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1、2024/7/2411 China Medical University Department of Medical Genetics 二 Li fucai 2021.1022 2、肿瘤抑制基因、肿瘤抑制基因Tumor Suppression Gene-TSGTumor Suppression Gene-TSG存在于正常细胞中能够抑制细胞恶性转化，对细胞的增殖存在于正常细胞中能够抑制细胞恶性转化，对细胞的增殖起负性调节作用的基因，其失活使正常细胞增殖失控，进而转化形起负性调节作用的基因，其失活使正常细胞增殖失控，进而转化形成肿瘤细胞。成肿瘤细胞。其作用恰好与癌基因相反，其失活的其作用恰好与癌基
2、因相反，其失活的TSG突变、丧失功能突变、丧失功能常发现于人类肿瘤样本中。这些基因编码抑制细胞增殖的蛋白常发现于人类肿瘤样本中。这些基因编码抑制细胞增殖的蛋白,抑制肿瘤细胞增殖。抑制肿瘤细胞增殖。3 TSG TSG：在正常情况下对细胞的繁殖具有负：在正常情况下对细胞的繁殖具有负调节作用，抑制癌基因。调节作用，抑制癌基因。 Sager Sager于于19901990年指出，在癌的发生过程年指出，在癌的发生过程中，需要基因改变，即癌基因的激活和抑中，需要基因改变，即癌基因的激活和抑癌基因的失活或丧失，二者在细胞繁殖的癌基因的失活或丧失，二者在细胞繁殖的调控中起着正负信号的调节作用。调控中起着正负信
3、号的调节作用。现有抑癌基因现有抑癌基因3030多种。多种。抑癌基因的发现和深入研究乃是癌分子遗抑癌基因的发现和深入研究乃是癌分子遗传学的一重大突破，很大程度上答复了癌传学的一重大突破，很大程度上答复了癌发生这个长期难以解答的问题。发生这个长期难以解答的问题。41TSG的发现及其研究途径的发现及其研究途径TSG存在的证据存在的证据肿瘤的发生不仅仅涉及显性癌基因激肿瘤的发生不仅仅涉及显性癌基因激活，而且还涉及其它隐性基因的功能活，而且还涉及其它隐性基因的功能丧失，这其它基因就是抑癌基因。丧失，这其它基因就是抑癌基因。5细胞融合实验细胞融合实验 Harris Harris19711971年和年和Kl
4、einKlein等实验等实验 鼠正常细胞鼠正常细胞肿瘤细胞肿瘤细胞 丧失成瘤性丧失成瘤性 鼠鼠 杂种细胞表型正常杂种细胞表型正常 继续培养继续培养 形成肿瘤形成肿瘤 鼠鼠 出现逆分化肿瘤表出现逆分化肿瘤表型型 肿瘤的抑制与正常染色体存在着相关性，正肿瘤的抑制与正常染色体存在着相关性，正常染色体上有抑制肿瘤效应的遗传物质常染色体上有抑制肿瘤效应的遗传物质TSGTSG。 逆向发生肿瘤现象可能是杂种细胞中携带抑逆向发生肿瘤现象可能是杂种细胞中携带抑癌基因丧失。癌基因丧失。6 Stolet Stolet和和ShimizuShimizu微细胞转移实验微细胞转移实验微细胞含单个染色体微细胞含单个染色体转转
5、移移肿瘤细胞肿瘤细胞肿瘤生长抑制。肿瘤生长抑制。证明抑制基因存在于单个染色体上，并将证明抑制基因存在于单个染色体上，并将TSG在染色体上定位。在染色体上定位。7例例如：如：肿瘤细胞肿瘤细胞 转移染色体转移染色体 肿瘤生长抑制肿瘤生长抑制视网膜母视网膜母C C瘤瘤 13 +13 +Wilms Wilms 11 11 + +神经母细胞瘤神经母细胞瘤 17 +17 + 8家族性癌的研究家族性癌的研究A。视网膜母细。视网膜母细胞瘤胞瘤Rb Gene Rb Gene 是是最早发现的最早发现的TSG TSG ，证据，证据来自于对视来自于对视网膜母细胞网膜母细胞瘤的研究。瘤的研究。9遗传型遗传型散发型散发型
6、10 与与KnodsonKnodson二次打击学说是一致的，二次打击学说是一致的，Rb GeneRb Gene缺失或功能缺失或功能丧失，失去对肿瘤细胞的抑制作用，认为丧失，失去对肿瘤细胞的抑制作用，认为Rb Gene Rb Gene 为为TSGTSG。11B、Wilms瘤瘤在在WilmsWilms瘤患者中发现瘤患者中发现11p13-11p13-，WT1 WT1 Gene Gene定位于定位于11p13 11p13 区域，区域，认为认为WT1WT1为为 TSGTSG。WT1 10WT1 10个外显子，个外显子，50kb50kb，传录本，传录本 3kb3kb，编码，编码46464949a a的蛋白
7、质。的蛋白质。12、家族性腺瘤样息肉、家族性腺瘤样息肉 家族性腺瘤样息肉家族性腺瘤样息肉familial familial adenomatousadenomatouspolyposispolyposis eneene定位于定位于p p，即，即基因，转录本基因，转录本.4kb,.4kb,编码编码2844Aa2844Aa的蛋白的蛋白 质，质， 其突变引起家族性腺瘤样息肉其突变引起家族性腺瘤样息肉-癌。癌。APCAPC基因被认为是基因被认为是TSGTSG。13杂合性丧失杂合性丧失杂合性丧失杂合性丧失Loss of heterozygosity, Loss of heterozygosity, LO
8、H LOH 应用于检测、鉴定应用于检测、鉴定TSG TSG 。LOHLOH：杂合时某一等位基因片段丧失。：杂合时某一等位基因片段丧失。14LOHLOH：杂合时某一等位基因片段丧失：杂合时某一等位基因片段丧失1516LOH17PCR产物序列分析产物序列分析18视网膜母细胞瘤的遗传分析视网膜母细胞瘤的遗传分析前三种情况前三种情况1 1、2 2和和3 3，肿瘤组织中正常等位基因，肿瘤组织中正常等位基因丧失丧失A A，这称为杂合性丧失。，这称为杂合性丧失。192025个遗传标记个遗传标记-10个病例个病例21选择遗传标记跨基因选择遗传标记跨基因TSG，遗传标记与侯选，遗传标记与侯选TSG相邻，相邻，遗
9、传标记的缺失就意味着遗传标记的缺失就意味着TSG丧失。在肿瘤细胞中丧失。在肿瘤细胞中LOH提示提示TSG的存在，在染色体某一区域的存在，在染色体某一区域LOH频率高，可能为频率高，可能为TSG的的侯选位点。侯选位点。LOH的方法鉴定了的方法鉴定了p53Gene，位于，位于17p12APCGene位于位于5q21等等LOHMIMicrosatelliteinstabilityNTNT LOHLOH MIMI222TSG的功能的功能 TSG TSG 参与细胞周期复杂调控等，即作为参与细胞周期复杂调控等，即作为一种负性调节因子一种负性调节因子negative regulationnegative r
10、egulation。其中。其中RBRB基因和基因和P53P53基因在细胞周期调控基因在细胞周期调控进展中起重要作用，它们的产物在肿瘤细进展中起重要作用，它们的产物在肿瘤细胞中经常同时失活。胞中经常同时失活。抑癌基因的产物及功能主要包括：抑癌基因的产物及功能主要包括：23转录调节因子，如转录调节因子，如:Rb:Rb、p53p53；负调控转录因子，如负调控转录因子，如:WT:WT；周期蛋白依赖性激酶抑制因子周期蛋白依赖性激酶抑制因子CKICKI，如如:p15:p15、p16p16、p21p21；信号通路的抑制因子，如信号通路的抑制因子，如:ras GTP:ras GTP酶活酶活化蛋白化蛋白NF-1
11、NF-1，磷脂酶，磷脂酶PTENPTEN；DNADNA修复因子，如修复因子，如:BRCA1:BRCA1、BRCA2BRCA2。与发育和干细胞增殖相关的信号途径组与发育和干细胞增殖相关的信号途径组分，如分，如:APC:APC、AxinAxin等等 24RBGene产物的功能产物的功能RBGene转录转录mRNA翻译翻译110kD(pRb核蛋白核蛋白)调控调控细胞增殖细胞增殖RBRB广泛表达，编码广泛表达，编码110Kda110Kda核蛋白核蛋白pRBpRB。对控制细胞增殖。对控制细胞增殖起重要作用。起重要作用。2526 Rb Gene Rb Gene 突变 Cyclin CDK，CKI 磷酸化
12、pRb蛋白 pRb蛋白 激活 去磷酸化 失活 pRb降解病毒蛋白 EIA/SV40T E2F MDM2Gene扩增Gene产物抑制pRb 调节 G1期 癌基因变化 DNA损伤 S期 C增殖 P53 失 控 Apoptosis 复制终止 C过度增殖 直至修复 癌变 27磷酸化磷酸化A A正常情况正常情况 pRbpRb激活激活 失活失活 去磷酸化去磷酸化 它的局部作用是调控一组细胞转录因子-E2F。细胞周期进入S期前2-4hrpRb 磷酸化而失活，解除对E2F的抑制使细胞进入S期。 28B、磷酸化是由一套、磷酸化是由一套Cyclin、CDK激酶、激酶、CKI控制，即控制细胞周期中重要的检控制，即控
