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1、蛋白质的分离纯化与鉴定蛋白质的分离纯化与鉴定Isolation, Purification and Identification of Protein杨学习抗体工程研究所蛋白质工程世界生命科学的圣地与分子生物学的摇篮世界生命科学的圣地与分子生物学的摇篮 -冷泉港实验室（冷泉港实验室（The Cold Spring Harbor Laboratory）分子生物学圣经分子生物学圣经分子克隆实验指南分子克隆实验指南蛋白质工程中进行蛋白质分离纯化的必要性蛋白质工程中进行蛋白质分离纯化的必要性n n化学修饰法对蛋白质进行修饰改造时需要单一的化学修饰法对蛋白质进行修饰改造时需要单一的蛋白质作为原材料蛋白质
2、作为原材料n n为了研究蛋白质工程的效果，需要单一的蛋白质为了研究蛋白质工程的效果，需要单一的蛋白质作为实验材料研究其结构与功能作为实验材料研究其结构与功能n n为了生产性能更优良的蛋白质，需要对设计改造为了生产性能更优良的蛋白质，需要对设计改造过的蛋白质进行大量纯化，从而开发出相关产品过的蛋白质进行大量纯化，从而开发出相关产品目录目录n n前言前言n n蛋白质纯化方法蛋白质纯化方法n n蛋白质纯化总原则及步骤蛋白质纯化总原则及步骤蛋白质纯化总原则及步骤蛋白质纯化总原则及步骤n n总原则总原则总原则总原则n n蛋白质纯化的步骤蛋白质纯化的步骤蛋白质纯化的步骤蛋白质纯化的步骤n n材料的选择与预
3、处理材料的选择与预处理n n蛋白质的提取蛋白质的提取n n蛋白质的粗分级蛋白质的粗分级n n蛋白质的细分级蛋白质的细分级n n蛋白质的鉴定蛋白质的鉴定n n蛋白质纯化的原则蛋白质纯化的原则蛋白质纯化的原则蛋白质纯化的原则n n蛋白质的鉴定蛋白质的鉴定蛋白质的鉴定蛋白质的鉴定n n能从成千上万种蛋白质混合物中纯化出一种蛋白质的原因是不同蛋白质在许多理化性质上有着极大的不同。n n这些理化性质的不同是由于氨基酸的数目和序列不同造成的。一、蛋白纯化方法一、蛋白纯化方法1.与蛋白质分离纯化相关的理化特性与蛋白质分离纯化相关的理化特性n n分子大小n n分子形状n n带电特性n n溶解特性n n与配体特
4、异性结合不同n n吸附性质n n变性和复性1.1分子大小分子大小n n大小n n蛋白质的分子大小主要取决于蛋白质肽链的数蛋白质的分子大小主要取决于蛋白质肽链的数目及每条肽链的氨基酸残基数目。目及每条肽链的氨基酸残基数目。n n几百几百百万百万 DaDan n常用方法n n透析透析n n超滤超滤n n凝胶过滤凝胶过滤n n离心离心n n透析法n n超过滤n n凝胶过滤n n超速离心1.2分子形状分子形状n n形状n n形状的不同会导致蛋白质在离心通过溶液时，形状的不同会导致蛋白质在离心通过溶液时，或通过膜、凝胶过滤填料颗粒或电泳凝胶中的或通过膜、凝胶过滤填料颗粒或电泳凝胶中的小孔运动时，都会受到
5、它的形状的影响。小孔运动时，都会受到它的形状的影响。n n方法n n梯度离心的影响梯度离心的影响n n电泳的影响电泳的影响1.3电荷电荷n n原理n n蛋白质的净电荷取决于氨基酸残基所带正、负蛋白质的净电荷取决于氨基酸残基所带正、负电荷总和。若天冬氨酸和谷氨酸占优势，在电荷总和。若天冬氨酸和谷氨酸占优势，在pH pH 7.07.0时带净负电荷，称为酸性蛋白质。若赖氨酸时带净负电荷，称为酸性蛋白质。若赖氨酸和精氨酸占优势，在和精氨酸占优势，在pH 7.0pH 7.0时带净正电荷，称时带净正电荷，称为碱性蛋白质。为碱性蛋白质。n n方法n n电泳电泳n n离子交换层析离子交换层析1.4溶解度溶解度
6、n n原理原理n n由于蛋白质分子表面亲水性和疏水性带电基团不同，由于蛋白质分子表面亲水性和疏水性带电基团不同，因此在溶剂中的溶解度不同。因此在溶剂中的溶解度不同。n n方法：方法：n n通过改变通过改变pHpH、离子强度或加入有机试剂，促进蛋白质、离子强度或加入有机试剂，促进蛋白质分子的凝聚进而形成沉淀。分子的凝聚进而形成沉淀。n n沉淀法沉淀法n n盐析法盐析法n n有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法n n等电点沉淀法等电点沉淀法n n蛋白质在高浓度中性盐溶液中会沉淀析出，称为盐析n n盐析原理：n n高浓度盐离子与蛋白质分子争夺水化水，破坏高浓度盐离子与蛋白质分子争夺水化水，破坏蛋白质分子表面
