免疫组织化学课件

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1、免疫组织化学掌握内容掌握内容免疫组化的基本原理免疫组化的基本原理免疫组化的免疫组化的基本过程基本过程免疫组化的染色技术分类免疫组化的染色技术分类常用的免疫组化的染色原理和方法常用的免疫组化的染色原理和方法注意事项注意事项免疫组织化学的基本概念免疫组织化学的基本概念ImmunohistochemistryImmunohistochemistry 又称免疫细胞化学。它是组织化学的又称免疫细胞化学。它是组织化学的分支，它是用免疫学原理（特异的抗原分支，它是用免疫学原理（特异的抗原抗体反应）来对组织内抗原（或抗体）抗体反应）来对组织内抗原（或抗体）的分布进行原位检测技术。的分布进行原位检测技术。1 1

2、发展简史发展简史19411941年年 Coons Coons 首先用首先用荧光素标记抗体荧光素标记抗体检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功6060年代年代 NakaneNakane建立建立酶标抗体技术酶标抗体技术7070年代年代 StembergerStemberger 改良上述技术，建改良上述技术，建立立过氧化物酶过氧化物酶抗过氧化物酶（抗过氧化物酶（PAPPAP）技技术，使免疫细胞化学得到广泛应用。术，使免疫细胞化学得到广泛应用。8080年代年代 Hsu Hsu 等建立了抗生物素的等建立了抗生物素的（ABCABC）法法之后，之后，免疫金免疫金银染色法银染色法、半

3、抗原标记法、免半抗原标记法、免疫电镜技术疫电镜技术相继问世。相继问世。9090年代年代 分子杂交技术、原位杂交技术分子杂交技术、原位杂交技术、免疫免疫细胞化学分类方法迅速发展细胞化学分类方法迅速发展20002000年年 各种免疫组化技术各种免疫组化技术更加成熟，使免疫更加成熟，使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功能代谢组化技术成为当今生物医学中形态、功能代谢综合研究的一项有力工具。综合研究的一项有力工具。免疫组织化学的优点免疫组织化学的优点1 1、特异性强、特异性强免疫组化从理论上讲也是免疫组化从理论上讲也是“一对一一对一”的的组织细胞中抗原的特定显示组织细胞中抗原的特定显示2 2、敏感性

4、高、敏感性高抗体稀释到几千分之一、上万分之一，抗体稀释到几千分之一、上万分之一，甚至几亿分之一时仍可在组织细胞中与抗原结合甚至几亿分之一时仍可在组织细胞中与抗原结合3 3、定位准确，形态与功能相结合、定位准确，形态与功能相结合4. 4. 方法步骤统一方法步骤统一若掌握一种技术操作方法步骤，则若掌握一种技术操作方法步骤，则一通百通。一通百通。免疫组织化学的基本原理免疫组织化学的基本原理应用免疫学应用免疫学抗原与抗体特异性结合抗原与抗体特异性结合的原理，的原理，通过化学反应使通过化学反应使标记抗体标记抗体的显色剂的显色剂 ( (荧光荧光素、酶、金属离子、同位素素、酶、金属离子、同位素) ) 显色来

5、确定显色来确定组织细胞内抗原，对其进行定位、定性及组织细胞内抗原，对其进行定位、定性及定量的研究定量的研究 基本过程基本过程抗原提取抗原提取制备抗体制备抗体抗体标记抗体标记制备样品制备样品免疫前样品处理免疫前样品处理免疫反应免疫反应显色反应显色反应观察分析观察分析一、一、提取抗原（提取抗原（antigenantigen，AgAg）生物化学各种方法提取抗原生物化学各种方法提取抗原一类能刺激机体免疫系统使之一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应产生特异性免疫应答答，并能与相应免疫应答产物，并能与相应免疫应答产物( (抗体或抗原受体抗体或抗原受体) )在体内外发生在体内外发生特异性结合特异性结合

6、的物质。的物质。基本特性基本特性：一是诱导免疫应答的能力，也就是：一是诱导免疫应答的能力，也就是免免疫原性疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是是反应原性反应原性抗原（抗原（antigen ，Ag）表位，抗原结合位点，抗原决定簇（epitope）Ag1234表位A表位B表位C抗原克隆A克隆B克隆C多克隆抗体单克隆抗体抗体蛋白分为抗体蛋白分为V V区和区和C C区，区，V V区高度可变，区高度可变，是识别抗原的区是识别抗原的区域，域，C C区是很保区是很保守的守的二、制备抗体二、制备抗体即多克隆抗体（即多克隆抗体（PcAbPcAb）单克隆抗体（单克隆抗体