13、制细胞周期中重要的检控点控点checkpoint。C、MDM2癌基因与癌基因与pRb结合并抑制结合并抑制pRb，而有利细胞周期进展。而有利细胞周期进展。D、某些病毒癌基因蛋白、某些病毒癌基因蛋白EIA、SV40T抗抗原，人乳头了瘤病毒原，人乳头了瘤病毒E7蛋白相结合，使蛋白相结合，使pRb降解，或直接使降解，或直接使pRb基因突变功能丧失。基因突变功能丧失。29 p53p53与细胞凋亡与细胞凋亡 : : 在在Gene Gene 控制控制下细胞程序化死亡。下细胞程序化死亡。 A、停止细胞复制损伤的DNA。 B、参于细胞周期G1/S阶段的Checkpoint细胞缺少p53或含有其突变时，就不能停止
14、于G1期，而损伤DNA的复制可导致遗传的变化。 C、与细胞死亡有关，调节细胞凋亡。这是高水平的细胞结构自然选择的防御。癌的发生就是这一控制功能的丧失。证明缺乏p53的细胞不能进行凋亡。 现已发现有30多种TSG，近年发现的有FHIT、PTENMMAC1等。30313233P53基因与其它基因间的相互作用基因与其它基因间的相互作用343 3、增变基因、增变基因增变基因：在确保遗传信息的完整性上起一定作增变基因：在确保遗传信息的完整性上起一定作用，其突变导致用，其突变导致DNADNA复制和修复障碍。复制和修复障碍。研究说明，肿瘤表现遗传不稳定性：研究说明，肿瘤表现遗传不稳定性： 数目异常数目异常
15、核型异常核型异常 结构异常结构异常 都和增都和增变基因突变相关。变基因突变相关。 LOH LOH DNA DNA MI MI 35增变基因增变基因19931993年年FishelFishel在在E.ColiE.Coli和和yeastyeast中发现中发现, ,并并将将MutHLSMutHLS基因称为基因称为mutater genemutater gene。这些基。这些基因编码一种错误改正系统因编码一种错误改正系统-检查检查DNADNA错配的碱基对。错配的碱基对。增变基因突变增变基因突变会导致会导致10010010001000倍突变率的倍突变率的增加。增加。故现在又称为故现在又称为DNADNA错
16、配修复基因。错配修复基因。FishelFishel等克隆了人的这一同源基因，等克隆了人的这一同源基因，Muts,Muts,并定位于并定位于2P2P，并迅速鉴定了另三个这样基，并迅速鉴定了另三个这样基因。因。36结肠癌的结肠癌的mutator genemutator geneE Ecoli coli 人人 染色体的位置染色体的位置 %HNPCC%HNPCCMutsMSH22P15-P2250-60%MutlMLH13P21.330-40%MutlPMS12p31-p335%MutlPMS27p225%与与TSGTSG一样，这类基因突变是隐性的，亦需一样，这类基因突变是隐性的，亦需要两次打击机制。
17、要两次打击机制。37错配修复基因错配修复基因mismatchrepairgene，MMRDNADNA错配修复系统错配修复系统MMRMMR首先是在原核生物中发现首先是在原核生物中发现) ) Mut S Mut SMMRMMR系统系统 Mut L Mut L 也称也称 Mut SLH Mut SLH 途径。途径。 Mut H Mut H该系统的修复机制主要依赖于该系统的修复机制主要依赖于Mut S Mut S 、MutLMutL、 MutH MutH，基因所编码的蛋白、酶分子来完成。，基因所编码的蛋白、酶分子来完成。MutSMutS其蛋白的作用是识别错配的碱基位点并与其蛋白的作用是识别错配的碱基位
18、点并与 之结合。之结合。而后而后MutL MutL 和和MutHMutH基因产物依次与基因产物依次与MutSMutS形成复合物形成复合物 进行协同作用。进行协同作用。38AGNATTCGTAMutSMutHAGNATTCGTAMutL3940另外，该系统还需要其它酶和因子参与另外，该系统还需要其它酶和因子参与 DNA DNA聚合酶聚合酶；如：如： DNA DNA连接酶；连接酶； 单链结合蛋白；单链结合蛋白； 外切酶等，从而共同完成修复反响。外切酶等，从而共同完成修复反响。 41人类人类MMR系统：系统：现已说明，人类现已说明，人类MMR基因编码的错配修复蛋白可相互作基因编码的错配修复蛋白可相互
19、作用，形成一种多聚复合物，参与细胞错配修复反响。用，形成一种多聚复合物，参与细胞错配修复反响。修复：修复修复：修复DNA复制过程中出现的碱复制过程中出现的碱作用作用基错配。基错配。消除：消除由于简单重复序列之间的消除：消除由于简单重复序列之间的遗传重组出现的不配对基碱序列。遗传重组出现的不配对基碱序列。42目的目的 从而有效地防止从而有效地防止DNADNA复制过失的产生。复制过失的产生。 人体细胞中人体细胞中DNA DNA 错配修复反响过程依错配修复反响过程依赖于几种人类赖于几种人类MMRMMR基因产物基因产物. . 因此，其中任何一种基因发生突变导因此，其中任何一种基因发生突变导致其产物的功
20、能丧失，将造成致其产物的功能丧失，将造成DNADNA错配，错配，修复功能的异常、缺陷、或丧失。修复功能的异常、缺陷、或丧失。43人类人类MMRMMR基因定位：基因定位：Gene location Exon ORF Gene location Exon ORF 产物产物HMSH22p16162802bp934aaHMLH13p21.3192268bp756aaHPMS12q31-q33?2795bp932aaHPMS22p22?2586bp862aa44人类人类MMRMMR系统与肿瘤系统与肿瘤DNA DNA 错配修复基因的完整性对确保错配修复基因的完整性对确保DNADNA复制的精确性极为复制的精
21、确性极为重要重要。DNA MMRDNA MMR系统系统 GeneGene突变突变MMRMMR系统缺陷系统缺陷修复功能下降修复功能下降MI肿瘤易感性增强肿瘤易感性增强45 微卫星不稳定微卫星不稳定MIMI Microsatellite DNA instability,MIMicrosatellite DNA instability,MI 是指是指T T组织和组织和N N组织相比，其组织相比，其DNADNA等位结构等位结构发生简单重复序列的改变，这种改变表现在肿瘤发生简单重复序列的改变，这种改变表现在肿瘤组织与其对应的正常组织组织与其对应的正常组织PCRPCR产物经电泳后，电产物经电泳后，电泳带出
22、现增加或减少、位置及带的密度变化。泳带出现增加或减少、位置及带的密度变化。 N TN T LOHLOH MI MI 46MMR基因的作用方式类似于肿瘤抑制基因基因的作用方式类似于肿瘤抑制基因.MMR基因功能丧失需要两次突变事件。例如：基因功能丧失需要两次突变事件。例如：在家族性遗传性非息肉型结肠癌在家族性遗传性非息肉型结肠癌HNPCC形成形成过程过程第一次突变生殖第一次突变生殖CMMRGene突变突变，个体对，个体对结肠癌易结肠癌易患患倾向倾向第二次突变体第二次突变体C另一等位基因突变另一等位基因突变纯合子纯合子-功能丧失功能丧失原癌基因、抑癌基因突变快速积累原癌基因、抑癌基因突变快速积累细胞
23、增殖失调细胞增殖失调74例例HNPCC家系中研究说明，复制差家系中研究说明，复制差RER阳阳性率高达性率高达92%,说明说明MMRGene发生突变。发生突变。474 .4 .肿瘤转移基因和转移抑制基因肿瘤转移基因和转移抑制基因某些肿瘤开展到一定阶段可发生转移，恶某些肿瘤开展到一定阶段可发生转移，恶性肿瘤的转移是一个复杂的过程，包括癌细性肿瘤的转移是一个复杂的过程，包括癌细胞由原发性脱落，进入细胞外基质和血管或胞由原发性脱落，进入细胞外基质和血管或淋巴管，并在远处适宜的组织中生长。近年淋巴管，并在远处适宜的组织中生长。近年来研究发现，存在着促进转移的肿瘤转移基来研究发现，存在着促进转移的肿瘤转移
24、基因因Tumormetastasisgene和抑制肿瘤和抑制肿瘤转移的肿瘤转移抑制基因转移的肿瘤转移抑制基因Tumormetastasissuppressorgene.48从分子水平看，转移分为三步：从分子水平看，转移分为三步：1)黏附，肿瘤细胞与胞外基质中的层粘连蛋白和纤维连接蛋黏附，肿瘤细胞与胞外基质中的层粘连蛋白和纤维连接蛋白相黏附；白相黏附；2降解，肿瘤细胞释放各种水解酶破坏黏附组降解，肿瘤细胞释放各种水解酶破坏黏附组织；织；3移动，肿瘤细胞向纵深移动播散。移动，肿瘤细胞向纵深移动播散。491 1肿瘤转移基因肿瘤转移基因肿瘤转移的遗传根底：肿瘤转移的遗传根底：转移相关的染色体：转移相关