7、的水膜，同时盐离子也会影响蛋白质分子表面的水膜，同时盐离子也会影响蛋白质分子所带电荷，从而引起蛋白质沉淀，蛋白质分子所带电荷，从而引起蛋白质沉淀，但通常不会引起蛋白质的变性。但通常不会引起蛋白质的变性。n n硫酸铵分级沉淀n n有机溶剂分级沉淀n n等电点沉淀法1.5配体特异性结合配体特异性结合n n原理原理n n生物大分子的某些特定结构能够同其他分子相互识别并结合，这生物大分子的某些特定结构能够同其他分子相互识别并结合，这种结合是特异的又是可逆的，生物分子间的这种结合能力称为亲种结合是特异的又是可逆的，生物分子间的这种结合能力称为亲和力。和力。n n方法方法n n将具有亲和力的两个分子中的一
8、个固定在不溶性基质上，利用分将具有亲和力的两个分子中的一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性对另一个分子进行分离纯化。子间亲和力的特异性和可逆性对另一个分子进行分离纯化。n n分类分类n n免疫亲和层析免疫亲和层析n n生物亲和层析生物亲和层析n n金属螯合亲和层析金属螯合亲和层析n n拟生物亲和层析拟生物亲和层析1.6吸附性质吸附性质n n原理n n方法n n羟基磷灰石层析羟基磷灰石层析n n疏水层析疏水层析1.7变性和复性变性和复性n n原理n n蛋白质在一定的理化条件下会失去原有的空间蛋白质在一定的理化条件下会失去原有的空间结构、生物学功能及部分理化特性等称为变性。结构
9、、生物学功能及部分理化特性等称为变性。当变性条件去除后恢复原有的空间结构及生物当变性条件去除后恢复原有的空间结构及生物学功能即为复性。学功能即为复性。n n方法n n尿素变性复性从包涵体中纯化原核表达蛋白尿素变性复性从包涵体中纯化原核表达蛋白2. 分离方法分离方法n n沉淀法n n离心法n n电泳法n n超滤法n n相分配法n n层析法不可能有一套统一的方法适用于分离纯化所有的蛋白质，但每一种蛋白质可能都有一套适合的分离纯化程序，而且所用的主要技术手段都基本相同。二、蛋白质纯化的总原则和纯化步骤二、蛋白质纯化的总原则和纯化步骤n n总原则n n以合理的效率、速度、收率和纯度，将目标蛋白从细以合
10、理的效率、速度、收率和纯度，将目标蛋白从细胞的全部其他成分特别是不想要的杂蛋白中分离出来，胞的全部其他成分特别是不想要的杂蛋白中分离出来，同时仍保留其生物学活性和化学完整性。同时仍保留其生物学活性和化学完整性。n n步骤n n选择实验材料，实验材料预处理选择实验材料，实验材料预处理n n蛋白质的提取蛋白质的提取n n蛋白质的粗分级蛋白质的粗分级n n蛋白质的细分级蛋白质的细分级n n蛋白质的鉴定蛋白质的鉴定 蛋白质纯化的前期准备蛋白质纯化的前期准备 n n什么是最好的来源：n n蛋白质需要有多纯：n n纯化蛋白的量要多少：n n蛋白质应该如何进行鉴定：n n纯化时间应该多长:n n什么是最终花
11、费：n n如何纯化蛋白质：n n关于蛋白质我们已知什么： 1、选择实验材料及预处理、选择实验材料及预处理n n选择实验材料n n物种的选择物种的选择n n组织的选择组织的选择n n实验材料预处理n n液体材料液体材料n n过滤过滤n n离心离心n n固体材料固体材料n n洗涤：自来水洗涤：自来水蒸馏水蒸馏水提取缓冲液提取缓冲液n n材料破碎：材料破碎：材料破碎材料破碎n n机械剪碎n n研磨n n反复冻融法n n超声破碎法n n高压匀浆法n n酶解法2、蛋白质的提取、蛋白质的提取n n1.提取分离原则n n尽可能多地提取目的蛋白，同时避免因热、尽可能多地提取目的蛋白，同时避免因热、 pHpH或
12、有机试剂、金属离子、蛋白酶等因素造成活或有机试剂、金属离子、蛋白酶等因素造成活性丢失。性丢失。n n选择合适的选择合适的pHpH、选择合适的离子强度、选择合适的离子强度n n选择合适的比例选择合适的比例2、蛋白质的提取、蛋白质的提取n n2. 2.提取液成分的确定提取液成分的确定n npH pH 缓冲液：缓冲液：Tris-HclTris-Hcl, , Tris-GlyTris-Gly, , Gly-HclGly-Hcl, , 柠檬酸柠檬酸- -柠檬酸柠檬酸钠钠n n离子强度：动物离子强度：动物 NaClNaCl, , 植物植物KClKCln n还原剂还原剂:DTT, 2-:DTT, 2-巯基乙
