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1、核酸提取及常见问题分析（一）DNA主讲人：张蕾主讲人：张蕾09年年8月月12日日第二部分：第二部分：DNA提取方法简介提取方法简介第三部分：第三部分：DNA提取常见问题、提取常见问题、原因分析及其对策原因分析及其对策内容第一部分：前言第一部分：前言核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作最基本的操作 。前言第二部分：第二部分：DNA提取方法简介提取方法简介DNA提取的几种方法q基因组基因组
2、DNADNA的提取的提取CTAB法法SDS法法其它其它q线粒体、叶绿体线粒体、叶绿体DNA的提取的提取差速离心结合差速离心结合SDS裂解法裂解法基因组DNA CTAB法qCTAB法原理法原理（植物（植物DNA提取经典方法）提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基十六烷基三甲基溴化铵溴化铵），），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。物。该复合物在高盐溶液中（该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋
3、白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。出来。注：注：CTAB溶液在低于溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热。植物材料之前必须预热。qCTAB提取缓冲液的经典配方提取缓冲液的经典配方 组份组份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH8.0） NaCl CTAB-巯基乙巯基乙醇醇 终浓度终浓度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前使用前加入加入Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸
4、被破坏；提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合螯合Mg2+或或Mn2+离子，抑制离子，抑制DNase活性；活性；NaCl 提供一个高盐环境，使提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除基因组DNA CTAB法qCTAB提取缓冲液的改进配方提取缓冲液的改进配方 组份组份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH8.0）NaCl CTA
5、B PVP40-巯基乙巯基乙醇醇 终浓终浓度度 100 mM 20 mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前使用前加入加入vPVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。和多糖结合，有效去除多糖。基因组DNA CTAB法qCTAB法流程图法流程图植物材料植物材料裂解液裂解液上层溶液上层溶液液氮研磨液氮研磨抽提抽提细胞裂解细胞裂解干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DN
6、A溶液溶液基因组DNA CTAB法q SDS法原理法原理基因组DNASDS法SDS是是一一种种阴阴离离子子去去垢垢剂剂，在在高高温温（5565）条条件件下下能能裂裂解解细细胞胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提提高高盐盐(KAc或或NH4Ac)浓浓度度并并降降低低温温度度（冰冰浴浴），使使蛋蛋白白质质及及多多糖糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；杂质沉淀，离心后除去沉淀；上上清清液液中中的的DNA用用酚酚/氯氯仿仿抽抽提提，反反复复抽抽提提后后用用乙乙醇醇沉沉淀淀水水相相中中的的DNA。组份组份Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH 8.0 ）NaC
7、l SDS终浓终浓度度 10 mM 20 mM 0.4M 2%q SDS法法DNA提取缓冲液提取缓冲液q SDSSDS法流程图法流程图 （以动物组织为例）（以动物组织为例） 动物组织动物组织细胞裂解细胞裂解上层溶液上层溶液组织匀浆组织匀浆抽提抽提干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液基因组DNASDS法基因组DNA其它方法物理方式物理方式：玻璃珠法、：玻璃珠法、超声波法、研磨法、超声波法、研磨法、冻融法冻融法化学方式化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法：异硫氰酸胍法、碱裂解法生物方式生物方式：酶法：酶法q根据细胞裂解方式的不同有：根据细胞裂解方式的不同有：基因组DNA其它方
8、法吸附材料结合法：吸附材料结合法：q根据核酸分离纯化方式的不同有：根据核酸分离纯化方式的不同有：硅质材料硅质材料阴离子交换树脂阴离子交换树脂磁珠磁珠高盐低高盐低pHpH值结合核酸，低盐高值结合核酸，低盐高pHpH值洗脱。值洗脱。快捷高效。快捷高效。低盐高低盐高pHpH值结合核酸，高盐低值结合核酸，高盐低pHpH值洗脱。值洗脱。适用于纯度要求高的实验。适用于纯度要求高的实验。磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。物，从而达到分离目的。基因组DNA其它方法浓盐法浓盐法：有机溶剂抽提法有机溶剂抽提法：密度梯度离心法：密度梯度离心法：利用利用RN
9、P和和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离在盐溶液中溶解度不同，将二者分离有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物细胞器DNA差速离心法q差速离心法原理差速离心法原理是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。将待分离物质置于均匀介质（蔗糖将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分
10、离。从而得以分离。线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋白，它们的白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。种组分分级分离出来。第二部分：第二部分：DNA提取常见问题、提取常见问题、原因分析及其对策原因分析及其对策第三部分：第三部分：DNA提取常见问题、提取常见问题、原因分析及其对策原因分析及其对策DNA提取的基本步骤I.I.材料准备材料准备II.