25、的染色体：10q杂合性丧失杂合性丧失-浸润性膀胱浸润性膀胱癌癌两种两种TSG定位定位10q24.1q24.3和和10q26.1q26.2缺失缺失对肿瘤进展有促进作用。对肿瘤进展有促进作用。转移促进基因：基因表达促进肿瘤转移。转移促进基因：基因表达促进肿瘤转移。1989年从转移性小鼠乳腺癌细胞中别离出一种与转移相年从转移性小鼠乳腺癌细胞中别离出一种与转移相关的基因关的基因S100A4(又称为又称为CAL、p9ka、mtsI)。编码编码Ca2+结合蛋白结合蛋白,促进促进C运动，影响细胞与细胞外基运动，影响细胞与细胞外基质粘附，改变蛋白水解活性促进转移。质粘附，改变蛋白水解活性促进转移。S100A4
26、表达与人乳腺癌、结肠直肠癌的侵袭转移能力表达与人乳腺癌、结肠直肠癌的侵袭转移能力呈正相关。呈正相关。MTA-1基因与乳腺癌、胃癌、结肠癌的转移有关。基因与乳腺癌、胃癌、结肠癌的转移有关。502 2肿瘤转移抑制基因肿瘤转移抑制基因 又在人和小鼠中发现，又在人和小鼠中发现，nm23nm23基因的表达与乳基因的表达与乳腺癌等肿瘤的转移密切相关。表达降低与人类腺癌等肿瘤的转移密切相关。表达降低与人类的某些肿瘤转移力增强有关。的某些肿瘤转移力增强有关。 nm23 Gene17q21 nm23 Gene17q21，编码，编码17kd17kd蛋白。蛋白。 KISS KISS基因，基因，19771977年，年
27、，Lee,Lee,在黑色素瘤中发现。在黑色素瘤中发现。定位于定位于1q321q32，4 4个个exon,exon,编码编码164164个氨基酸。个氨基酸。 KAI KAI基因基因cd82cd82，在前列腺癌中发现，定，在前列腺癌中发现，定位于位于11p11.2,11p11.2,编码编码267267个氨基酸。个氨基酸。51五、癌的多阶段演化五、癌的多阶段演化multistep evolutionmultistep evolution肿瘤的发生肿瘤的发生涉及多阶涉及多阶段、多基因段、多基因参与的复杂参与的复杂过程，以结过程，以结肠直肠癌为肠直肠癌为例说明其过例说明其过程：程：52癌的多阶段演化癌的
28、多阶段演化53癌的多阶段演化癌的多阶段演化5chrLOHDNA低甲基化低甲基化正常结肠细胞正常结肠细胞 C C生长增强生长增强 早期腺瘤早期腺瘤APCk-ras基因激活基因激活18chrLOHLOHLOH中期腺瘤中期腺瘤 晚期腺瘤晚期腺瘤 癌癌 转移转移DCC17chr其它其它chr54上述过程说明，正常细胞经过屡上述过程说明，正常细胞经过屡次遗传损伤事件，涉及癌基因激活、次遗传损伤事件，涉及癌基因激活、抑癌基因失活多个抑癌基因失活多个Gene的变化，经的变化，经过相应的多阶段演化过相应的多阶段演化而形成恶性表而形成恶性表型的过程型的过程55在癌的演化中，不存在一个不变的突变序列，而可在癌的演
29、化中，不存在一个不变的突变序列，而可能是每个连续的阶段都有一生长优势上的序列。能是每个连续的阶段都有一生长优势上的序列。1 1、5q21APC 5q21APC 一个拷贝丧失一个拷贝丧失产生腺瘤样息肉，产生腺瘤样息肉，APCAPC的丧失或突变其早期事件。的丧失或突变其早期事件。2 2、约、约50%50%的中、晚期腺瘤，的中、晚期腺瘤，10%10%早期腺瘤有早期腺瘤有K-rasK-ras的的突变突变与早、中期腺瘤演进有关。与早、中期腺瘤演进有关。3 3、约、约50%50%晚期腺瘤与癌有晚期腺瘤与癌有18q18q杂合丧失这在早期、杂合丧失这在早期、中期腺瘤是不常见的。即中期腺瘤是不常见的。即DCCD
30、CCDeleted in Deleted in colon cancercolon cancer的丧失突变有关。的丧失突变有关。4 4、直肠癌有高频率的、直肠癌有高频率的p53p53的突变。同时由于的突变。同时由于“增变增变基因的作用基因的作用, ,通过其一般突变率使其每一转化成通过其一般突变率使其每一转化成为可能。为可能。56六、研究热点六、研究热点端粒和端粒酶端粒和端粒酶端粒端粒telomeretelomere：是真核细胞染色体末端的一种特殊结构，：是真核细胞染色体末端的一种特殊结构，由端粒由端粒DNADNA和蛋白质组成。其端粒和蛋白质组成。其端粒DNADNA是富含是富含G G的高度的高度
31、 保守的保守的重复核苷酸序列。对染色体具有保护作用。重复核苷酸序列。对染色体具有保护作用。57 发现端粒和端粒酶是如何保护染色体的。他们的研究成果揭 示端粒变短，细胞就老化 。 美国3名科学家获诺贝尔生理学或医学奖，2021。 伊丽莎白-布莱克本 卡萝尔-格雷德 杰克-绍斯塔克 58 不同物种的端粒不同物种的端粒DNA DNA 序列并不一致，人和序列并不一致，人和其它哺乳动物的端粒其它哺乳动物的端粒DNADNA序列由序列由5353方方向的向的TTAGGGTTAGGGn n反复串联组成。在人类大约反复串联组成。在人类大约有有121215Kb15Kb，是非结构基因，不编码蛋白质。，是非结构基因，不
32、编码蛋白质。 端粒端粒DNADNA的的33末端较末端较55末端伸出末端伸出121216bp 16bp 的一段弯曲呈帽状结构，保护染色体，防止的一段弯曲呈帽状结构，保护染色体，防止断裂、重组或降解，促进染色体与核膜粘着，断裂、重组或降解，促进染色体与核膜粘着，以及减数分裂时同源染色体配对。以及减数分裂时同源染色体配对。 每条染色体的末端含有一段被称作端粒的特殊每条染色体的末端含有一段被称作端粒的特殊DNADNA序列，它的长度受到端粒酶的调节。端粒的序列，它的长度受到端粒酶的调节。端粒的序列长度代表着一个细胞的寿命。随着细胞分裂序列长度代表着一个细胞的寿命。随着细胞分裂的不断进行，端粒逐渐缩短。当
33、其长度减小到一的不断进行，端粒逐渐缩短。当其长度减小到一定临界值时，细胞趋向衰老、死亡。定临界值时，细胞趋向衰老、死亡。端粒被认为是细胞有丝分裂的端粒被认为是细胞有丝分裂的“生物钟。生物钟。 60端粒端粒DNA DNA 逐渐变短的主要原因：逐渐变短的主要原因：1 1、细胞分裂过程中线形染色体的末端端粒、细胞分裂过程中线形染色体的末端端粒DNADNA不能完全被不能完全被DNADNA指导指导DNADNA多聚酶所复制；多聚酶所复制；2 2、末端的特异性和非特异性降解；、末端的特异性和非特异性降解；3 3、细胞异源端粒之间的不均匀重组。、细胞异源端粒之间的不均匀重组。61影响端粒长度的因素很多，其中主
34、要有：影响端粒长度的因素很多，其中主要有： 端粒结合蛋白端粒结合蛋白 端粒帽蛋白端粒帽蛋白 DNA DNA复制酶复制酶 端粒酶等端粒酶等其中端粒酶是最主要因素。其中端粒酶是最主要因素。端粒酶端粒酶telomerasetelomerase： 是一种逆转录酶，能延长端粒末端，由蛋白质和是一种逆转录酶，能延长端粒末端，由蛋白质和RNA RNA 组成，可以其组成，可以其RNARNA为模板指导为模板指导DNADNA合成，向端粒末合成，向端粒末端添加端添加TTAGGGTTAGGGn n序列，使端粒延长，延长细胞的寿序列，使端粒延长，延长细胞的寿命甚至使其永生化。命甚至使其永生化。62端粒合成机制端粒合成机
35、制63G1/S期期，端粒酶活性逐渐增高端粒酶活性逐渐增高S期期活性最高。活性最高。在在G2期期/M期期端粒酶活性逐渐消失。端粒酶活性逐渐消失。64 利用利用TRAPTRAPTelemeric Repeat Telemeric Repeat Amplification ProtocolAmplification Protocol技术检测正常技术检测正常动物、植物细胞时发现，除个别增生活泼动物、植物细胞时发现，除个别增生活泼的组织有微弱的端粒酶活性外，其他组织的组织有微弱的端粒酶活性外，其他组织都没有端粒酶活性。但在肿瘤细胞、永生都没有端粒酶活性。但在肿瘤细胞、永生型细胞及干细胞如造血干细胞中，端
36、型细胞及干细胞如造血干细胞中，端粒酶可被激活，活性增强。粒酶可被激活，活性增强。 细胞永生化细胞永生化(cellular immortality)(cellular immortality)导致导致癌症形成，而且重新具备在胚胎发育中的细胞癌症形成，而且重新具备在胚胎发育中的细胞才有的一种关键功能：才有的一种关键功能：端粒端粒长度不缩短长度不缩短。 细胞永生化是癌症的共同特征。正常情况下，细胞永生化是癌症的共同特征。正常情况下，一旦胚胎发育阶段结束，除了一旦胚胎发育阶段结束，除了成体干细胞成体干细胞之外，之外，体内的细胞就停止产生端粒酶。但是，细胞偶体内的细胞就停止产生端粒酶。但是，细胞偶尔发生