13、醇巯基乙醇n n蛋白酶抑制剂：蛋白酶抑制剂：EDTA, PMSF, TPCK,TLCKEDTA, PMSF, TPCK,TLCKn n金属离子螯合剂金属离子螯合剂: EDTA, EGTA: EDTA, EGTAn n去污剂去污剂:SDS, CHAPS, Triton X-100, Tween-20:SDS, CHAPS, Triton X-100, Tween-20n n甘油甘油n n3. 3.温度温度 0-40-43、蛋白质的粗分级、蛋白质的粗分级n n使用蛋白质提取缓冲液提取实验材料后，蛋白提取液中目标蛋白质的浓度往往较低，采取一些简单的方法使目标蛋白质浓缩，同时去除大量的杂质，这些纯化方
14、法就属于蛋白质的粗分级。n n硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级沉淀、超速离心、等电点沉淀、透析、超过滤、蛋白质结晶等。4、蛋白质的细分级、蛋白质的细分级n n粗分级只是使蛋白质得到浓缩和初步分离纯化，多数情况下还要根据蛋白质分子大小、分子形状、分子表面特征或分子带电状况进一步纯化，这就是蛋白质细分级。n n常用的实验技术：层析和电泳4.1. 层析（层析（ chromatography ）n n分子筛层析（分子筛层析（ Gel filtration ）n n离子交换层析（离子交换层析（ Ion exchange ）n n疏水作用层析（疏水作用层析（ Hydrophobic interaction ）
15、n n亲和层析（亲和层析（ Affinity ）n n羟基磷灰石层析羟基磷灰石层析原理（Basic principle）凝胶介质凝胶介质PharmaciaBioGelA agaroseBioGel P acrylamideBio-RadSephadex glucose (dextrose)Sepharose agaroseSephacryl glucose + acrylamideSephacel cellulose 装置（Chromatographic equipment）蠕动泵层析柱检测器记录仪部分收集器chromatographyAffinityIon exchangeHydrophob
16、ic interactionGel filtration4.1.1 分子筛层析分子筛层析Gel filtration chromatographyn n原理n n分子筛层析分子筛层析, , 也称为凝胶过滤、分子排阻层析。是以多孔也称为凝胶过滤、分子排阻层析。是以多孔性凝胶材料为支持物，当蛋白质溶液流经此支持物时，分性凝胶材料为支持物，当蛋白质溶液流经此支持物时，分子大小不同的蛋白质所受到的阻滞作用不同而先后流出，子大小不同的蛋白质所受到的阻滞作用不同而先后流出，从而达到分离纯化的目的。从而达到分离纯化的目的。n n凝胶介质n n葡聚糖葡聚糖 （glucoseglucose）n n琼脂糖琼脂糖
17、（agaroseagarose）n n聚丙烯酰胺（聚丙烯酰胺（acrylamideacrylamide）n n纤维素（纤维素（cellulosecellulose）分子筛层析分子筛层析Gel filtration chromatography Hydrophilic No spontaneous binding to proteins. Chemically and physically stable Rigid to allow a high linear flow-rate分子筛层析分子筛层析Gel filtration chromatography分子筛层析分子筛层析Gel filtra
18、tion chromatography4.1.2 离子交换层析（离子交换层析（ Ion exchange ）n n原理原理n n蛋白质是两性分子，在一定的蛋白质是两性分子，在一定的pHpH条件下带有电荷，不条件下带有电荷，不同的蛋白质带有的电荷的种类和数量不同，因此它们同的蛋白质带有的电荷的种类和数量不同，因此它们与带电的凝胶颗粒间的电荷相互作用不同。利用蛋白与带电的凝胶颗粒间的电荷相互作用不同。利用蛋白质和带电凝胶的作用力的差别从而把蛋白质分开的层质和带电凝胶的作用力的差别从而把蛋白质分开的层析方法。析方法。n n种类种类n n阳离子交换柱：凝胶带负电荷，蛋白质带正电荷阳离子交换柱：凝胶带负
