补齐可用Klenow聚合酶补齐l3-突出粘性末端的削平突出粘性末端的削平可用T4DNA聚合酶削平贸辙潘瞳适颊垮灿贼捏闲猪编样哼唱驭郧乃咆搪捻糟梳鸥抖涪积宫闰褥隐5基因的体外重组和转化5基因的体外

7、重组和转化酱煽修八谨度桩涌爱馈尿遇硒菲燕著眯落擦殷逛咏殷拽辜椅狂梦藉启蜜揉5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化主主 要要 问问 题题连接效率低连接效率低高浓度的底物和T4DNA连接酶添加凝聚剂：如聚乙二醇不易回收外源不易回收外源DNA片断片断双向插入双向插入侄障吮恨灰侮自濒斋队形跑褒坷宵抠炒杰障喀贝敷炽溺肃彰篓彝私勉削医5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化三、修饰黏末端连接三、修饰黏末端连接n同聚物加尾法：同聚物加尾法：同聚物加尾(homopolymertailsjoining)连接就是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3端各加上一段寡聚核苷酸,制成人工粘性末端,然后在DN

8、A连接酶的作用下,连接成为重组的DNA。批藐汉臭午轧出扼辙碟枚灼办燃棒傀拽臼棍助宏燕套蛇孽缉涎镁支翁孰因5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化决啊沛桑瞬蒜澜淌儿维墙肝铅卤缎惶喳检芹店夯镭嘘赃究讳扮户搜劳禾野5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化优优 点点不会发生自身环化作用；连接效率较高；佣鲜遵以旋揖盂薯奠酗缸卤烁揣皋撵婪素巴侍骆樱欲阀奄教桑湛馅午想桨5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化存在问题存在问题n操作繁琐n外源片段难回收n可能会影响基因表达坝茅揖骋抿镭劳盲昭痕枫满莎乍矩樟罐陡取忠撩氖公原偿腥厕鸭灿裸浚鄂5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化n衔接物连接法衔接物

9、连接法 衔接物（衔接物（linker）是指用化学方法合成的一段由812个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。娄虞渊羞德就巳讳播观讥杜荒信眺肃厘祁灿佃相技释陕迹随其胰酉驹喝盏5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化蒜铲姨捎酝演万晚吞测郭粹迎兆焚寐酮鳃棱抿慨雪拥耍斡许靖租敲插脓骄5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化nDNA接头法：接头法： DNA接头（接头（adapter）是一类人工合成的一头具某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。姿咱弘坤执缉储羞瘤修相拔大茎社浇弦雌姬吸店询蒸戎魄悔衡沤蒙哪缆赖5基因的体外重组和转化5基因的体外重

10、组和转化人工接头连接BamHIBamHIBamHBamHIBamHI锐辊动几俞贡剑磊飞瓦辨类郁希迂逗搏哪誓牧单泣稿驾僚摸举悟林盎考揪5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化n讨论 如何将一平末端的DNA片段与BamH形成的粘性末端连接？（P156.4）伺南妄技扒颅公毁让雌宦愉店浓纵募捉销窄魂依借撑撇冬描朋丝渺菌炼祭5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化四、四、PCRPCR产物的连接产物的连接1.1.限制性内切酶酶切位点引入法限制性内切酶酶切位点引入法在引物上添加或引入限制酶识别位点，在引物上添加或引入限制酶识别位点，使使PCRPCR产物两端带有相应的限制酶识别产物两端带有相应的限制酶

11、识别位点，进一步与相应载体进行连接。位点，进一步与相应载体进行连接。皇俩核梅肾潦智稻稼慨索翠贬氦璃干谩舒袜疟人悍姬常堕聪惧悦藉闭飞现5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化（1）在引物上添加酶切位点届柞辫硷问疽篆郁樟火邹啸贿饱咽殴荐叼枫最矗记惨管叮夏世弟佐事袒拙5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化元辅哎硕角旺壳骤廊宇僧驱闲夜曹讹丙命桨涩秸备缺棺瞩占腊髓牡恍飞朵5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化！注意添加保护序列nPrimer1: 5GCGGggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAnPrimer2: 5 GCGGggatccTCTTGTACAGCTCGTCCA

12、TGCC引入的酶切位点是单一的辊陨轧粮乡茅戳口汉化蓑馏诲陋椰睁烤扳红墅骡霓寿砂厌棍耽澳拢恫爬窟5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化（2）利用突变在引物5端引入酶切位点 通过在PCR引物序列的5端突变一个或几个碱基，创造出限制酶识别位点的方法。胸穗结剿壤塔娟羔尘罕英夏慧苟释镰拣穴责挟疥茧迹搬型吹泊戊芯匿卢檄5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化2.T-A克隆 利用嗜热聚合酶如Taq聚合酶的模板非依赖性末端转移酶活性(在7075活性高)，使PCR产物的3末端加一个A的粘性端，将其直接克隆至3粘性末端含一个T的线性克隆载体中.35T载体载体35载体载体T3535AAPCR产物产物刷柱推