37、突变而重新尔发生突变而重新激活端粒酶激活端粒酶，这样当细胞分，这样当细胞分裂时端粒就变长而不是缩短。这就是癌细胞永裂时端粒就变长而不是缩短。这就是癌细胞永生化的形成机制。生化的形成机制。 端粒酶与肿瘤端粒酶与肿瘤 这种突变本身并缺乏以导致癌症产生。这种突变本身并缺乏以导致癌症产生。但是细胞永生化在但是细胞永生化在90%90%的癌症中是肿瘤形成的癌症中是肿瘤形成的一个关键因素。的一个关键因素。 令人感兴趣的是，即便在癌细胞中，端令人感兴趣的是，即便在癌细胞中，端粒也不会无限制地变长。在每次细胞分裂粒也不会无限制地变长。在每次细胞分裂时，癌细胞与大多数细胞一样丧失大约时，癌细胞与大多数细胞一样丧失
38、大约6060个核苷酸，但是活化的端粒酶给它补回一个核苷酸，但是活化的端粒酶给它补回一样多的核苷酸，然后内部时钟被重置为零，样多的核苷酸，然后内部时钟被重置为零，它就永生化。它就永生化。 但是这里就存在一个问题：是什么阻止端粒无限制变长？ 瑞士Joachim Lingner教授给出这个问题的答案：他们鉴定出三个蛋白连接在一起而形成一种蛋白复合物，然后附着到端粒上。这种蛋白复合物有点类似于盖子，阻止端粒酶在端粒上发挥作用。但是在癌细胞中，它们的作用时间不对，即它们参与的时间太晚了。 Ligner解释，“如果我们能够让这些蛋白在更早的时间发挥作用，或者我们能够重新构建一种类似的机制，癌细胞就不再永生
39、化。这样，癌细胞就能够像正常细胞那样死亡。 在恶性肿瘤中，端粒酶活性明显增高，以延长端粒，弥补因细胞分裂而造成的端粒缩短，从而使细胞无限增殖恶化，甚至使癌细胞永生化。 Ueda报道1997，Cancer Res.，在恶性肿瘤中91%端粒酶活性增强。 Zheng，报道，妇科肿瘤中端粒酶活性增强的占95%。69 上述情况说明，绝大多数肿瘤细胞中都上述情况说明，绝大多数肿瘤细胞中都呈端粒酶阳性，而在正常组织中却无表达。呈端粒酶阳性，而在正常组织中却无表达。揭示，端粒酶可能是一个广泛的肿瘤标致，揭示，端粒酶可能是一个广泛的肿瘤标致，可用于肿瘤的诊断。可用于肿瘤的诊断。 Hiyama E Hiyama
40、E 19971997，CancerResCancerRes，通过检，通过检测胰腺肿瘤得出：测胰腺肿瘤得出：95%95%胰腺癌中端粒酶活性胰腺癌中端粒酶活性增强，而在良性胰腺瘤中为增强，而在良性胰腺瘤中为0%0%。 哪么能否应用抑制端粒酶的手段来治疗肿哪么能否应用抑制端粒酶的手段来治疗肿瘤呢？瘤呢？ 这个问题正是目前人们关注的问题，这个问题正是目前人们关注的问题，也是研究的热点。也是研究的热点。70 研究者们建议利用端粒酶抑制剂进行肿瘤治疗。研究者们建议利用端粒酶抑制剂进行肿瘤治疗。 7- 7-脱氮脱氮-2-2脱氧腺脱氧腺/ /鸟苷酸鸟苷酸 7-deaza-d A/GTP 7-deaza-d A
41、/GTP 是潜在的是潜在的端粒酶抑制剂，二者都可通过端粒酶的催化作用惨入到端粒酶抑制剂，二者都可通过端粒酶的催化作用惨入到端粒端粒DNADNA中，由于它们的掺入使端粒过早地缩短，开僻了中，由于它们的掺入使端粒过早地缩短，开僻了肿瘤治疗的新途径。肿瘤治疗的新途径。 Kanazawa Kanazawa 制备一种锤头核酸酶制备一种锤头核酸酶telorztelorz，作用于人类端，作用于人类端粒酶的粒酶的RNARNA成分，对已合成的端粒酶成分，对已合成的端粒酶RNARNA成分具有特异分成分具有特异分解作用，对端粒酶有明显的抑制作用。解作用，对端粒酶有明显的抑制作用。 应用反义核酸治疗方法，人工合成反义
42、应用反义核酸治疗方法，人工合成反义DNA/RNA DNA/RNA 抑制端抑制端粒酶的作用粒酶的作用 。71核酶核酶Ribozyme72核酶核酶73RNARNA干扰干扰近年来的研究说明近年来的研究说明将与将与mRNA对应的正义对应的正义RNA和反义和反义RNA组组成的双链成的双链RNA(dsRNA)导入细胞，可以使导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。因沉默。这种转录后基因沉默机制这种转录后基因沉默机制(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)被被称为称为RNA干扰干扰RNAi。7475GFP报告基因
43、报告基因-RNAi76RNAi机制机制777879RNA干扰干扰05/11/18cellwangxiaodong80RNAi的分子机制的分子机制RNA干扰包括起始阶段和效应阶段干扰包括起始阶段和效应阶段(inititationandeffectorsteps)。在起始阶段在起始阶段参加的小分子参加的小分子RNA被切割为被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰核苷酸长的小分子干扰RNA片段片段(smallinterferingRNAs,siRNAs)。证据说明；一个称为证据说明；一个称为Dicer的酶，是的酶，是RNaseIII家家族中特异识别双链族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种的一员，它
44、能以一种ATP依依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链感染等各种方式引入的双链RNA，将，将RNA降解为降解为21-23bp的双链的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的，每个片段的3端端都有都有2个碱基突出。个碱基突出。8182在在RNAi效应阶段效应阶段siRNA双链结合一个核酶双链结合一个核酶复合物从而形成所谓复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物诱导沉默复合物RNA-inducedsilencingcomplex,RISC。激活激活RISC需要一个需要一个ATP依赖的将小分子依赖的将小分子RNA解双链的过程。
45、激活的解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定通过碱基配对定位到同源位到同源mRNA转录本上，并在距离转录本上，并在距离siRNA3端端12个碱基的位置切割个碱基的位置切割mRNA。尽管切割确实切机制尚不明了，但每个尽管切割确实切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个都包含一个siRNA和一个不同于和一个不同于Dicer的的RNA酶酶(Ago2)83如何进行如何进行RNAi试验试验(一一)siRNA的设计的设计在设计在设计RNAi实验时，可以先在以下网站进实验时，可以先在以下网站进行目标序列的筛选：行目标序列的筛选：:/genesil/business/products/order2.htm
46、:/:/:/=4535871084( (二二)siRNA)siRNA的制备的制备 1.1.化学合成化学合成 公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNAsiRNA。 2.2.体外转录体外转录 以以DNA OligoDNA Oligo为模版，通过体外转录合成为模版，通过体外转录合成siRNAssiRNAs。 3.3.用用RNase III RNase III 消化长片断双链消化长片断双链RNARNA制备制备siRNAsiRNA dsRNA dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNAsi
47、RNA序列的。序列的。 4. siRNA4. siRNA表达载体表达载体 siRNAsiRNA表达载体的优点在于可以进行较长期研究表达载体的优点在于可以进行较长期研究带有带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。续数星期甚至更久。 5. siRNA5. siRNA表达框架表达框架 siRNAsiRNA表达框架表达框架(siRNA expression cassettes(siRNA expression cassettes，SECs)SECs)是是一种由一种由PCRPCR得到的得到的siRNAsiRNA表达模版