7、（McAbMcAb）和基因工程抗体和基因工程抗体整体水平抗体生成技术细胞工程抗体生成技术基因工程抗体生成技术基因工程抗体生成技术多克隆抗体（抗血清）多克隆抗体（抗血清）单克隆抗体单克隆抗体嵌合抗体、改形抗体嵌合抗体、改形抗体“ “小型化抗体小型化抗体” ”（单链抗体）（单链抗体）组合抗体库技术组合抗体库技术 噬菌体抗体库技术噬菌体抗体库技术 IgIg基因转基因小鼠基因转基因小鼠抗体真核表达技术抗体真核表达技术抗体的制备和选择原则：种属差异越大越好抗体的制备和选择原则：种属差异越大越好抗体的储存抗体的储存 新制备或购进的是原液或冻干品，抗血清为新制备或购进的是原液或冻干品，抗血清为全血清，单克隆

8、抗体是培养上清液或腹水。全血清，单克隆抗体是培养上清液或腹水。1、4保存（保存（6个月）个月）2、低温保存（、低温保存（-70 -20 ，5年）年）3、真空干燥保存（、真空干燥保存（5 10年）年）4、稀释的抗体不能长时间保存，在、稀释的抗体不能长时间保存，在 4可存放可存放13天，超过天，超过7天效价显著降低。天效价显著降低。抗体的储存抗体的储存注意：注意：1、保存前需经、保存前需经除菌除菌 2、保存液含、保存液含防腐剂防腐剂（浓度低时，应加（浓度低时，应加0.1%-1.5%的牛血清白蛋白作保护剂；必要时需的牛血清白蛋白作保护剂；必要时需要加要加0.01-0.15NaN3防腐剂以延长保存时间

9、；防腐剂以延长保存时间；酶标记抗体酶标记抗体不能用不能用NaN3，会抑制酶的活性），会抑制酶的活性） 3、 避免反复冻融，分装避免反复冻融，分装（10ul或或 100ul/支）支）抗体稀释的配制：抗体稀释的配制：抗体稀释的配制：抗体稀释的配制：常用常用常用0.01mol/L 0.01mol/L 0.01mol/L pH7.4 PBSpH7.4 PBSpH7.4 PBS或或或 TBSTBSTBS 缓冲液缓冲液缓冲液作抗体稀释液。作抗体稀释液。作抗体稀释液。 抗体的最佳稀度倍数：抗体的最佳稀度倍数：由于各种抗体的由于各种抗体的效价不同，组织中抗原强弱不一，应根据不效价不同，组织中抗原强弱不一，应根

10、据不同情况作适当的调整，以取得同情况作适当的调整，以取得中等阳性中等阳性稀释稀释度为佳，因其既适合于抗原性强和含量多的度为佳，因其既适合于抗原性强和含量多的标本，也可用于抗原性弱的标本。标本，也可用于抗原性弱的标本。三、抗体的标记物三、抗体的标记物荧光素荧光素异硫氰酸荧光素（异硫氰酸荧光素（FITCFITC）、异硫）、异硫氰酸罗达明氰酸罗达明(TRITC);(TRITC);德克萨斯红；藻红素等德克萨斯红；藻红素等酶酶碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、葡萄碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶等糖氧化酶、半乳糖苷酶等金属：金属：胶体金、胶体铁、铁蛋白等胶体金、胶体铁、铁蛋白等亲和素、生物

11、素、放射性同位素等亲和素、生物素、放射性同位素等四、样品的制备四、样品的制备 组织材料处理是获得良好免疫细胞组织组织材料处理是获得良好免疫细胞组织化学分析的保障，必须保证要检测的细胞化学分析的保障，必须保证要检测的细胞或组织或组织取材新鲜、固定即使及时、形态保取材新鲜、固定即使及时、形态保存良好、抗原物质的抗原性不被破坏存良好、抗原物质的抗原性不被破坏。 标本的主要来源：标本的主要来源：活体组织、各活体组织、各种体液、穿刺液、培养细胞种体液、穿刺液、培养细胞标本的固定与保存 好的固定剂除能满足一般组织学固定目好的固定剂除能满足一般组织学固定目的外，还需要：的外，还需要：（1 1）能快速固定抗原

12、）能快速固定抗原（2 2）防止抗原物质扩散）防止抗原物质扩散（3 3）固定后的抗原能被抗体识别，不影响）固定后的抗原能被抗体识别，不影响抗原抗体反应抗原抗体反应常用：10%福尔马林（酸性）、乙醇、丙酮、甲醛、中性缓冲多聚甲醛、戊二醛混合固定液：Bouin液，Zamboni液、过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛（PLP）固定液固定方法固定方法细胞表面抗原细胞表面抗原新鲜冰冻切片，后固定于新鲜冰冻切片，后固定于丙酮丙酮单层细胞、病毒、细菌单层细胞、病毒、细菌冷丙酮、冷乙醇冷丙酮、冷乙醇细胞悬液细胞悬液先固定，然后离心制成标本先固定，然后离心制成标本可溶性抗原可溶性抗原甲醛蒸气甲醛蒸气一般组织一般组织新鲜取材

