临床免疫检验质量保证[共119页]

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1、临床免疫检验质量保证临床免疫检验质量保证卫生部临床检验中心 李金明定定 义义n质量保证质量保证(Quality Assurance,QA) 为一产品或服为一产品或服务满足特定质量要求提供充分务满足特定质量要求提供充分可信性可信性所必要的所必要的有计有计划的和系统的措施划的和系统的措施。 n室内质量控制（室内质量控制（Internal Quality Control,IQC) 由由实实验室工作人员验室工作人员，采取一定的方法和步骤，连续评价，采取一定的方法和步骤，连续评价本实验室工作的可靠性程度，旨在本实验室工作的可靠性程度，旨在监测和控制本实监测和控制本实验室工作的精密度验室工作的精密度，提高

2、本室常规工作中批内、批，提高本室常规工作中批内、批间样本检验的一致性，以间样本检验的一致性，以确定测定结果是否可靠、确定测定结果是否可靠、可否发出报告的一项工作可否发出报告的一项工作。 定定 义义n室室间间质质量量评评价价 （External External Quality Quality Assessment, Assessment, EQAEQA） 为为客客观观比比较较一一实实验验室室的的测测定定结结果果与与靶靶值值的的差差异异，由由外外单单位位机机构构，采采取取一一定定的的办办法法，连连续续、客客观观地地评评价价实实验验室室的的结结果果，发发现现误误差差并并校校正正结结果果，使使各各实

3、实验验室室之之间间的的结结果果具具有有可可比比性性。这这是是对对实实验验室室操操作作和和实实验验方方法法的的回回顾顾性性评评价价，而而不不是是用用来来决决定定在在实实时时的的测测定定结结果果的的可可接接受受性性。当当EQAEQA用用来来为为执执业业许许可可或或实实验验室室认认证证的的目目的的而而评评价价实实验验室室操操作作时时，常常描描述述为为实实验验室室能能力力验验证证（Proficiency Proficiency testing, testing, PTPT）。在在以以前前的的文文献献中中，EQAEQA常描述室间质量控制常描述室间质量控制。定定 义义n批批 (Run) 在相同条件下所获得

4、的一组在相同条件下所获得的一组测定。测定。 n均值（均值（Mean） n标准差（标准差（Standard deviation, SD或或s )n变异系数（变异系数（Coefficient of variation, CV） 定定 义义n正态分布正态分布(Gaussian distribution) 当一质控物用同一方法在不同的时间重复多次测定，当测定数据足够多时，如以横轴表示测定值，纵轴表示在大量测定中相应测定值的个数，则可得到一个两头低，中间高，中为所有测定值的均值，左右对称的“钟形”曲线，亦即正态分布，又称高斯分布。 定定 义义n正态分布的基本统计学含义可用均数（）、标准差（s）和概率来说

5、明。临床实验室常规检验步骤临床实验室常规检验步骤n标本收集：标本收集：选择测定项目、标本收集和保存。n实验室测定：实验室测定：标本接收、贴标签、样本处理、检测、测定的有效性和临床诊疗价值。n报告和解释：报告和解释：结果发出、结果解释和临床管理。质量保证、室内质控和室间质评之间的关系质量保证、室内质控和室间质评之间的关系实验室质量管理体系的建立实验室质量管理体系的建立n质量手册质量手册n质量体系程序文件质量体系程序文件n标准操作程序标准操作程序(相关记录表格相关记录表格)质量管理的内涵质量管理的内涵n写你所做的n做你所写的n记录你已做的n分析你已做的怎样编写怎样编写SOP？分析你已做的分析你已做

6、的n每次实验结果的分析 表象与真象n多次实验结果的综合分析 趋势的内在含义n仪器设备的使用情况分析 维护与校准周期的有效性临床免疫检验方法临床免疫检验方法n三大“标记”免疫检验技术:荧光标记、放射性核素标记和酶标n其它标记免疫测定技术：发光物标记、金标、元素标记等n免疫沉淀和免疫凝集试验免疫检验技术的应用免疫检验技术的应用(1)免疫比浊和免疫沉淀免疫比浊和免疫沉淀:灵敏度低;可用于体内含量较高的Ig、补体、CRP等的测定;(2)标记免疫检验技术标记免疫检验技术:放免酶免灵敏度高;用于含量低的激素、病原体抗原抗体测定等;荧光标记技术有特定的应用;金标则为一种很方便的point of care检验