48、，包括一个表达模版，包括一个RNA pol IIIRNA pol III启启动子，一段发夹结构动子，一段发夹结构siRNAsiRNA，一个，一个RNA pol IIIRNA pol III终止位点，能终止位点，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。858687( (三三)siRNA)siRNA的转染的转染1.1.磷酸钙共沉淀磷酸钙共沉淀 将氯化钙，将氯化钙，RNA(RNA(或或DNA)DNA)和磷酸缓冲液混合，沉和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含淀形成包含DNADNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷酸钙酸钙-DNA-D
49、NA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。的细胞的细胞质。2.2.电穿孔法电穿孔法 电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿中转导分子。将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。细胞膜暂时穿孔。883.DEAE-葡聚糖和葡聚糖和polybrene带正电的带正电的DEAE-葡聚糖或葡聚糖或polybrene多聚体复合多聚体复合物和带负电的物和带负电的DNA分子使得分子使得DNA可以结
50、合在细胞可以结合在细胞外表。通过使用外表。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。复合体导入。4.机械法机械法转染技术也包括使用机械的方法，比方显微注射转染技术也包括使用机械的方法，比方显微注射和基因枪和基因枪biolisticparticle将将DNA，RNA或或蛋白直接转入细胞质或细胞核。蛋白直接转入细胞质或细胞核。5.阳离子脂质体试剂阳离子脂质体试剂形成形成DNA-阳离子脂质体复合物。被俘获的阳离子脂质体复合物。被俘获的DNA就就会被导入培养的细胞。会被导入培养的细胞。891. 1. 研究基因功能的新工具研究基因功能的新工具 已有研究说明已有研究说明
51、RNAiRNAi能够在哺乳动物中灭活或降低能够在哺乳动物中灭活或降低特异性基因的表达，制作多种表型，而且抑制基特异性基因的表达，制作多种表型，而且抑制基因表达的时间可以随意控制在发育的任何阶段，因表达的时间可以随意控制在发育的任何阶段，产生类似基因敲除的效应。产生类似基因敲除的效应。 RNAi RNAi将大大促进对这些新基因功能的研究。与将大大促进对这些新基因功能的研究。与传统的基因敲除技术相比，这一技术具有投入少，传统的基因敲除技术相比，这一技术具有投入少，周期短，操作简单等优势，近来周期短，操作简单等优势，近来RNAiRNAi成功用于构成功用于构建转基因动物模型的报道日益增多，标志着建转基
52、因动物模型的报道日益增多，标志着RNAiRNAi将成为研究基因功能不可或缺的工具。将成为研究基因功能不可或缺的工具。 RNAiRNAi的应用前景的应用前景902. 2. 研究信号转导通路的新途径研究信号转导通路的新途径联合利用传统的缺失突变技术和联合利用传统的缺失突变技术和RNAi技术技术,可以可以很容易地确定复杂的信号转导途径中不同基因的很容易地确定复杂的信号转导途径中不同基因的上下游关系。上下游关系。Clemensy等，应用等，应用RNAi研究了果蝇细胞系中研究了果蝇细胞系中胰岛素信息转导途径胰岛素信息转导途径,取得了与胰岛素信息转导通取得了与胰岛素信息转导通路完全一致的结果路完全一致的结
53、果.在此根底上分析了在此根底上分析了DSH3PX1与与DACK之间的关之间的关系系,证实了证实了DACK是位于是位于DSH3PX1磷酸化的上游磷酸化的上游激酶激酶.RNAi技术较传统的转染实验简单、快速、重复技术较传统的转染实验简单、快速、重复性好，克服了转染实验中重组蛋白特异性聚集和性好，克服了转染实验中重组蛋白特异性聚集和转染效率不高的缺点。因此，认为转染效率不高的缺点。因此，认为RNAi技术将可技术将可能成为研究细胞信号转导通路的新途径。能成为研究细胞信号转导通路的新途径。913.开展基因治疗的新策略开展基因治疗的新策略RNAi具有抵抗病毒入侵，抑制转座子活动，防止自私具有抵抗病毒入侵，
54、抑制转座子活动，防止自私基因序列过量增殖等作用。因此，可以利用基因序列过量增殖等作用。因此，可以利用RNAi现象产生现象产生抗病毒的植物和动物，并可利用不同病毒转录序列中高度同抗病毒的植物和动物，并可利用不同病毒转录序列中高度同源区段相应的源区段相应的dsRNA抵抗多种病毒。抵抗多种病毒。肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的结果，传统肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的结果，传统技术诱发的单一癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的技术诱发的单一癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长生长,而而RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高
55、的保守序列这一特性源性很高的保守序列这一特性,设计针对这一区段序列的设计针对这一区段序列的dsRNA分子，只注射一种分子，只注射一种dsRNA即可以产生多个基因同时即可以产生多个基因同时剔除的表现，也可以同时注射多种剔除的表现，也可以同时注射多种dsRNA而将多个序列不而将多个序列不相关的基因同时剔除。相关的基因同时剔除。92microRNA简介简介 近年来，人类发现了许多不同种类的近年来，人类发现了许多不同种类的microRNA分子，其中最为重要的是小分子，其中最为重要的是小RNARNA分子的发现。分子的发现。 有些小有些小RNARNA分子分子 能直接调控某些基因的能直接调控某些基因的开关，
56、从而控制细胞的生长发育并决定细开关，从而控制细胞的生长发育并决定细胞分化的组织类型。胞分化的组织类型。93 RNARNA的分类的分类 细胞核和胞液细胞核和胞液线粒体线粒体功能功能核蛋白体核蛋白体RNArRNAmtrRNA核蛋白体组成成分核蛋白体组成成分信使信使RNAmRNAmtmRNA蛋白质合成模板蛋白质合成模板转运转运RNAtRNAmttRNA转运氨基酸转运氨基酸不均一核不均一核RNAhnRNA成熟成熟mRNA的前体的前体小核小核RNAsnRNA参与参与hnRNA的剪接、转运的剪接、转运小胞浆小胞浆RNAscRNA/7SL-RNA蛋白质内质网定位合成的蛋白质内质网定位合成的信号识别体的组成成
57、分信号识别体的组成成分94小小RNA分子本身又包含了假设干类分子本身又包含了假设干类RNA，根据小，根据小RNA的生成、结构和功能大约可分为以的生成、结构和功能大约可分为以下三类：下三类：amiRNAmicroRNA)bsiRNA(shortinterferingRNA)c其他小其他小RNAmiRNAmiRNA制定了如下的命名规那么：制定了如下的命名规那么： (1) miRNA 简写成miR，再根据其被克隆的先后顺序加上阿拉伯数字，如miR-21；(2)高度同源的miRNA 在数字后加上英文小写字母(a、b 、c)，如miR-199a 和miR-199b；(3)由不同染色体上的DNA序列转录加
58、工而成的具有相同成熟体序列的miRNA，那么在后面加上阿拉伯数字以区分, 如miR-199a-1 和miR-199a-2；miRNAmiRNA制定了如下的命名规那么制定了如下的命名规那么(4)(4)如果一个前体的如果一个前体的2 2 个臂分别加工产生个臂分别加工产生miRNAmiRNA，那，那么根据克隆实验，在表达水平较低的么根据克隆实验，在表达水平较低的miRNA miRNA 后面加后面加“*“*，如，如miR-199amiR-199a和和miR-199a*miR-199a*，或进行如下命名，或进行如下命名，miR-142-5p(miR-142-5p(也可命名为也可命名为miR-142-sm
59、iR-142-s，表示从，表示从5 5 端端的臂加工而来的臂加工而来) )和和miR-142-3p(miR-142-3p(也可命名为也可命名为miR-142-miR-142-asas，表示从，表示从33端的臂加工而来端的臂加工而来) )；(5)(5)将物种缩写置于将物种缩写置于miRNA miRNA 之前，如之前，如hsa-miR-195 hsa-miR-195 ；( 6 ) ( 6 ) 确定命名规那么之前发现的确定命名规那么之前发现的miRNAmiRNA，如，如let-7let-7，那么保存原来名字。，那么保存原来名字。97WhataremicroRNAs？1microRNAmiRNA,微微