13、、浸泡固定新鲜取材、浸泡固定切片方法切片方法冰冻切片冰冻切片石蜡切片：石蜡切片：乙醇脱水时间要短；乙醇脱水时间要短；浸蜡要快，温度低于浸蜡要快，温度低于6060；玻片上要用黏附剂玻片上要用黏附剂蜡块尽快切片，密封保存在蜡块尽快切片，密封保存在44；染色前彻底脱蜡染色前彻底脱蜡一般为一般为5m5m盖玻片、载玻片清洗干净，载玻片要涂黏附剂：明胶硫酸铬盖玻片、载玻片清洗干净，载玻片要涂黏附剂：明胶硫酸铬钾法、多聚赖氨酸等钾法、多聚赖氨酸等五、免疫反应前的处理五、免疫反应前的处理1、抗原修复、抗原修复福尔马林福尔马林固定时，组织中的许多氨基酸残固定时，组织中的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成了醛键，

14、使得不基在分子内或分子间形成了醛键，使得不少少抗原决定簇被封闭抗原决定簇被封闭。同时，由于甲醛的聚合作用，使蛋白质分同时，由于甲醛的聚合作用，使蛋白质分子间相互子间相互交联交联形成大分子网络，也导致了形成大分子网络，也导致了抗原决定簇被掩盖抗原决定簇被掩盖。因此，抗原修复是影响免疫组化染色结果因此，抗原修复是影响免疫组化染色结果的基本因素的基本因素 抗原修复(Antigen retrieval ，AR)技术抗原修复是指切片免疫组织化学（IHC）前用胰蛋白酶、尿素、表面活性剂、微波缓冲液和金属盐等，使被掩盖的抗原决定簇或变性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢复过程。AR非加热技术非加热技术：

15、蛋白酶消化蛋白酶消化或酸水解或酸水解加热技术加热技术：微波、水浴、高压锅：微波、水浴、高压锅酶消化酶消化 (1)(1)原理：原理： 1)1)去除覆盖于抗原决定簇表面的杂去除覆盖于抗原决定簇表面的杂蛋白蛋白 2)2)断交联断交联胰蛋白酶：胰蛋白酶：0.05%0.05%0.10.1胰蛋白酶加胰蛋白酶加入等量的氯化钙，用入等量的氯化钙，用0.1N 0.1N NaOHNaOH调调pHpH至至7.87.8。消化时间。消化时间37 30min37 30min。 主要用于主要用于细胞内细胞内抗原的修复抗原的修复胃蛋白酶胃蛋白酶 0.4%0.4%胃蛋白酶，用胃蛋白酶，用0.1N HCI0.1N HCI稀释，稀

16、释，消化时间消化时间37 3037 30180min180min。主要用于细胞主要用于细胞间抗原的消化间抗原的消化。此外还有此外还有蛋白酶蛋白酶K K、链酶蛋白酶、无花果蛋链酶蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶等（细胞内白酶、菠萝蛋白酶等（细胞内抗原修复抗原修复）工作中要认真参照抗体说明书指示进行消化工作中要认真参照抗体说明书指示进行消化酶的选择酶的选择修复方式：修复方式： 微波微波9610min29610min2； 直接加温直接加温100100，15min15min； 水浴锅水浴锅100100，15min15min； 高压锅高压锅/ /消毒锅消毒锅120120，5min5min； 真空加热真空

17、加热10min10min；修复介质：修复介质： 0.01M pH6.00.01M pH6.0柠檬酸柠檬酸缓冲液缓冲液(CB)(CB)；0.05mTris-HCL(pH1-120.05mTris-HCL(pH1-12系列系列););0.01M pH7.0 PBS;0.01M pH7.0 PBS;2%2%硫酸铝；硫酸铝；2 2硝酸铝；硝酸铝；生理盐水；生理盐水；蒸馏水。蒸馏水。修复介质种类和溶液的摩尔浓度对修复效修复介质种类和溶液的摩尔浓度对修复效果影响较小，而果影响较小，而pHpH值则影响较大。缓冲液值则影响较大。缓冲液以以CBCB和和TrisTris-HCL-HCL较常见。较常见。形态学结构的

18、改变形态学结构的改变：一般经高温修复后胞浆：一般经高温修复后胞浆无明显的破坏，而对细胞核内影响较大，会无明显的破坏，而对细胞核内影响较大，会出现核破裂，苏木素淡染等现象。出现核破裂，苏木素淡染等现象。 热处理后自然冷却热处理后自然冷却2、冰冻切片或细胞涂片的处理、冰冻切片或细胞涂片的处理一般不需抗原修复一般不需抗原修复一般脂质细胞膜保存完整（除非用丙酮、一般脂质细胞膜保存完整（除非用丙酮、乙醇固定）乙醇固定）为了使抗体等大分子透过，需在为了使抗体等大分子透过，需在膜上打缺膜上打缺口口冰冻切片或细胞涂片的处理冰冻切片或细胞涂片的处理1、非离子型表面活性剂非离子型表面活性剂：TritonX-100