7、技术。免疫检验的标本免疫检验的标本n标本采集、运送和保存n可能影响测定结果的标本因素标本类型及采集容器标本类型及采集容器n最常用的标本：血液，包括血清、血浆和全血。唾液或尿液 。n建议采用真空采血管及蝶形针具，以免直接接触血液。采集容器最好为一次性无菌密闭容器。标本采集时间及患者准备标本采集时间及患者准备n激素和治疗药物：可的松峰值在早晨46点之间；生长激素、促黄体激素（LH）和促卵泡激素（FSH）均以阵发性方式释放，须在密切相连的时间间隔内采取数份血样本，以其中间值为测定值。又如当从卧位变为站立位时，血清中肾素活性将出现明显增高。再如治疗药物的检测，应根据药代动力学选择服药后的最适时间抽血检

8、测。 标本采集时间及患者准备标本采集时间及患者准备n感染性病原体抗原、抗体n肿瘤标志物n特定蛋白可能影响测定结果的标本因素n内源性干扰因素：类风湿因子、补体、异嗜性抗体、治疗性抗体、自身抗体、溶菌酶、磷脂、药物小分子、总蛋白浓度等n外源性干扰因素：溶血、细菌污染、标本贮存时间过长、凝固不全、反复冻融类风湿因子类风湿因子(RF)干扰干扰nRF一般为IgM型，亦有IgG和IgA型nRF具有与变性IgG产生非特异结合的特点n在捕获法IgM型特异抗体的测定中表现最为明显，因为此时固相包被的抗体为抗人链抗体，IgM型RF的存在可使其大量结合于固相。 类风湿因子干扰的排除类风湿因子干扰的排除n稀释标本n改

9、变酶标抗体n用变性IgG预先封闭标本中RFn测抗原,可加入还原剂如2-巯基乙醇去除RFn使用特异的鸡抗体IgY作为酶标或固相抗体补体干扰补体干扰n固相抗体和酶标二抗可因为其在固相吸附及结合过程中，抗体分子发生变构，从而其Fc段的补体C1q结合位点被暴露出来，这样C1q就成为一个中介物将二者交联起来，从而出现假阳性结果。n固相抗体也会因为活化补体的结合，封闭抗体的抗原表位结合能力，而引起假阴性结果或使定量测定结果偏低。 补体干扰的排除补体干扰的排除n56 30min加热可使标本中补体C1q灭活n使用特异的鸡抗体IgY作为酶标或固相抗体异嗜性抗体的干扰异嗜性抗体的干扰天然的异嗜性抗体（IgG）可分

10、为两类:n一类（85%的假阳性由其引起）可结合于山羊、小鼠、大鼠、马和牛IgG的Fab区域，但不与兔IgG的Fab区结合。n另一类（15%的假阳性由其引起）可结合于小鼠、马、牛和兔IgG的FC区表位，但不与山羊和大鼠IgG的FC区表位结合。异嗜性抗体可通过交联固相和酶标的单抗或多抗而出现假阳性反应。异嗜性抗体干扰的排除异嗜性抗体干扰的排除n使用特异的兔F(ab)2片段作为固相或酶标抗体。n在标本或标本稀释液中加入过量的动物Ig，封闭可能存在的异嗜性抗体。但加入量不足或亚类不同时无效。n使用靶特异的非Ig亲和蛋白（Affibody）替代固相或酶标抗体之一。采用噬菌体展示技术展示来自单个金黄色葡萄

11、球菌A蛋白（SPA）联合文库的人IgA结合亲和蛋白，用于IgA的测定，不受异嗜性抗体的影响。n使用特异的鸡抗体作为固相和测定抗体。抗鼠抗鼠Ig抗体的干扰及排除抗体的干扰及排除n抗鼠抗体对使用鼠源性单克隆抗体的酶免疫测定，可产生假阳性结果 干扰排除可采用下述方法干扰排除可采用下述方法:n使用特异的抗体F(ab)2片段作为固相或测定酶标抗体。n在标本或标本稀释液中加入过量的鼠Ig，封闭可能存在的抗鼠抗体。n使用特异的鸡抗体IgG作为固相和测定抗体。鸡IgG不与人抗鼠抗体反应。因而，用其作为固相或酶标抗体不会出现假阳性结果。 自身抗体自身抗体干扰干扰n自身抗体如抗甲状腺球蛋白、抗胰岛素等，能与其相应

12、靶抗原结合形成复合物，在ELISA方法中可干扰相应抗原抗体的测定。n为避免以上情况出现，可在测定前用理化方法将其解离 溶菌酶干扰溶菌酶干扰n溶菌酶可与等电点较低的蛋白有强的结合能力。免疫球蛋白等电点约为5，因此，在双抗体夹心法ELISA测定中，溶菌酶可在包被的IgG和酶标的IgG间形成桥接，从而导致假阳性。n为保证ELISA测定的可靠性，有必要从标本中去除溶菌酶或将其封闭，Cu2+离子和卵白蛋白可有效地封闭溶菌酶，防止其联接IgG。标本溶血标本溶血 n注意避免出现严重溶血。n血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，因此，在以HRP为标记酶的ELISA测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较