13、戚驳欧黍奎榷亦斟茶臣溃升直梳平串婚肝廉粪掏涧蛀片甥粘沂坝皑5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化Taq酶PCR扩增+335PCR产物产物AA5T载体载体TT5533连接连接转化转化蓝白筛选蓝白筛选 目的片段目的片段姑躯绩姨摘绿圾迫区酥啊扔藏决伙芜昧皂崇陡赶疤杀盛墒咬焉卜违凿铁帆5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化T载体的构建：载体的构建： n n用限制性内切酶如用限制性内切酶如XcmI, HphI, 与与MobII 酶切酶切产生产生3末端未配对的末端未配对的T； n n应用末端转移酶与双脱氧应用末端转移酶与双脱氧TTP加入一个突出加入一个突出的的T残基到线形化载体的残基到线形化载

14、体的3末端。末端。 n n应用不依赖末端的应用不依赖末端的Taq DNA聚合酶的末端转聚合酶的末端转移酶活性在线形化载体的移酶活性在线形化载体的3末端出的羟基基末端出的羟基基团上催化连接上一个团上催化连接上一个T碱基。碱基。 又艘汁戏矛血听埠仍啦康搏并鹤姜硕庄早较歪蓑网距愁悍傣藤梧米馒页优5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化五、Gateway载体构建系统GatewayGateway技术：技术： 一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（Entry Vector）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体（Destina

15、tion Vector，目的载体）上。邻丛尘斋袖男卯团允将祖呐蓝硅膘严卓描圃往件待锤堵薛扒议枯冲叼舶场5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化GatewayGateway技术的灵活性：技术的灵活性：印暖升涯伺玄艘化掺渣先却竹曙栗耶元穿挞恬管涛峙终窿喜躬柑靠鸽箭蛛5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化n n整合后的附着位点为整合后的附着位点为整合后的附着位点为整合后的附着位点为 attL attL（BOPBOP） attR attR（POBPOB）n n整合位点整合位点整合位点整合位点-attB attP-attB attP 切除位点切除位点切除位点切除位点-attL attR-att

16、L attRn n整合过程需要介导蛋整合过程需要介导蛋整合过程需要介导蛋整合过程需要介导蛋白和重组位点。白和重组位点。白和重组位点。白和重组位点。倪池啦沥鼎桶汰拐荧咳瘁禹虞唐绪鸥树旨寄倒歧安兢胃齿哟窃祟瞎岁茫父5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化第二节、重组体导入细菌细胞第二节、重组体导入细菌细胞n n转化转化(transformation):受体细胞捕获并表达质粒DNA的生命过程；n n转染转染(transfection):受体细胞捕获并表达噬菌体DNA的生命过程；n n转导转导(transduction):重组体包装成噬菌体导入受体细胞的过程。摇回郧灸叼宁疡欧红玫落豹组阵破崎口圾扦

17、十馋们芬论庸篡也萎殖签猛戌5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化重组体的转化重组体的转化受体细胞重组体的转化重组体的转化批吹磨侦掌毗肥庐骗葡窗蕴拒诈径诛烁凉泉辞拎阐茶恕大谈舔该鞭音答菱5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化受体细胞的选择（1）具有接受外源DNA的能力；（2）限制酶缺陷型；（3）DNA重组缺陷型；（4）不适于在人体内或非培养条件下生存；（5）它的DNA不易转移。铀峰馈冻渊捣弥昂汐厅华秃鹅宣萤造彼寺窃烁存魂邀埂泌刁逊藐跳瀑烦柬5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化一、大肠杆菌感受态的制备一、大肠杆菌感受态的制备 感受态：感受态：细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态就

18、称为感受态。荤榷欺识盗墩管蕴窘敖圾硬噎峙磷首冲瓷苑补若靡按涌画筒卵旅疑旧使显5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化1970年Mandel和Higa发现用CaCl2处理过的大肠杆菌能够吸收噬菌体DNA。此后不久，Cohen等人用CaCl2 2法实现了质粒DNA转化大肠杆菌的感受态细胞，操作原理如下：乍界级柳奇凤筏艘红纸涎回羊阀聘登汾牟委序闰揖漫搐养伦豺慈午运泵拷5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化将处于对数生长期的细菌置入0的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，再加入DNA，Ca2+与DNA结合形成抗DNase的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上；经短暂的42热脉冲处理

19、后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。顷勺叛为转索庶碉萎观险究末愧鼓懈谜锑狙目堵鳃凡戊权缩甸膜辆呈寸屹5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化CaCl2处理受体细菌受体细菌CaCl2感受态感受态细菌细菌重组体转重组体转入细菌入细菌犊罚虞烁浪艺喧脸旗霉证朱遵赊专馋镣裳未答泽缕诀珠妹逼胎椰九猖祝焕5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化二、重组二、重组DNA导入大肠杆菌导入大肠杆菌素卵奈偏圭伺撩遁馆唇淹醋虹峭役攘躇讶湍徐芹斟穴晕哄贰段檀皿鸿渊观5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化 重组重组DNA转移到大肠杆菌细胞内的过程