19、等等0.1%-0.5%，加入，加入 漂洗液或抗体稀释液中使用漂洗液或抗体稀释液中使用2、将固定并粘附的载玻片通过、将固定并粘附的载玻片通过上升乙醇到二甲上升乙醇到二甲苯，再下降乙醇到水苯，再下降乙醇到水3、反复冻融反复冻融：蔗糖防冻处理，低温：蔗糖防冻处理，低温-70速冻，速冻，室温融化，反复室温融化，反复2-3次。次。免疫反应前处理免疫反应前处理3减少非特异性着色减少非特异性着色1、内源性酶或生物素：内源性酶或生物素：用其特异性底物或亲和用其特异性底物或亲和物将其封闭；物将其封闭；2、离子和电荷吸附：离子和电荷吸附：用特异性抗体来源的同种用特异性抗体来源的同种动物灭活动物灭活非免疫血清非免疫

20、血清，预处理。结合弱，不冲洗，预处理。结合弱，不冲洗3、一抗的稀释程度一抗的稀释程度：预实验：预实验4、冲洗程度：冲洗程度：除了封闭血清不需要冲洗之外，除了封闭血清不需要冲洗之外，其余每一步都需液冲洗其余每一步都需液冲洗3次次5次。常用次。常用PBS六、免疫组织化学的主要方法六、免疫组织化学的主要方法根据根据AgAbAgAb结合方式结合方式分成：分成： 直接法直接法 间接法间接法 多层法多层法直接法直接法 荧光素或酶等直接标记特异性荧光素或酶等直接标记特异性抗体（一抗）上，标记抗体与抗原抗体（一抗）上，标记抗体与抗原结合（在切片上）结合（在切片上） 优点：优点：简单，时间短，特异性强。简单，时

21、间短，特异性强。缺点：缺点：灵敏度低，所需抗体量大灵敏度低，所需抗体量大（不经济），每一种抗原都需制备（不经济），每一种抗原都需制备其标记抗体其标记抗体应用：应用：基本不用了！（免疫荧光染基本不用了！（免疫荧光染色法除外）色法除外）间接法间接法 标记物标记在二抗上。显色后镜检标记物标记在二抗上。显色后镜检 特点：特点：较直接法灵敏（一抗上至少可以结较直接法灵敏（一抗上至少可以结合两个二抗）；带标记的二抗，可定位多种合两个二抗）；带标记的二抗，可定位多种抗原抗原 常用与免疫荧光、免疫金技术常用与免疫荧光、免疫金技术多层法多层法按按标记物的性质标记物的性质分成分成 免疫荧光技术免疫荧光技术 免疫酶

22、技术（酶标抗体法、桥免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、法、PADPAD法、法、 ABCABC法）法） 免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金染色法、蛋白免疫金染色法、蛋白A A金法）金法）六、免疫组织化学的主要方法六、免疫组织化学的主要方法 . .异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素 FITC FITC . .四乙基罗达明四乙基罗达明 . .四甲基异硫氰酸罗达明四甲基异硫氰酸罗达明 . .藻红蛋白藻红蛋白 呈现不同的荧光：呈现不同的荧光： 绿色荧光绿色荧光 (FITC)(FITC) 橙色荧光橙色荧光 橙红色荧光橙红色荧光 红色荧光红色荧光等等 免疫荧光技术免疫荧光技术免疫荧光组织化

23、学染色方法免疫荧光组织化学染色方法 1.1.直接法：直接法：简便、快速，用已知特异性标记简便、快速，用已知特异性标记荧光的一抗与组织细胞内抗原结合。荧光的一抗与组织细胞内抗原结合。操作流程：操作流程：(1)(1)冰冻切片经固定，凉干冰冻切片经固定，凉干PBSPBS洗；洗；石蜡切片脱蜡至水，石蜡切片脱蜡至水，消化消化30min30min，PBSPBS洗。洗。(2)(2)适当稀释适当稀释荧光抗体滴加在组织切片上，荧光抗体滴加在组织切片上，湿盒湿盒内内3737温育温育1h1h，PBSPBS洗洗33min33min。(3)0.01%(3)0.01%伊文氏蓝衬染伊文氏蓝衬染1 13min3min，PBS

24、PBS洗洗33min33min，蒸馏水洗蒸馏水洗2 2次，除去次，除去NaClNaCl结晶。结晶。(4)pH9.0(4)pH9.0甘油缓冲液甘油缓冲液（磷酸盐）封片。（磷酸盐）封片。 （必须无自发荧光，无色透明必须无自发荧光，无色透明 ） (5)(5)镜检镜检海马细胞 微管蛋白 绿色(胞体、树突) 轴突终末蛋白 红色(突触) 培养的成纤维细胞培养的成纤维细胞 微管呈绿色微管呈绿色 核呈蓝色核呈蓝色2.2.间接法间接法 是直接的重要改进，先用特异是直接的重要改进，先用特异性一抗与组织细胞内抗原结合，随后用荧性一抗与组织细胞内抗原结合，随后用荧光标记二抗与一抗特异性结合。光标记二抗与一抗特异性结合