60、RNA即为长度为即为长度为22nt左左右的右的5端带磷酸基团、端带磷酸基团、3端带羟基的非编码蛋白的端带羟基的非编码蛋白的调控小调控小RNA家族。广泛存在于真核生物中。家族。广泛存在于真核生物中。miRNA的表达具有组织特异性和阶段特异性，的表达具有组织特异性和阶段特异性，即：在不同组织中表达有不同类型的即：在不同组织中表达有不同类型的miRNA,在生物在生物发育的不同阶段有不同的发育的不同阶段有不同的miRNA表达。表达。miRNA对生长发育进行更为重要的调控作用。对生长发育进行更为重要的调控作用。98WhataremicroRNAs？2miRNA具有高度保守性，即各种具有高度保守性，即各种
61、miRNA都能在其他种系中找到同源体；都能在其他种系中找到同源体；miRNA独有的特征：其独有的特征：其5端第一个端第一个碱基对碱基对U有强烈的倾向性，而对有强烈的倾向性，而对G却有抗却有抗性，但第二到第四个碱基缺乏性，但第二到第四个碱基缺乏U，一般，一般来讲，除第四个碱基外，其他位置碱基来讲，除第四个碱基外，其他位置碱基通常都缺乏通常都缺乏C.miRNA执行一定的生物学功能：执行一定的生物学功能：对与其互补的对与其互补的mRNA表达水平具有表达水平具有调节作用；调节作用；一些偏大的一些偏大的miRNA可能参与了基因组可能参与了基因组的重组装的重组装27nt。99100101 microRNA
62、 (miRNA) microRNA (miRNA)基因通常是由基因通常是由RNARNA聚合酶聚合酶II(Pol II)II(Pol II)转录转录的，一般最初产物为大的具有帽子结构的，一般最初产物为大的具有帽子结构(7MGpppG)(7MGpppG)和多聚腺苷和多聚腺苷酸尾巴酸尾巴(AAAAA)(AAAAA)的的pri-miRNApri-miRNA。 这些这些pri-miRNApri-miRNA在在RNase III DroshaRNase III Drosha和其辅助因子和其辅助因子PashaPasha的的作用下被处理成作用下被处理成70 70 个核苷酸组成的个核苷酸组成的pre-miRNA
63、pre-miRNA前体产物。前体产物。RANGTPRANGTP和和exportin 5 exportin 5 将这种前体分子输送到细胞质中。随将这种前体分子输送到细胞质中。随后，另一个后，另一个RNase III Dicer RNase III Dicer 将其剪切产生约为将其剪切产生约为22 22 个核苷酸个核苷酸长度的长度的miRNA:miRNA*miRNA:miRNA*双链。双链。 这种双链很快被引导进入这种双链很快被引导进入(miRISC)(miRISC)复合体中，其中含有复合体中，其中含有ArgonauteArgonaute蛋白，并且成熟的单链蛋白，并且成熟的单链miRNAmiRNA
64、保存在这一复合物中。保存在这一复合物中。102 成熟的成熟的miRNAmiRNA结合到与其互补的结合到与其互补的mRNAmRNA的位点通的位点通过两种依赖于序列互补性的机制负调控基因表达。过两种依赖于序列互补性的机制负调控基因表达。 与靶与靶mRNAmRNA不完全互补的不完全互补的miRNAmiRNA在蛋白质翻译水在蛋白质翻译水平上抑制其表达。平上抑制其表达。 然而，最近也有证据说明，这些然而，最近也有证据说明，这些miRNAmiRNA也有可也有可能影响能影响mRNAmRNA的稳定性。使用这种机制的的稳定性。使用这种机制的miRNAmiRNA结合结合位点通常在位点通常在mRNAmRNA的的33
65、端非翻译区。如果端非翻译区。如果miRNAmiRNA与与靶位点完全互补或者几乎完全互补，那么这靶位点完全互补或者几乎完全互补，那么这些些miRNAmiRNA的结合往往引起靶的结合往往引起靶mRNAmRNA的降解。的降解。103miRNA的成熟的成熟据体内外实验研究说明据体内外实验研究说明miRNA的生成至少的生成至少需要两个步骤：需要两个步骤：1由长的内源性转录本由长的内源性转录本pri-miRNA)生成生成70nt左右的左右的miRNA前体前体pre-miRNA)，该过程发生在细胞核，该过程发生在细胞核;2)将将pre-miRNA加工为成熟加工为成熟miRNA，22个核苷酸，该过程发生在细胞
66、质中。个核苷酸，该过程发生在细胞质中。104Pre-miRNAPre-miRNA Pre-miRNA 是由内源是由内源性基因或内含子的性基因或内含子的DNADNA反向重复序列转反向重复序列转录而来录而来, ,它是一种长它是一种长约约70nt70nt的非编码的非编码RNA,RNA,具有茎具有茎- -环结构也即环结构也即发夹状结构。发夹状结构。Pre-miRNAPre-miRNA在在DicerDicer的的作用下可被剪切成作用下可被剪切成miRNA.miRNA.只是只是pre-pre-miRNA miRNA 茎中的一个臂茎中的一个臂. .105microRNAmicroRNA的成熟过程分为几个阶段
67、的成熟过程分为几个阶段: :1.1.初级初级miRNA(primary microRNA)miRNA(primary microRNA)转录自转录自DNADNA，并折叠，并折叠为一个为一个stem-loopstem-loop。2.2.酶酶DroshaDrosha将将stem-loopstem-loop与转录本与转录本(transcript)(transcript)其它其它部份分开。部份分开。3.3.接着酶接着酶DicerDicer将将looploop与与stemstem分开。分开。4.4.双链双链stemstem与蛋白与蛋白ArgonauteArgonaute相互作用，相互作用，Argonau
68、teArgonaute将将双链劈开，释放其中的一条链，与剩下的一条链双链劈开，释放其中的一条链，与剩下的一条链guide strandguide strand，引导链形成，引导链形成miRISCmiRISC复合体。复合体。5.miRISC5.miRISC复合体与复合体与mRNAmRNA相互作用，改变相互作用，改变mRNAmRNA的表达。的表达。106miRNA与靶与靶mRNA的作用模式：的作用模式：1二者不完全互补，即二者不完全时配对结合时，二者不完全互补，即二者不完全时配对结合时，主要影响翻译过程而对主要影响翻译过程而对mRNA的稳定性无任何影的稳定性无任何影响。如线虫的响。如线虫的lin-
69、42二者完全互补，即二者完全配对结合后，类似二者完全互补，即二者完全配对结合后，类似siRNA与靶与靶mRNA的结合，特异性的切割的结合，特异性的切割mRNA。如如miR39/miR1713上述两种模式均具备。当其与靶上述两种模式均具备。当其与靶mRNA完全互完全互补配对时，直接靶向切割补配对时，直接靶向切割mRNA，而不完全互补，而不完全互补配对时起调节基因翻译的作用。如配对时起调节基因翻译的作用。如let-7果蝇果蝇/线虫。线虫。107mmi iR RN NA A与与s si iR RN NA A的的作作用用机机制制：108miRNAmiRNA与与siRNAsiRNA之间有许多相同之处：之
70、间有许多相同之处：1.1.二者的长度都约在二者的长度都约在22nt22nt左右。左右。2.2.二者都依赖二者都依赖DicerDicer酶的加工，是酶的加工，是DicerDicer的产物，所的产物，所以具有以具有DicerDicer产物的特点。产物的特点。3.3.二者生成都需要二者生成都需要ArgonauteArgonaute家族蛋白存在。家族蛋白存在。4.4.二者都是二者都是RISCRISC组分，所以其功能界限变得不清晰，组分，所以其功能界限变得不清晰，如二者在介导沉默机制上有重叠。如二者在介导沉默机制上有重叠。 5.miRNA5.miRNA和和siRNAsiRNA合成都是由双链的合成都是由双
71、链的RNARNA或或RNARNA前体形前体形成的。成的。109miRNA与siRNA的不同点：1.区别是miRNA是内源的，是生物体的固有因素；而siRNA是人工体外合成的，通过转染进入人体内，是RNA干预的中间产物。2.结构上，miRNA是单链RNA，而siRNA是双链RNA。3.Dicer酶对二者的加工过程不同，miRNA是不对称加工，miRNA仅是剪切pre-miRNA的一个侧臂，其他局部降解；而siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂。1104.4.在作用位置上，在作用位置上，miRNAmiRNA主要作用于靶标基因主要作用于靶标基因3-3-UTRUTR区，而区，而siRNAsiR