19、电荷，蛋白质带正电荷n n阴离子交换柱：凝胶带正电荷，蛋白质带负电荷阴离子交换柱：凝胶带正电荷，蛋白质带负电荷n n介质介质n n惰性支持物：琼脂糖，葡聚糖惰性支持物：琼脂糖，葡聚糖n n带电基团：羧甲基带电基团：羧甲基带负电带负电 二乙基氨基二乙基氨基带正电带正电n n平衡离子：负电基团的平衡离子氢或钠离子平衡离子：负电基团的平衡离子氢或钠离子 正电基团的平衡离子氢氧根离子或氯离子正电基团的平衡离子氢氧根离子或氯离子选择离子交换介质阳离子交换阴离子交换离子交换层析（离子交换层析（ Ion exchange ）4.1.3 亲和层析亲和层析（Affinity chromatography）n n
20、原理n n亲合层析是利用蛋白质与配体专一性识别并结亲合层析是利用蛋白质与配体专一性识别并结合的特性而分离蛋白质的一种层析方法。合的特性而分离蛋白质的一种层析方法。n n将与目标蛋白质专一性结合的配体固定于支持将与目标蛋白质专一性结合的配体固定于支持物上，当混合样品流过此支持物时，只有目标物上，当混合样品流过此支持物时，只有目标蛋白能与配体专一性结合，而其他杂蛋白不能蛋白能与配体专一性结合，而其他杂蛋白不能结合。先用结合缓冲液洗脱杂蛋白，然后改变结合。先用结合缓冲液洗脱杂蛋白，然后改变洗脱条件，将目标蛋白洗脱下来。洗脱条件，将目标蛋白洗脱下来。Affinity chromatographyHis
21、-亲合示意图亲合示意图 固相载体4.1.4疏水作用层析疏水作用层析n n原理原理n n蛋白质表面的疏水基团与介质蛋白质表面的疏水基团与介质的疏水配体的可逆相互作用，的疏水配体的可逆相互作用，高浓度的盐会增强相互作用，高浓度的盐会增强相互作用，低浓度的盐会减弱相互作用。低浓度的盐会减弱相互作用。n n方法方法n n高离子强度下待分离的样品吸高离子强度下待分离的样品吸附在疏水介质上，然后降低离附在疏水介质上，然后降低离子强度选择性将样品解吸，疏子强度选择性将样品解吸，疏水弱的物质先洗脱，疏水强的水弱的物质先洗脱，疏水强的物质后洗脱。物质后洗脱。4.1.5羟基磷灰石层析羟基磷灰石层析n n羟基磷灰石
22、是一种特殊的离子交换剂，主要成分是磷酸钙。羟基磷灰石是一种特殊的离子交换剂，主要成分是磷酸钙。n n分子中含有带正电荷的钙离子和负电荷的磷酸根离子。分子中含有带正电荷的钙离子和负电荷的磷酸根离子。n n磷酸根离子可以和带正电的蛋白质以离子键结合，可由氯磷酸根离子可以和带正电的蛋白质以离子键结合，可由氯化钠或磷酸钠浓度梯度洗脱。化钠或磷酸钠浓度梯度洗脱。n n钙离子与带负电蛋白质的自由羧基以金属螯合方式结合，钙离子与带负电蛋白质的自由羧基以金属螯合方式结合，对氯化钠不敏感，可由磷酸钠梯度洗脱。对氯化钠不敏感，可由磷酸钠梯度洗脱。n n单梯度洗脱：磷酸钠单梯度洗脱单梯度洗脱：磷酸钠单梯度洗脱n n
23、双梯度洗脱：氯化钠梯度洗脱后，低浓度磷酸钠平衡，再以磷酸双梯度洗脱：氯化钠梯度洗脱后，低浓度磷酸钠平衡，再以磷酸钠梯度洗脱。钠梯度洗脱。4.2.电泳（电泳（ Electrophoresis ）n电泳就是带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极电泳就是带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动。移动。蛋白质常用电泳技术蛋白质常用电泳技术n聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）nSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）n等电聚焦电泳（等电聚焦电泳（ Isoelectric focusing- IEF）n双向电泳（双向电泳（ Two Dimensiona
24、l Electrophoresis ）n导致：导致：n n1、由于、由于SDS是阴离子，使多肽表面覆盖的是阴离子，使多肽表面覆盖的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了原来的电荷差异。消除了原来的电荷差异。n n2、改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋、改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白质的白质的SDS复合物的短轴长度都相同，长轴复合物的短轴长度都相同，长轴长度随其分子量的大小成正比变化长度随其分子量的大小成正比变化4.2.1 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳法测定未知蛋白的分子量4.2.2不连续不连续PAGE分离蛋白质的原理分离蛋白质的原理n n在不连