25、。荧光双标记技术荧光双标记技术应用免疫荧光技术在应用免疫荧光技术在同一张组织切片上同一张组织切片上同同时或先后显示时或先后显示两种或两种以上的抗原两种或两种以上的抗原成分，成分，即谓即谓双重双重或或多重多重免疫标记。免疫标记。此理论同时也可应用到其他免疫技术。如：此理论同时也可应用到其他免疫技术。如：免疫酶双重标记；免疫胶体金标记。免疫酶双重标记；免疫胶体金标记。显示的水平可以是光镜，也可以是电镜显示的水平可以是光镜，也可以是电镜 常用的荧光素配伍主要为：异硫氰酸荧光常用的荧光素配伍主要为：异硫氰酸荧光素素(FITC)(FITC)呈绿色与罗丹明呈绿色与罗丹明(RB200)(RB200)或异硫氰

26、或异硫氰酸四甲基罗丹明酸四甲基罗丹明（TRITCTRITC）呈红色。呈红色。 技术方法敏感、特异，需选用各自特技术方法敏感、特异，需选用各自特定的激发滤光片分别观察或二次曝光显影，定的激发滤光片分别观察或二次曝光显影，样本不能长期保存。样本不能长期保存。 细胞结构不清晰细胞结构不清晰免疫酶组化免疫酶组化免疫学免疫学(抗原抗体反应抗原抗体反应)酶细胞化学酶细胞化学(底物显色反应底物显色反应)+特异性特异性敏感性敏感性定位性定位性可视性可视性免疫酶技术免疫酶技术基本原理：基本原理：抗原一抗抗原一抗酶标记酶标记抗体或抗体或扛酶抗体扛酶抗体通过通过酶与底物作用酶与底物作用生成有色反应物，定位生成有色反

27、应物，定位组织或细胞内抗原的一门技术。组织或细胞内抗原的一门技术。1 1、酶标抗体：、酶标抗体：酶分子与抗体分子共价结合，要求此种结合既不改变抗体的免疫反应活性，也不影响酶的生物化学活性 2 2、扛酶抗体、扛酶抗体：抗体与酶的结合为抗原抗体：抗体与酶的结合为抗原抗体反应，避免了共价结合，保护了酶和抗体反应，避免了共价结合，保护了酶和抗体的活性。的活性。标记酶选择标准：标记酶选择标准： 该该酶酶用用细细胞胞化化学学易易于于被被检检出出，能能被被光镜或电镜观察。光镜或电镜观察。 酶酶反反应应产产物物须须稳稳定定，不不扩扩散散，具具有有良好定位。良好定位。 酶易于纯化，获得纯制品。酶易于纯化，获得纯

28、制品。 酶与免疫球蛋白结合后，不丧失其活性。酶与免疫球蛋白结合后，不丧失其活性。 酶在酶在PHPH中性液内较稳定。中性液内较稳定。 组织中不应存在与底物作用的内源性酶组织中不应存在与底物作用的内源性酶。常用的标记酶常用的标记酶辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶（一）辣根过氧化物酶（一）辣根过氧化物酶（HRP）分分子子量量（40000），不不会会遮遮盖盖抗抗原原的的结结合合部部位位，易易穿过细胞膜穿过细胞膜稳定，耐受稳定，耐受63加热加热15min，易获得较高纯度酶，易获得较高纯度酶具有较高活性及特异性具有较高活性及特异性可溶性佳，生成的产物不扩散可溶性佳，

29、生成的产物不扩散组织中内源性酶较少组织中内源性酶较少可作用于多种底物，产生不同颜色可作用于多种底物，产生不同颜色HRPHRP的底物：的底物： HRPHRP的底物为低浓度的的底物为低浓度的H H2 2O O2 2 显色：显色：DABDAB（二氨基联苯胺）（二氨基联苯胺）内源性过氧化物酶的消除方法：内源性过氧化物酶的消除方法：1.0.3%3%H2O2甲醇液甲醇液20min2.1H2O220min3.3苯肼溶液苯肼溶液371h4.0.075%盐酸甲醇液盐酸甲醇液30min （二（二）碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（AKPAKP） 从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取 组织穿透能力较弱组织

30、穿透能力较弱 内源性内源性AKPAKP较高较高 左旋咪唑具有抑制作用左旋咪唑具有抑制作用 AKP底物：底物：AKP常常用用的的底底物物为为-萘萘酚酚AS-B1磷酸盐磷酸盐偶联试剂：偶联试剂：固兰固兰BB蓝色蓝色固红固红TR红色红色内源性碱性磷酸酶的消除方法内源性碱性磷酸酶的消除方法 1. 101. 10醋酸醋酸 10min10min 2. 0.5mol/L 2. 0.5mol/L碳酸氢钠（碳酸氢钠（pH9.0pH9.0） 20min20min 3. 1mol/L 3. 1mol/L左旋咪唑左旋咪唑 20min20min （三）葡萄糖氧化酶（三）葡萄糖氧化酶（GODGOD） 底物为葡萄糖，终产物