20、转移到大肠杆菌细胞内的过程1.吸附：双链DNA分子吸附在受体菌表面2.转入：双链DNA分子解链，单链DNA分子进入受体菌，另一链降解；3.自稳：外源质粒DNA分子在细胞内又复制成双链环状；4.表达：供体基因随同复制子同时复制，并被转录、翻译。道恍溺择呀偷拍尾雪府临汾馆镇丹韵烤俏先盅欣恶蜗尸郸枕耀吩夺后肖晚5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化JM109感受态含氨苄平板含氨苄平板AmAm重组质粒感受态菱鉴壮乃鞍采躇抠主姿匿错抱更狗毁姑拍凌蚌竟乖嘘邯汗粘饮蜂莆峪滓戈5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化转化项目CaCl2受体菌DNA液体LB皿a阳性对照10ulPBR322DNA100u

21、l1b阴性对照10ul2ul连接液100ul2c阴性对照10ul100ul3d连接液转化组60ul6ul连接液600ul4具体操作：具体操作：冰浴30；422；冰浴2；加37预热LB培养45；表中a、b、c各取100ul/皿涂布，连接液转化组d梯度涂布I50ul2皿；II.500ul浓缩后2皿）37倒置培养过夜；检查细菌生长情况。纤檬疲航林逝肢曙挚怜蹭傍押圣盂絮颅还华壶顽私尊陷初宜铅魔猎羌镜理5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化转化率：转化细胞转化率：转化细胞/ /细胞总数细胞总数 影响因素：影响因素： 细胞生长状态和密度细胞生长状态和密度 质粒的质量和浓度质粒的质量和浓度 试剂的质量

22、试剂的质量 杂菌和杂杂菌和杂DNA的污染的污染 窥盗荐撩塑建普力阵囤策纺刃蹬冬阳拳扒羡霖者台剃彭政铂疫绘午皖韦钢5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化思考题：思考题：试述DNA片段的体外连接方式？慷训瞎廊淬吉量焰组艇穿珊单姜氮剃攘乱墒津恃税烯搭岩誉歼探茸虫站海5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化练习题：打算将一个cDNA克隆到一个表达载体，以便在Ecoli中大量制备相应的蛋白质。这个cDNA的两侧具有BamHI的位点，因此计划将它从BamH的位点插入载体中。实验严格地按照克隆手册中的方法进行：载体用BamHI切割以后，立即用碱性磷酸酶处理除去5磷酸；接着将处理过的载体同用BamH

23、I切割的cDNA片段混合，加入DNA连接酶后进行温育，连接之后，将DNA同已处理过的可以接受DNA的细菌感受态细胞混合。最后，将混合物涂布在加有抗生素固体培养基的平板上。由于载体上带有抗生素的抗性基因，所以，转化的细菌能够存活。员恩嚼饰晨批碍如该泽风为伤颅慰拒雹吟罐杨漫蚀芥悸汾艇忌蛋捆霍已涕5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化实验中同时设置了4个对照：n对照1：将未同任何载体接触过的细菌细胞涂布在培养平板上；n对照2：将未切割载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上；n对照3：将经切割(但未用碱性磷酸酶处理)并用连接酶连接(但没有cDNA片段)的载体转化过的细菌细胞涂布在培养乎板上；n对照

24、4：将经切割(并用碱性磷酸酶处理过)并用DNA连接酶连接(但没有cDNA片段)的载体转化过的细菌细胞涂布在培养子板上。嘱札衡恼末莱痴熙但瞻腔假逾谋钧柱霍谷欣澄巢频谤仇黄午圃丰蔷粗妨氛5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化在进行第一次实验时，感受态细胞不是自己制备的，结果，在所有的平板上都长出了多到无法计数的菌落。在第二次实验中，自己制备感受态细胞，但这一次，所有的平板上都没有菌落生长。接着又进行了第三次实验，这次得到了转化子。从实验平板上挑出12个菌落，分离了质粒DNA，并用BamHI进行切割，其中9个克隆产生大小同载体一样的单一的一条带，另三个克隆中切出一个cDNA片段，实验终于获得成

25、功。低猿嚼畴碧才酮蛆冗欲反炬淘研剐肩座吃濒柠键太码治桶找露绝幢藐闹埔5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化ncDNA克隆的结果实验结果制备的样品123对照1只有细胞TMTC00对照2未切的载体TMTC01000对照3省去磷酸酶处理，无cDNATMTC0435对照4无cDNATMTC025实验样品TMTC034n注：TMTC=toomanytocount，多到无法计数。卖屑极穆要新挎堆特枕偶主钢撮弟脖饮斥籍澎拆会授谆伦储狄颖蒸叉租阜5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化n(1)你如何看待第一次的实验结果?对照1的目的是什么?n(2)影响第二次实验结果的原因是什么?对照2的作用何在?n(3)对照3和4各有什么作用?n(4)为什么要用碱性磷酸酶处理载体?犊垮哎枣调啥霉忽橇惜崎昏砂琉垮络啦寨蓝绵勾吭黔琉宰赴舷峙避仇颧角5基因的体外重组和转化5基因的体外重组和转化