25、续电泳系统中，所带电荷、分子大小和形状不同的蛋白质在凝胶中能够被分离。n n原理n n电荷效应电荷效应n n浓缩效应浓缩效应n n快慢离子效应快慢离子效应n n凝胶浓度差效应凝胶浓度差效应n n分子筛效应分子筛效应4.2.3 等电聚焦电泳（等电聚焦电泳（Isoelectric focusingIEF）Isoelectric focusing4.2.4 双向电泳双向电泳n n第一向通常根据蛋白质的等电点不同进行等电聚焦电泳，然后再根据分子质量的不同进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳作为第二向。n n双向电泳技术是蛋白质组学研究中蛋白质多肽链分离纯化和鉴定的主要实验技术之一。Isoelectric foc
26、usingSDS gel electrophoresisTwo Dimensional Electrophoresis of E. coli Proteins - more than 2,000 proteins were visualized三、蛋白纯化原则三、蛋白纯化原则Guidelines for Protein Purificationn n确定目标确定目标n npurity, activity and quantitypurity, activity and quantityn n充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性n nto simplify t
27、echnique selection and to simplify technique selection and optimisationoptimisationn n确定活性测定方法确定活性测定方法n nfast detection of protein activity/recovery and critical fast detection of protein activity/recovery and critical contaminants contaminants n n尽量减少纯化步骤尽量减少纯化步骤n nextra steps reduce yield and incr
28、ease time, combine steps extra steps reduce yield and increase time, combine steps logicallylogically纯化目的确定纯化目标三、蛋白纯化原则三、蛋白纯化原则Guidelines for Protein Purificationn n确定目标确定目标n npurity, activity and quantitypurity, activity and quantityn n充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性n nto simplify technique se
29、lection and to simplify technique selection and optimisationoptimisationn n确定活性测定方法确定活性测定方法n nfast detection of protein activity/recovery and critical fast detection of protein activity/recovery and critical contaminants contaminants n n尽量减少纯化步骤尽量减少纯化步骤n nextra steps reduce yield and increase time,