31、稳定底物为葡萄糖，终产物稳定 体内无内源性体内无内源性GODGOD 分子量大，穿透力较弱分子量大，穿透力较弱 分分子子具具有有较较多多的的氨氨基基，标标记记时时容容易易形形成广泛的聚合，影响酶的活性。成广泛的聚合，影响酶的活性。 多用于双标实验多用于双标实验酶标记抗体法酶标记抗体法酶酶标标记记抗抗体体法法（EnzaymeEnzayme LabelledLabelled antibodyantibody）是是将将酶酶通通过过共共价价键键结结合合在在抗抗体体分分子子上上，制制备备成成酶酶标标记记抗抗体体，通通过抗体去寻找相应抗原。过抗体去寻找相应抗原。一、直接法一、直接法原理：原理：HRP标记在特

32、异性抗体标记在特异性抗体（第一抗体）上（第一抗体）上抗原抗原-抗体抗体HRP复合物复合物组织抗原组织抗原第一抗体第一抗体过氧化物酶过氧化物酶直接法直接法步骤：步骤：一步完成一步完成特特点点：方方法法简简便便、省省时时，专专一一性性强强，非非特特异异染染色色轻轻，但但敏敏感感性性差差，一种标记抗体只能检测一种抗原。一种标记抗体只能检测一种抗原。二、间接法二、间接法原理：原理：HRP标记在第二抗体上，标记在第二抗体上，抗原抗原-特异性抗体特异性抗体-第第二抗体二抗体HRP复合物复合物步骤：步骤：二步法二步法组织抗原组织抗原第一抗原第一抗原第二抗体第二抗体过氧化物酶过氧化物酶间接法间接法一抗和二抗必

33、须是不同一抗和二抗必须是不同种属的动物制备的，二种属的动物制备的，二抗是用第一种动物的抗是用第一种动物的IgGIgG所制备的所制备的特特点点：敏敏感感性性较较直直接接法法高高，一一种种标标记记抗抗体体能能用用于于相相应应动动物物制制备备的的多多种种特特异异性性抗抗体体，检检测测多多种种抗抗原原。但但较较直直接接法法费费时时，非非特特异异染染色色稍稍重重。 非标记抗体酶法非标记抗体酶法 （酶抗酶法）（酶抗酶法） 酶酶不不是是作作为为标标记记物物，而而是是作作为为抗抗原原，用来制备抗这种酶的抗体用来制备抗这种酶的抗体 酶桥法、酶桥法、PAPPAP法法 酶桥法酶桥法组织抗原组织抗原第一抗体第一抗体第

34、二抗体（桥抗体）第二抗体（桥抗体）第三抗体（抗酶抗体）第三抗体（抗酶抗体）HRP一抗和三抗需用同一种属动物制备一抗和三抗需用同一种属动物制备二抗为抗上述动物二抗为抗上述动物IgGIgG的抗体的抗体酶桥法的优缺点酶桥法的优缺点优点：优点：酶未标记在任何抗体上，而是通过免疫学原理酶未标记在任何抗体上，而是通过免疫学原理与抗体结合的，避免了共价结合对之的影响；灵敏与抗体结合的，避免了共价结合对之的影响；灵敏度高度高缺点：缺点：1 1、抗酶抗体中有、抗酶抗体中有高、低亲和力高、低亲和力的两类抗体。低亲和的两类抗体。低亲和力的抗体结合较弱，漂洗易丢失，降低敏感性力的抗体结合较弱，漂洗易丢失，降低敏感性2

35、 2、抗酶抗体中，、抗酶抗体中，有非特异性抗体有非特异性抗体，其抗原性与抗酶，其抗原性与抗酶抗体相同，也可与桥抗体结合，但不能与酶结合，抗体相同，也可与桥抗体结合，但不能与酶结合，影响抗原的显示影响抗原的显示PAPPAP法法原原 理理 ： 抗抗 原原 -第第 一一 抗抗 体体 -第第 二抗体（桥抗体）二抗体（桥抗体）-PAP-PAP复合物复合物步骤：步骤：三步法三步法PAP复合物复合物酶（酶（HRPHRP）和抗酶抗体的复合物）和抗酶抗体的复合物3 3个酶分子个酶分子2 2个抗酶抗体个抗酶抗体优点：优点：结构稳定，冲洗时不会脱落；灵结构稳定，冲洗时不会脱落；灵敏度大为提高；不易引起非特异性染色敏

36、度大为提高；不易引起非特异性染色缺点：缺点：PAPPAP复合物制备较复杂，分子较大，复合物制备较复杂，分子较大，穿透力不强，不适合于电镜标本穿透力不强，不适合于电镜标本组织抗原组织抗原第一抗原第一抗原第二抗体第二抗体PAP复合物复合物PAP法法HRP一抗与一抗与PAPPAP必须为同一种必须为同一种属动物属动物 二抗必须过量二抗必须过量双双PAPPAP法：法：原原理理：在在PAPPAP的的基基础础上上再再重重复复第第二二抗抗体和体和PAPPAP复合物复合物抗原抗原-特异性抗体特异性抗体-第二抗体（桥抗第二抗体（桥抗体）体）-PAP -PAP -第二抗体第二抗体-PAP-PAP复合物复合物组织抗原