13、高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的HRP底物反应显色。标本被细菌污染标本被细菌污染n细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用n细菌的内源性酶如大肠杆菌的-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。 标本贮存时间过长标本贮存时间过长 n标本在28下保存时间过长，IgG可聚合成多聚体，在间接法ELISA测定中会导致本底过深、甚至造成假阳性。n血清标本如是以无菌操作分离，则可以在28下保存一周，如为有菌操作，则建议冰冻保存。样本的长时间保存，应在70以下。 标本凝固不全标本凝固不全 n血液采集后，如收集管中无促凝剂和抗凝剂，则血液通常在半

14、小时后开始凝固，1824h完全凝固。日常检验中，常在血液还未开始凝固时即离心分离血清，此时因血液没有完全凝固，离出的“血清”并非为完全的血清，其中仍残留部分纤维蛋白原，如将其加入微孔中，在ELISA测定过程中仍可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果n血液标本采集后，应使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。冰冻保存标本避免反复冻融冰冻保存标本避免反复冻融n反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。酶联酶联免疫吸附试验免疫吸附试验（ELISA）影响影响ELISAELISA测定的因素测定的因素n试剂盒的因

15、素n实验操作影响影响ELISAELISA试剂盒质量的因素试剂盒质量的因素n固相材料:聚苯乙烯塑料n抗原:纯化、合成和基因工程抗原n抗体：多抗、单抗和基因工程抗体n酶结合物：酶免疫测定的核心成份n色原底物：OPD和TMBn运输贮存固相上抗原抗体的相互作用固相上抗原抗体的相互作用n固相上抗原抗体结合反应所需要的时间 n反应体积 n离解速率n微孔内特异抗体的免疫测定 n固相的抗体或抗原 EEE固相上抗原抗体结合反应所需要的时间n固相抗原抗体结合达到平衡所需要的时间，要大于液相免疫测定，并随液体所占体积与界面抗体或抗原受体所占体积比的增加而增加。 n扩散性越强则反应所需时间越短，结合越充分。这一点可通

16、过旋转振荡来达到 ,也可在微孔中放一个惰性的塞子以使反应液体成为一个小体积，或使用一个具有大表面的多孔的基质如硝酸纤维素，或使用微颗粒来做到这一点。 反应体积反应体积n此处的反应体积并非是微孔中的液体体积，而是固相免疫测定中与固相包被的抗体或抗原有接触的部分 n固相抗原抗体反应发生于液体-固相界面，可能处于一级结合键的引力距离内，小于100。液相中待测抗原或抗体要进入到这个结合界面，需要扩散或质量转移。n微颗粒的反应表面区域较微孔要大得多，因而处于抗原抗体结合界面的体积占总反应体积的比例亦高得多。因此，结合反应的效率更高。这也是全自动化免疫测定分析仪均采用微颗粒固相的重要原因之一。 离解速率

17、n固相界面上结合反应的离解速率较液相中的要低两个梯度 n被动吸附于固相的抗原和抗体显然也是成簇或聚集状的，因此，反应界面的抗原或抗体可能也是“成簇的” n大多数抗原-抗体的离解所需的能量比防止其结合所需的能量要大，表明在初始结合键形成后，又形成了次级结合键。 n很高的固相抗体或抗原浓度，尤其是以成簇出现的以及来自于限定的界面反应体积的抗体或抗原，使得离解的抗原的重新结合较液相系统更为快速。n即使是测定的反复洗涤步骤，也可使抗原抗体仍保持处于结合状态。 微孔内特异抗体的免疫测定 n使用吸附的复杂抗原进行微孔内特异抗体的免疫测定，与液相测定相比，有明显的亲和力依赖性 n固相抗原的捕获能力差的原因固

18、相抗原的捕获能力差的原因: : 1.有结合能力的抗原浓度极低。这可能是由于所吸附的抗原因为变性或空间位阻而致抗原表位丧失的结果。 2.抗原表位由于吸附发生改变，使得其被其抗体结合部位以较低的亲和力结合。 固相的抗体或抗原固相的抗体或抗原 n固相化的抗体或抗原可能与液相中的抗体或抗原所展示的构型差异酶免疫测定操作中的注意事项酶免疫测定操作中的注意事项n试剂准备试剂准备n加样加样n温育温育n洗板洗板n显色显色n比色比色n结果判断结果判断n结果报告及解释结果报告及解释试剂准备试剂准备n从冰箱中取出的试剂，待温度与室温平衡后使用；n所用蒸馏水或去离子水应保证质量。加加 样样n加样不可太快，避免加在孔壁