72、NA可作用于可作用于mRNAmRNA的任何部位。的任何部位。5.5.在作用方式上，在作用方式上，miRNAmiRNA可抑制靶标基因的翻译，可抑制靶标基因的翻译，也可以导致靶标基因降解，也可以导致靶标基因降解，即在转录水平后和翻即在转录水平后和翻译水平起作用译水平起作用，而，而siRNAsiRNA只能导致靶标基因的降解，只能导致靶标基因的降解，即为转录水平后调控。即为转录水平后调控。6.miRNA6.miRNA主要在发育过程中起作用，主要在发育过程中起作用，调节内源基因调节内源基因表达，而表达，而siRNAsiRNA不参与生物生长，是不参与生物生长，是RNAiRNAi的产物，的产物，原始作用是抑
73、制转座子活性和病毒感染。原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。111miRNAmiRNA与与siRNAsiRNA的联系：的联系：长度均为长度均为22nt左右左右均为均为Dicer的产物：的产物：5端是磷酸基端是磷酸基3端是羟基端是羟基均需均需Argonaute家族蛋白的家族蛋白的存在同为存在同为RISC的组分的组分二者进化关系上可能的两种推论：二者进化关系上可能的两种推论：siRNAsiRNA是是miRNAmiRNA的补充的补充. . miRNA miRNA在进化过程中替代了在进化过程中替代了siRNA.siRNA.沉默机制有重叠沉默机制有重叠 112展望：展望：如果如果miRNAmiRNA基因
74、基因正如所发现的正如所发现的miRNAmiRNA一样多，那一样多，那么它很可能在生命活动中具有十分广泛的调节功能，么它很可能在生命活动中具有十分广泛的调节功能，对基因表达、生长发育和行为等都具有十分深远和对基因表达、生长发育和行为等都具有十分深远和复杂的效应。复杂的效应。 当前我们所面临的挑战是：当前我们所面临的挑战是： 这些这些miRNAmiRNA到底具有何种功能？到底具有何种功能？ 它们是如何识别潜在的靶它们是如何识别潜在的靶mRNAmRNA的？的？ 这些这些miRNAmiRNA间相互调节作用的结果是什么？间相互调节作用的结果是什么？ 与肿瘤发生及治疗中作用？与肿瘤发生及治疗中作用？113
75、A.在正常组织中，在正常组织中，miRNA正常转录，正常转录，加工加工，结合到靶，结合到靶mRNA的互补位的互补位点，通过抑制蛋点，通过抑制蛋白翻译或是改变白翻译或是改变mRNA的稳定性的稳定性来抑制基因表达。来抑制基因表达。最终的结果是，最终的结果是，细胞生长、增殖、细胞生长、增殖、分化和死亡保持分化和死亡保持在一个正常的水在一个正常的水平。平。114B.一个起肿瘤抑制基因一个起肿瘤抑制基因作用的作用的miRNA表达下降表达下降或者缺失，导致肿瘤形或者缺失，导致肿瘤形成。成。最后的结果可能导致过最后的结果可能导致过度增殖、侵入、凋亡的度增殖、侵入、凋亡的减少、不能正常分化或减少、不能正常分化
76、或者去分化，引起肿瘤的者去分化，引起肿瘤的形成。形成。115C.具有癌基因功能的具有癌基因功能的miRNA过表达也将导过表达也将导致肿瘤发生。致肿瘤发生。在异常组织或是不适在异常组织或是不适当的发育阶段这些当的发育阶段这些miRNA的表达增加，可的表达增加，可能导致其靶基因抑癌能导致其靶基因抑癌基因的表达下降，引基因的表达下降，引起肿瘤形成。起肿瘤形成。miRNA的表达增加，的表达增加，可能是由于可能是由于miRNA基因基因的扩增，持续性的启动的扩增，持续性的启动子活性，子活性，miRNA加工的加工的效率增高，或是效率增高，或是miRNA的稳定性提高。的稳定性提高。116基于上述的诸多问题，寻
77、找一种有效的方法来研究基于上述的诸多问题，寻找一种有效的方法来研究miRNA将是目前面临的首要问题。那么，又将产生将是目前面临的首要问题。那么，又将产生一系列问题：一系列问题：如何别离如何别离miRNA分子？分子？如何寻找如何寻找miRNA分子作用的靶基因？分子作用的靶基因？如何研究如何研究miRNA与靶与靶mRNA之间的关系？之间的关系？短短几年内短短几年内miRNA研究的迅速突破，为人们提供了研究的迅速突破，为人们提供了一种全新的认识基因和基因表达调节本质视角，同一种全新的认识基因和基因表达调节本质视角，同时也使人们开始注意时也使人们开始注意miRNA在疾病发生过程中所扮在疾病发生过程中所
78、扮演角色。演角色。正如正如PhillipZamore所说：所说：如果如果miRNAs在进化的进程中如此高度保守而没有在进化的进程中如此高度保守而没有任何实际功能的话，那真是大自然拿科研人员开涮，任何实际功能的话，那真是大自然拿科研人员开涮，而且是一个残酷的玩笑。而且是一个残酷的玩笑。117表观基因组学表观基因组学/ /遗传学遗传学在不影响在不影响DNA序列的情况下对其修饰序列的情况下对其修饰,不不仅影响个体的发育而且可遗传仅影响个体的发育而且可遗传.如如:一卵双生在同一环境中生一卵双生在同一环境中生,成年后表现成年后表现出性格、健康等方面的差异出性格、健康等方面的差异-表观遗传。表观遗传。经典
79、的遗传物质经典的遗传物质-核酸储存和传递遗传信核酸储存和传递遗传信息息DNA-RNA-蛋白质。蛋白质。表观遗传修饰也可记忆、遗传，向传统的表观遗传修饰也可记忆、遗传，向传统的遗传规律遗传规律/中心法那么提出挑战。中心法那么提出挑战。118DNADNA甲基化甲基化-表观遗传表观遗传DNADNA甲基化一般指构成甲基化一般指构成DNADNA的四个碱基之一的四个碱基之一的胞嘧啶的胞嘧啶C C发生异常，从而导致基因活发生异常，从而导致基因活性发生变化，即基因被性发生变化，即基因被“翻开或翻开或“关闭关闭。这种变化容易诱发癌症等疾病。这种变化容易诱发癌症等疾病。而科学家认为，大约一半的人类疾病可归而科学家
80、认为，大约一半的人类疾病可归咎于基因，而另外一半那么与非遗传因素咎于基因，而另外一半那么与非遗传因素有密切联系，其中表遗传因素又占据非遗有密切联系，其中表遗传因素又占据非遗传因素的一定比例。至于传因素的一定比例。至于DNADNA甲基化，它只甲基化，它只是表遗传因素中较重要的一种。是表遗传因素中较重要的一种。119DNA甲甲基基化化仅仅限限于于CpG双双核核苷苷酸酸人人DNA约约3%胞胞嘧嘧啶啶甲甲基基化化，CpG在在胞胞嘧嘧啶啶甲甲基基转转移移酶酶作作用用下下，加加-CH3到到胞胞嘧嘧啶啶5C原原子子上上，形形成成5-甲甲基基胞胞嘧嘧啶啶，其其化化学学上上不不稳稳定定并并易易于于脱脱氨氨基基形
81、形成成胸胸腺嘧啶腺嘧啶(T)。如：肿瘤组织中如：肿瘤组织中DNA常有异常甲基化作用。常有异常甲基化作用。甲基化甲基化激活癌基因。激活癌基因。另另一一方方面面，可可使使TSG5端端启启动动子子调调控控区区CpG岛岛异异常常甲甲基基化化，而而抑抑制制mRNA转转录录作作用用，导导致致TSG失活。失活。120121CpGCpG岛异常甲基化岛异常甲基化122DNA序列分析序列分析123细胞凋亡细胞凋亡-与肿瘤与肿瘤细胞凋亡在肿瘤和其它疾病中具有重要的意义。细胞凋亡在肿瘤和其它疾病中具有重要的意义。 自自19721972年年 KerrKerr提出细胞凋亡这一概念后，目提出细胞凋亡这一概念后，目前在很多生
82、物学领域进行广泛的研究。前在很多生物学领域进行广泛的研究。 8080年代末期开始成为肿瘤病因学、病理学研年代末期开始成为肿瘤病因学、病理学研究热点，人们对细胞凋亡的认识逐渐深入，对细究热点，人们对细胞凋亡的认识逐渐深入，对细胞凋亡发生分子机理的了解越来越透彻。然而，胞凋亡发生分子机理的了解越来越透彻。然而，也发现这一过程远非原来想象的那样简单，而是也发现这一过程远非原来想象的那样简单，而是包含了复杂的调控机制。包含了复杂的调控机制。124 尽管仍有许多问题甚至是关键的问题没有尽管仍有许多问题甚至是关键的问题没有搞清楚搞清楚, ,但近几年的研究在凋亡信号转导途但近几年的研究在凋亡信号转导途径、细
83、胞凋亡的生化反响机制以及细胞凋亡径、细胞凋亡的生化反响机制以及细胞凋亡的基因调控等方面都取得了显著的进展。的基因调控等方面都取得了显著的进展。 近几年来对细胞凋亡的最活泼领域包括：近几年来对细胞凋亡的最活泼领域包括： 细胞凋亡进程中重要的执行者细胞凋亡进程中重要的执行者Caspases; Caspases; 与细胞凋亡进程密切相关的线粒体；假设与细胞凋亡进程密切相关的线粒体；假设干重要的细胞凋亡调控基因。干重要的细胞凋亡调控基因。125 细胞凋亡的根本机制细胞凋亡的根本机制多细胞生物在凋亡过程中拥有相似的酶反响多细胞生物在凋亡过程中拥有相似的酶反响机制。美丽线虫机制。美丽线虫Caenorhab