37、组织抗原第一抗原第一抗原第二抗体第二抗体PAP复合物复合物双双PAP法法HRP双双PAP法法组织抗原组织抗原第一抗原第一抗原第二抗体第二抗体PAP复合物复合物HRP步骤：步骤：五步法五步法特点：特点：敏感性较高敏感性较高缺点：缺点：但步骤多，费时但步骤多，费时免疫亲合技术免疫亲合技术原理：原理：利用抗生物素（利用抗生物素（avidinavidin）和生物）和生物素（素（biotinbiotin）的高亲和力。）的高亲和力。1 1个抗生物素分子可结合个抗生物素分子可结合4 4个生物素个生物素生物素可结合标记大分子如抗体、酶等生物素可结合标记大分子如抗体、酶等抗生物素可用酶、胶体金、荧光色素等抗生物

38、素可用酶、胶体金、荧光色素等标记标记与免疫酶法没有原则区别与免疫酶法没有原则区别一一 、ABC法法Avidin-Biotin-peroxidaseComplextechnique抗生物素生物素过氧化物酶复抗生物素生物素过氧化物酶复合物技术合物技术酶酶+Biotin+BiotinAvidinAvidin -ABC -ABC复合物复合物生物素化二抗生物素化二抗抗抗原原-特特异异抗抗体体- - BiotinBiotin标标记记的的二二抗抗- - AvidinAvidin Biotin HRP Biotin HRP 组织抗原组织抗原第一抗体第一抗体第二抗体第二抗体HRP生物素生物素抗生物素抗生物素AB

39、C法法步骤：步骤：三步法三步法特特点点：敏敏感感性性较较高高（比比PAP高高2040倍倍）；特特异异性性强强；应应用用范范围围广广某某 些些 脏脏 器器 存存 在在 内内 源源 性性 生生 物物 素素 干扰（肝、肾、白细胞等）干扰（肝、肾、白细胞等） 可可预预先先用用0.010.01抗抗生生物物素素和和0.010.01生生物物素素溶溶液液分分别别作作用用20min20min以以消消除除，PBAPBA冲洗干净冲洗干净 抗抗生生物物素素与与核核酸酸及及细细胞胞膜膜中中磷磷脂脂有非特异反应有非特异反应免疫组化染色步骤免疫组化染色步骤1 1切片脱蜡入水，入切片脱蜡入水，入PBS PBS 洗三次洗三次/

40、15/15分钟。分钟。抗原修复抗原修复2 2封闭内源性过氧化物酶。用新配置的封闭内源性过氧化物酶。用新配置的0.30.3H H2 2O O2 2 （在在PBSPBS或或0.05Tris HCL0.05Tris HCL缓冲液缓冲液pH 7.6pH 7.6中或甲醇中）中或甲醇中）室温，室温，30 30 分钟。分钟。3 3水洗，入水洗，入PBSPBS，洗三次，每次洗三次，每次5 5分钟。分钟。4 4减少非特异性着色：用稀释减少非特异性着色：用稀释5-205-20倍的正常血清倍的正常血清（产生二次抗体动物血清！），室温，（产生二次抗体动物血清！），室温，3030分钟分钟。 5 5滴加第一抗体，滴加第一

41、抗体，44过夜或室温过夜或室温30-3h30-3h。6 60.1MPBS0.1MPBS，洗三次，每次洗三次，每次5 5分钟。分钟。7 7滴加第二抗体，室温滴加第二抗体，室温15- 6015- 60。8 80.1MPBS 0.1MPBS 洗净，洗三次，每次洗净，洗三次，每次5 5分钟。分钟。9 9滴加滴加ABCABC复合物，室温复合物，室温15-6015-60分钟。分钟。10100.1MPBS 0.1MPBS 洗三次，每次洗三次，每次5 5分钟。分钟。11110.05M 0.05M TrisTris HCL 5-10 HCL 5-10分钟，此步可省分钟，此步可省略。略。1212DABHDABH2

42、 2O O2 2 显色：用显色：用0.010.01H H2 2O O2 2的的DABDAB溶溶液，室温液，室温5-305-30分钟，随时镜检（分钟，随时镜检（DABDAB用时新配）用时新配）1313自来水洗净。自来水洗净。1414用用Mayer Mayer 苏木精或苏木精或0.50.5甲基绿，复染胞甲基绿，复染胞核（可不染）。核（可不染）。1515常规脱水、透明、封固、镜检。常规脱水、透明、封固、镜检。结果：结果：棕褐色反应产物代表抗原棕褐色反应产物代表抗原X X的定位。的定位。二、二、SABC法法Streptavidin biotin Peroxidase Complex（标标记记链链霉霉抗