30、combine steps extra steps reduce yield and increase time, combine steps logicallylogicallynASSAY: A method that measures the amount of a specific protein, in a mixture of others. If possible, the assay should give an estimate of the absolute concentration (e.g. mg/ml). Relative concentration is the
31、next best.nThe method chosen will ultimately depend on the properties of the target protein.nMost common are:nenzymatic assays.nligand-binding assaysnimmunological assays活性测定方法的特点：快速、简便、特异和定量活性测定方法的特点：快速、简便、特异和定量活性测定方法的特点：快速、简便、特异和定量活性测定方法的特点：快速、简便、特异和定量确定活性检测方法三、蛋白纯化原则三、蛋白纯化原则Guidelines for Protein
32、 Purificationn n确定目标确定目标n npurity, activity and quantitypurity, activity and quantityn n充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性n nto simplify technique selection and to simplify technique selection and optimisationoptimisationn n确定活性测定方法确定活性测定方法n nfast detection of protein activity/recovery and critica
33、l fast detection of protein activity/recovery and critical contaminants contaminants n n尽量减少纯化步骤尽量减少纯化步骤n nextra steps reduce yield and increase time, combine steps extra steps reduce yield and increase time, combine steps logicallylogically尽量减少纯化步骤Guidelines for Protein Purificationn n减少每步操作时间减少每步操
34、作时间减少每步操作时间减少每步操作时间n nto avoid lengthy procedures which risk losing activity/reducing to avoid lengthy procedures which risk losing activity/reducing recoveryrecoveryn n减少添加物减少添加物减少添加物减少添加物n nadditives may need to be removed in an extra purification step additives may need to be removed in an extra
35、purification step or may interfere with activity assaysor may interfere with activity assaysn n早期除去降解物早期除去降解物早期除去降解物早期除去降解物n nfor example, proteasesfor example, proteasesn n每步使用不同的纯化方法每步使用不同的纯化方法每步使用不同的纯化方法每步使用不同的纯化方法n nto take advantage of sample characteristics which can be used to take advantage