84、ditis ElegansCaenorhabditis Elegans长久以来一直作为研究细胞凋亡机制核心长久以来一直作为研究细胞凋亡机制核心组分的一个良好的模型。组分的一个良好的模型。研究发现了三个重要的基因：研究发现了三个重要的基因： 促进凋亡的促进凋亡的CED-3CED-3和和CED-4CED-4 抑制细胞凋亡的抑制细胞凋亡的CED-9.CED-9.126CED-3CED-3是一个蛋白酶，激活的是一个蛋白酶，激活的CED-3CED-3可以水解可以水解靶蛋白从而使细胞死亡靶蛋白从而使细胞死亡. .CED-4+CED-3CED-4+CED-3促进促进CED-3CED-3激活，激活，CED-9
85、+CED-4CED-9+CED-4阻止激活阻止激活CED-3CED-3。正常情况下，正常情况下，CED-9+CED-4CED-9+CED-4结合结合CED-3CED-3，CED-3CED-3不激活状态。不激活状态。细胞凋亡信号会引起细胞凋亡信号会引起CED-9CED-9在上述复合体上解在上述复合体上解离下来，激活离下来，激活CED-3CED-3并最终发生凋亡。并最终发生凋亡。127脊椎动物那么进化了一整套的基因家族：脊椎动物那么进化了一整套的基因家族：1.哺乳动物哺乳动物Caspases与与CED-3同源同源；2.Apaf-1基因与基因与CED-4同源；同源；3.哺乳动物哺乳动物Bcl-2基因
86、家族与基因家族与CED-9在结在结构和功能上相似，但分为促进和抑制亚群。构和功能上相似，但分为促进和抑制亚群。128细胞凋亡的信号转导途径细胞凋亡的信号转导途径细胞内、外的许多信号刺激可以诱导细胞发细胞内、外的许多信号刺激可以诱导细胞发生凋亡，如相应配体结合死亡受体。如生凋亡，如相应配体结合死亡受体。如FasFas、TNFRTNFR等、紫外线照射和电离辐射、抗癌药物、等、紫外线照射和电离辐射、抗癌药物、生长因子缺乏、过度表达某些特定的癌基因生长因子缺乏、过度表达某些特定的癌基因和抑癌基因等。尽管这些信号以及随后的反和抑癌基因等。尽管这些信号以及随后的反响途径多种多样，但现已公认，细胞凋亡后响途
87、径多种多样，但现已公认，细胞凋亡后期的共同途径是期的共同途径是CaspasesCaspases的激活。的激活。Caspasesare a family of cysteine Caspasesare a family of cysteine proteases (proteases (半胱氨酸蛋白酶半胱氨酸蛋白酶) that are key ) that are key mediators of programmed cell death or mediators of programmed cell death or apoptosis. apoptosis. 129CaspasesCasp
88、ases在细胞凋亡中的作用：在细胞凋亡中的作用： Caspases Caspases与与CED-3CED-3在序列和结构上同源，它在序列和结构上同源，它们是一类进化上保守的半胱氨酸蛋白酶家族。们是一类进化上保守的半胱氨酸蛋白酶家族。功能上，激活的功能上，激活的CaspasesCaspases可以水解包括细胞可以水解包括细胞调节、细胞信号转导、调节、细胞信号转导、DNADNA修复、组织平衡、修复、组织平衡、细胞存活等环节中重要的蛋白，从而使细胞细胞存活等环节中重要的蛋白，从而使细胞表现为凋亡特有的形态学及生化特征表现为凋亡特有的形态学及生化特征: :细胞皱缩、断裂，染色质聚集，细胞皱缩、断裂，染
89、色质聚集，DNADNA降解，以降解，以及随后的凋亡细胞被吞噬细胞迅速地去除等。及随后的凋亡细胞被吞噬细胞迅速地去除等。130线粒体在细胞凋亡中的重要性线粒体在细胞凋亡中的重要性线粒体在促凋亡信号和线粒体在促凋亡信号和CaspasesCaspases激活之间起着不可激活之间起着不可替代的作用。替代的作用。线粒体在细胞凋亡中的作用包括：释放线粒体在细胞凋亡中的作用包括：释放CaspasesCaspases激激活因子如活因子如Cyto-cCyto-c；丧失电子转移功能并减少能量的；丧失电子转移功能并减少能量的产生；线粒体跨膜电位的消失以及与产生；线粒体跨膜电位的消失以及与BCL-2BCL-2蛋白家族
90、蛋白家族促凋亡和抑制凋亡功能相关等方面。促凋亡和抑制凋亡功能相关等方面。 线粒体及线粒体及Cyto-cCyto-c在细胞凋亡中的中心地位虽然在在细胞凋亡中的中心地位虽然在不同信号诱导的细胞凋亡中不一定具有普遍意义，不同信号诱导的细胞凋亡中不一定具有普遍意义，但线粒体作为细胞内死亡信号的感受者和放大者在但线粒体作为细胞内死亡信号的感受者和放大者在细胞凋亡中的重要性是勿庸置疑的。细胞凋亡中的重要性是勿庸置疑的。131凋亡机制凋亡机制132 重要的凋亡调控基因重要的凋亡调控基因Bcl-2Bcl-2基因家族：新发现的成员使基因家族：新发现的成员使Bcl-2Bcl-2基因家基因家族越来越庞大。族越来越庞
91、大。包括：包括： 抑制细胞凋亡的抑制细胞凋亡的 Bcl-2Bcl-2、Bcl-xLBcl-xL、A1/Bf1-1A1/Bf1-1、Bcl-wBcl-w、Nr13Nr13、Mcl-1; Mcl-1; 促进细胞凋亡的促进细胞凋亡的 BaxBax、BikBik、BakBak、BadBad、BidBid、HrkHrk、Bcl-xSBcl-xS等。等。 而更引人注目的而更引人注目的Bcl-2Bcl-2家族蛋白作用的生化机制家族蛋白作用的生化机制中与中与CaspasesCaspases和线粒体之间的密切关系。在细胞和线粒体之间的密切关系。在细胞凋亡信号转导中，不可能是简单的一连串事件的凋亡信号转导中，不可
92、能是简单的一连串事件的组合。组合。 参与其中调控的其它基因还有很多，如参与其中调控的其它基因还有很多，如CeramideCeramide、NF-BNF-B等。等。 133134 凋亡机制的研究进展非常迅速，但仍凋亡机制的研究进展非常迅速，但仍有很多问题需要更进一步的了解。有很多问题需要更进一步的了解。 凋亡精确的生化机制及其不同的信号转凋亡精确的生化机制及其不同的信号转导途径的调控；新的凋亡调控相关基因的导途径的调控；新的凋亡调控相关基因的发现；相关疾病如肿瘤中凋亡分子机制的发现；相关疾病如肿瘤中凋亡分子机制的异常；这些机制在疾病治疗中的意义等等。异常；这些机制在疾病治疗中的意义等等。 因此，
93、要想搞清凋亡的复杂而精致的调因此，要想搞清凋亡的复杂而精致的调控网络看来尚需时日。控网络看来尚需时日。 135综上所述综上所述综上所述综上所述: :C C癌变癌变癌变癌变 癌基因激活癌基因激活癌基因激活癌基因激活抑癌基因失活抑癌基因失活抑癌基因失活抑癌基因失活突变 染色体重排 基因扩增 启动子插入 突变 LOH DNA甲基化 癌基因癌基因 油门油门 比喻比喻 端粒酶端粒酶 油油 抑癌基因抑癌基因 刹车刹车 紊紊 乱乱 肿瘤发生肿瘤发生137复习题复习题1 1 1 1、概念、概念、概念、概念原发性异、常继发性异常、标记染色体原发性异、常继发性异常、标记染色体原发性异、常继发性异常、标记染色体原发
94、性异、常继发性异常、标记染色体marker marker marker marker chromosomechromosomechromosomechromosome、肿瘤抑制基因、肿瘤抑制基因、肿瘤抑制基因、肿瘤抑制基因TSGTSGTSGTSG、癌基因、癌基因、癌基因、癌基因、微卫星不稳定微卫星不稳定微卫星不稳定微卫星不稳定MIMIMIMI、端粒、端粒酶、端粒、端粒酶、端粒、端粒酶、端粒、端粒酶2 2 2 2、表达题、表达题、表达题、表达题1 1 1 1简述肿瘤染色体异常机制简述肿瘤染色体异常机制简述肿瘤染色体异常机制简述肿瘤染色体异常机制. . . .2 2 2 2简述简述简述简述KnudsonKnudsonKnudsonKnudson二次突变学说二次突变学说二次突变学说二次突变学说. . . .3 3 3 3简述癌基因分类及癌基因激活机制简述癌基因分类及癌基因激活机制简述癌基因分类及癌基因激活机制简述癌基因分类及癌基因激活机制. . . .4 4 4 4简述抑癌基因存在的证据简述抑癌基因存在的证据简述抑癌基因存在的证据简述抑癌基因存在的证据/ / / /研究途径研究途径研究途径研究途径. . . .5 5 5 5简述简述简述简述miRNAmiRNAmiRNAmiRNA与与与与siRNAsiRNAsiRNAsiRNA的异同？的异同？的异同？的异同？