43、抗生生物物素素生生物素法）物素法）步骤相似，步骤相似，SABC法已代替法已代替ABC法法链霉亲合素（链霉抗生物素）链霉亲合素（链霉抗生物素）从从链霉菌分离出来的一种蛋白质，与生链霉菌分离出来的一种蛋白质，与生物素也能特异性结合（物素也能特异性结合（4 4个结合位点）个结合位点）可以排除亲合素（抗生物素）可以排除亲合素（抗生物素）与一些与一些组织的内源性物质非特异性结合组织的内源性物质非特异性结合多聚合物酶法多聚合物酶法原原理理：采采用用一一种种具具有有惰惰性性的的多多聚聚化化合合物物作作为为骨骨架架，将将特特异异性性抗抗体体和和HRPHRP，同同时时标标记记在在多多聚聚合合物物分分子子上上，形

44、形成成HRP-HRP-多多聚聚合合物物-特异性抗体。特异性抗体。 组织抗原组织抗原一抗一抗HRP多聚多聚骨架骨架EPOS方法方法步骤：步骤：一步法一步法特点：特点：快速，简便，特异性强，快速，简便，特异性强，敏感性高敏感性高但商品化种类不全，但商品化种类不全，价格昂贵价格昂贵免疫组化染色基本技术注意事项免疫组化染色基本技术注意事项1 1AbAb滴片技术滴片技术 所滴的抗体应与切片上的组织刚好吻合。所滴的抗体应与切片上的组织刚好吻合。注意注意 滴抗体前需把切片上的水甩干滴抗体前需把切片上的水甩干2Ab孵育技术孵育技术（1）必须在湿盒内进行，以防抗体的蒸发和干片。）必须在湿盒内进行，以防抗体的蒸发

45、和干片。（2）温度与时间）温度与时间 4：过夜，：过夜， 16 37：1 h or 参考说明书参考说明书3、整个染色过程不能干片、整个染色过程不能干片免疫组化应注意的事项免疫组化应注意的事项1 1、必须设置、必须设置对照对照（阳性对照和阴性对照）（阳性对照和阴性对照）2 2、抗原、抗原表达必须在特定部位表达必须在特定部位阳性表达必阳性表达必须在细胞的特定部位才能视为阳性须在细胞的特定部位才能视为阳性3 3、阳性表达阳性表达有强弱、多少之分；有强弱、多少之分；4 4、应结合临床资料、应结合临床资料、X X线等影像学及实验结线等影像学及实验结果综合分析。果综合分析。5 5、尽尽量量避避开开出出血血

46、、坏坏死死及及切切片片刀刀痕痕和和界界面面边边缘缘细细胞胞的的阳阳性性表表达达，特特别别是是酶酶免免疫疫标标记记。因因为为这这类类阳阳性性着着色色多多系系内内源源干干扰扰，或系人为因素所致。或系人为因素所致。假阳性和假阴性假阳性和假阴性假阴性：假阴性：1 1、抗体抗体已失活或浓度不当或抗体本身达不已失活或浓度不当或抗体本身达不到应有的敏感度到应有的敏感度2 2、抗原抗原丢失或减弱，当标本处理不当时更丢失或减弱，当标本处理不当时更容易出现，如固定不良、温度过高；容易出现，如固定不良、温度过高； 3 3、操作步骤不当操作步骤不当，即技术上的失误，如反，即技术上的失误，如反应时间不够或过久、洗脱不够

47、等。应时间不够或过久、洗脱不够等。假阳性和假阴性假阳性和假阴性假阳性：假阳性：1 1、抗体与多种抗原有、抗体与多种抗原有交叉交叉反应；反应；2 2、抗体与组织中某些成分的、抗体与组织中某些成分的非特异性结合非特异性结合3 3、内源性酶内源性酶的显色的显色4 4、肿瘤或病变中有其他组织残留、肿瘤或病变中有其他组织残留5 5、抗原的弥散或被瘤细胞吞噬而细胞中的、抗原的弥散或被瘤细胞吞噬而细胞中的免疫球蛋使抗原在不该出现的部位出现。免疫球蛋使抗原在不该出现的部位出现。实验设计内容实验设计内容1 1、样品制备、样品制备样品切片、贴片样品切片、贴片2 2、HEHE染色染色3 3、多糖的、多糖的PASPA

48、S反应反应4 4、核酸的、核酸的FeulgenFeulgen反应和反应和AOAO染色染色5 5、碱性磷酸酶的钙钴法、碱性磷酸酶的钙钴法石蜡切片和血涂片石蜡切片和血涂片6 6、免疫组织化学、免疫组织化学小鼠细胞小鼠细胞actinactin蛋白的检测蛋白的检测实验设计内容实验设计内容要求：要求：1 1、分组设计实验内容，、分组设计实验内容，下周三交。下周三交。成绩分成绩分组记录组记录2 2、分组制作、分组制作PPTPPT，讲述、讨论并修改实验，讲述、讨论并修改实验过程。过程。下周五进行下周五进行3 3、分组安排试剂配置任务，在实验前准备、分组安排试剂配置任务，在实验前准备好。好。下周五确定任务。下周五确定任务。