11、II.破碎细胞或包膜内容物释放破碎细胞或包膜内容物释放III.III.核酸分离、纯化核酸分离、纯化IV.IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.V.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸溶解在适量缓冲液或水中材料准备最好使用新鲜材料，最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）时，要选择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，否则会造成组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解降解含病毒的液体材料含病毒的液体材料DNADNA含量较少，提取前先富集含量较少，提取前先富集基因组基因
12、组DNADNA的提取的提取细胞裂解材料应适量，过多会影响裂解，导致材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶组培细胞蛋白酶K细菌溶菌酶破壁细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠酵母破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡高温温浴时，定时轻柔振荡基因组基因组DNADNA的提取的提取核酸分离、纯化采用吸附材料吸附的方式分离采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体时，应提供相应的缓冲体系系采用有机（酚采用有
13、机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法法基因组基因组DNADNA的提取的提取核酸分离、纯化q蛋白质的去除：蛋白质的去除：酚酚/ /氯仿抽提氯仿抽提使用变性剂变性（使用变性剂变性（SDSSDS、异硫氰酸胍等）异硫氰酸胍等）高盐洗涤高盐洗涤蛋白酶处理蛋白酶处理q多糖的去除：多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/21/2体
14、体积的积的5M NaCl5M NaCl，高盐可溶解多糖。高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2(1/2体积体积) )，氯苯可，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。用用PEGPEG80008000代替乙醇沉淀代替乙醇沉淀DNADNA：在：在500L DNA500L DNA液中加入液中加入200l 20% PEG200l 20% PEG8000 8000 ( (含含1.2 M NaCl) 1.2 M NaCl) ，冰浴冰浴20min20min。核酸分离、纯化q多酚的去除：
15、多酚的去除：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇、巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如加入易与酚类结合的试剂：如PVPPVP、PEG(PEG(聚乙二醇聚乙二醇) )，它，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNADNA的结合的结合核酸分离、纯化q盐离子的去除：盐离子的去除：7070的乙醇洗涤的乙醇洗涤核酸沉淀、溶解当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分分沉淀时加入沉淀时加入1/10
16、体积的体积的NaAc（pH5.2，3M），），有利于充分沉淀有利于充分沉淀沉淀后应用沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用若长期储存建议使用TE缓冲液溶解缓冲液溶解TE中的中的EDTA能螯和能螯和Mg2+或或Mn2+离子，抑制离子，抑制DNasepH值为值为8.0，可防止，可防止DNA发生酸解发生酸解 基因组基因组DNADNA的提取的提取1.1.DNADNA中含有蛋白、多中含有蛋白、多糖、多酚类杂质糖、多酚类杂质2.2.DNADNA在溶解前，有酒在溶解前，有酒精残留，酒精抑
17、制精残留，酒精抑制后续酶解反应后续酶解反应3.3.DNADNA中残留有金属离中残留有金属离子子1.1.重新纯化重新纯化DNADNA，去除蛋去除蛋白、多糖、多酚等杂白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）质（具体方法见前）2.2.重新沉淀重新沉淀DNADNA，让酒精让酒精充分挥发充分挥发3.3.增加增加7070乙醇洗涤的乙醇洗涤的次数（次数（2-32-3次）次）DNA提取常见问题q问题一：问题一：DNADNA样品不纯，抑制后续酶解和样品不纯，抑制后续酶解和PCRPCR反应。反应。 原原因因对对策策1.1.材料不新鲜或反复冻材料不新鲜或反复冻融融2.2.未很好抑制内源核酸未很好抑制内源核酸酶的活性酶的
18、活性3.3.提取过程操作过于剧提取过程操作过于剧烈，烈，DNADNA被机械打断被机械打断4.4.外源核酸酶污染外源核酸酶污染5.5.反复冻融反复冻融1.1.尽量取新鲜材料，低温保存材尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融料避免反复冻融2.2.液氮研磨或匀浆组织后，应在液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液解冻前加入裂解缓冲液3.3.在提取内源核酸酶含量丰富的在提取内源核酸酶含量丰富的材料的材料的DNADNA时，可增加裂解液时，可增加裂解液中螯合剂的含量中螯合剂的含量4.4.细胞裂解后的后续操作应尽量细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔轻柔5.5.所有试剂用无菌水配制，耗材所有试剂用无菌水配
19、制，耗材经高温灭菌经高温灭菌6.6.将将DNADNA分装保存于缓冲液中，分装保存于缓冲液中，避免反复冻融避免反复冻融DNA提取常见问题q问题二：问题二：DNADNA降解。降解。对对策策 原原因因1.1.实验材料不佳或量少实验材料不佳或量少2.2.破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分3.3.沉淀不完全沉淀不完全4.4.洗涤时洗涤时DNADNA丢失丢失1.1.尽量选用新鲜（幼嫩）的材尽量选用新鲜（幼嫩）的材料料2.2.动植物要匀浆研磨充分；动植物要匀浆研磨充分；G G菌、酵母裂解前先用生物酶菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁或机械方式破壁3.3.高温裂解时，时间适当延长高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增（对于动物细胞、细菌可增加加PKPK的用量）的用量）4.4.低温沉淀，延长沉淀时间低温沉淀，延长沉淀时间5.5.加辅助物，促进沉淀加辅助物，促进沉淀6.6.洗涤时，最好用枪头将洗涤洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒液吸出，勿倾倒DNA提取常见问题q问题三：问题三：DNADNA提取量少。提取量少。对对策策 原原因因Thank you!