36、of sample characteristics which can be used for separation (size, charge, for separation (size, charge, hydrophobicityhydrophobicity, , ligandligand specificity) specificity)KEEP IT SIMPLE!四、蛋白质的鉴定四、蛋白质的鉴定n n测定蛋白质的浓度测定蛋白质的浓度n n凯氏定氮法凯氏定氮法n n紫外吸收法紫外吸收法n n分光光度法分光光度法n n测定蛋白质的纯度测定蛋白质的纯度n n鉴定目标蛋白质鉴定目标蛋白质n
37、 n蛋白质分子质量与等电点的测定蛋白质分子质量与等电点的测定n n氨基酸组成及顺序分析氨基酸组成及顺序分析n n蛋白质结晶与结构分析蛋白质结晶与结构分析n n蛋白质活性及功能测定蛋白质活性及功能测定1 蛋白质含量的测定蛋白质含量的测定n n凯氏定氮法：n n蛋白质平均含氮量为蛋白质平均含氮量为1616，首先测定氮的含量，进而估算蛋白质的，首先测定氮的含量，进而估算蛋白质的含量。含量。n n紫外吸收法n n芳香族氨基酸在芳香族氨基酸在280nm280nm附近有最大光吸收，核酸在附近有最大光吸收，核酸在260nm260nm附近有最大光吸收附近有最大光吸收. .n n经验公式经验公式 蛋白质含量（蛋
38、白质含量（mg/mg/mLmL）=1.45=1.45 A 280nm280nm 0.740.74A 260nm260nmn n分光光度法n n蛋白质样品与特定的显色剂反应，反应产物在特定的波长的光吸收蛋白质样品与特定的显色剂反应，反应产物在特定的波长的光吸收与蛋白质含量成正比，利用标准曲线即可查得样品的蛋白质含量与蛋白质含量成正比，利用标准曲线即可查得样品的蛋白质含量n n考马斯亮兰法等考马斯亮兰法等2. 纯度鉴定纯度鉴定n n鉴定方法n n色谱纯：在层析图谱中只有一个洗脱峰色谱纯：在层析图谱中只有一个洗脱峰n n电泳纯：在电泳图谱中只有一条电泳条带电泳纯：在电泳图谱中只有一条电泳条带n n结
39、晶纯：能够获得蛋白质晶体结晶纯：能够获得蛋白质晶体n n相互验证：在某一种鉴定方法下表现为均一的相互验证：在某一种鉴定方法下表现为均一的蛋白质在另一种方法可能表现为不均一，因此蛋白质在另一种方法可能表现为不均一，因此需要互相验证。需要互相验证。色谱纯色谱纯电泳纯电泳纯结晶纯结晶纯3.蛋白质鉴定蛋白质鉴定n n分子质量及等电点测定n n氨基酸组成及顺序分析n n结晶及结构分析n n免疫印迹（western-blotting）鉴定3.1蛋白质分子质量及等电点的测定蛋白质分子质量及等电点的测定n n分子质量n nSDS-PAGESDS-PAGEn nPAGEPAGEn n等电点n n等电聚焦（等电聚
40、焦（IEFIEF）3.2氨基酸组成及顺序分析氨基酸组成及顺序分析n n氨基酸组成n n水解蛋白质为氨基酸水解蛋白质为氨基酸n n全自动氨基酸分析仪或高效液相色谱进行测定全自动氨基酸分析仪或高效液相色谱进行测定n n顺序分析n n质谱法质谱法n n推定法：从已知基因序列推断蛋白质氨基酸序列推定法：从已知基因序列推断蛋白质氨基酸序列n n化学法（手工、自动）化学法（手工、自动）水解法水解法SangerSanger法、法、EdmanEdman降解法、氨肽酶法降解法、氨肽酶法肼解法、羧肽酶法肼解法、羧肽酶法各类氨基酸自动测序仪各类氨基酸自动测序仪3.3 空间结构分析空间结构分析n n二级结构的比例n
41、n圆二色谱法圆二色谱法n n三维结构n nX X射线晶体衍射法射线晶体衍射法蛋白质晶体蛋白质晶体n n核磁共振核磁共振溶液中蛋白质的三维结构溶液中蛋白质的三维结构n n电子显微镜电子显微镜3.4 免疫印迹鉴定免疫印迹鉴定n n免疫印迹包括三个步骤n n凝胶电泳凝胶电泳n n转膜转膜n n抗原抗体显色反应抗原抗体显色反应思考题思考题n n蛋白质分离纯化的总原则是什么？n n蛋白质分离纯化的一般步骤如何？n n蛋白质细分级和蛋白质粗分级主要技术？n nSDSPAGE测定蛋白质分子量的主要原理如何？n nWestern blotting原理和主要步骤。n n蛋白质纯化与鉴定实验指南，朱厚础等译，2000，科学出版社n nThe Recombinant Protein Handbook, Protein Amplification and Simple Purification, 18-1142-75n nProtein Purification, Handbook, 18-1132-29 参考资料参考资料