19、上部，不可溅出和产生气泡。n从滴瓶中滴加试剂，除了要注意滴加角度外，滴加速度也很重要，滴加太快，很容易出现重复滴加或加在两孔之间的现象，这样就会在孔内的非包被区出现非特异吸附，从而引起非特异显色。n全自动加样系统的标本“交叉污染”问题 温温 育育n常采用的温育温度有43、37、室温和4等。n 温育所需时间与温度成反比，即温育温度高，则所需时间相对较短。n温育时，微孔板应置于水浴（浮于水面）或湿盒中，以使反应溶液的温度迅速与室温平衡。 n“边缘效应”的排除: 使用水浴或在将反应溶液加入至板孔中时，将板和溶液均加热至温育温度（如37），就可以很容易地排除“边缘效应”，并且可提高测定的重复性。洗洗

20、板板n每次温育后洗板是否彻底，与非特异背景显色有很大关系。n洗板液一般为含0.05% Tween20的中性PBS。nTween20为一种非离子去垢剂，既含亲水基团，也含疏水基团。n洗涤作用机理，借助其疏水基团与固相上蛋白的疏水基团形成疏水键，从而削弱蛋白与固相的吸附，同时在其亲水基团与液相中水分子的结合作用下，促使蛋白质脱离固相而进入液相n洗板液中Tween20浓度高于0.2%，可使包被于固相上的抗原或抗体解吸附而影响试验测定下限。显显 色色n加入底物A和B后，应振荡混匀n当底物为OPD时，显色反应应避光进行n一般商品试剂盒显色反应条件为37或室温反应1530 min。从理论上说，3730分钟

21、才可以使HRP的底物催化反应完全，尽管在最初的10分钟内，绝大部份催化反应即可完成。因此，为使弱阳性样本孔能有充分的显色，建议在37下反应2530分钟后，终止反应比色测定。 比比 色色n加酸终止显色反应后，比色测定前应振荡混匀n 测定时，要注意酶标仪的波长是否已调至合适n 比较好的酶标仪可选择单波长或双波长比色测定，所谓双波长比色，即在敏感波长（此时对所显色具最大光吸收）如450 nm和非敏感波长（所测得的光吸收为微孔板上的划痕、污迹以及指纹等所致），最后从仪器得到的读数为在敏感波长测得的吸光度与非敏感波长测得的吸光度之差。结结 果果 判判 断断n 按照试剂盒确定的Cut-off值判断结果 n

22、 ELISA测定的“灰区” （可疑结果的含义） 室内质量控制（室内质量控制（IQC）n测定前的质量控制n统计学质量控制n质量控制的评价测定前的质量控制测定前的质量控制n实验室设施、仪器设备及管理n理想的试剂和操作方法 n人员培训 实验室设施、仪器设备及管理实验室设施、仪器设备及管理n临床免疫检验实验室应有充分合理的空间、良好的照明、空调及湿度维持设备 ；n实验室仪器设备应保养良好，实验用品要达到相应的要求。加样器的校准？ 离心机？水浴箱和/或恒温仪？ 酶标仪和洗板机？仪器设备的校准周期仪器设备的校准周期理想的试剂和操作方法理想的试剂和操作方法n改善测定精密度的措施必须首先着重在最不精密的步骤上

23、，应对试剂准备、标本收集、测定方法和仪器操作写出“标准操作程序”(SOP) 酶免一步法的酶免一步法的“HOOK EFFECT”HOOK EFFECT”问问题题洗板待测抗原底物温育显色E酶标抗体EEEEEEEE洗板固相抗体洗板待测抗体底物温育显色酶标抗原ANEE洗板固相抗原EEEEEEE一步法的一步法的“HOOK EFFECT”HOOK EFFECT”产生的产生的原因原因 Ab Ag Ab Ag （b复合物） (1) Ab AgAb* Ab Ag Ab* （a复合物） (2)AbAgAb* Ab Ag Ab* Ab Ag Ag Ab*Ab* Ag Ab* a b c d人员培训人员培训 n免疫测

24、定通常为手工操作，要得到可靠的测定结果，操作人员需要一定技术知识和经验。在实际工作中，不同的操作者所获得的结果往往变化较大，因此，人员的培训非常重要。n知其然知其所以然知其然知其所以然。 统计学质量控制统计学质量控制 n理想的室内质控样本的条件n质控物浓度的选择n测定中质控样本的设置、数量及排列顺序 n统计学质控的特点 n统计质控方法理想的室内质控样本的条件理想的室内质控样本的条件n基质与待测样本一致；n所含待测物浓度接近试验的决定性水平；n稳定；n靶值或预期结果已定；n无已知的生物传染危险性；n单批可大量获得；n价廉定性测定质控物浓度的选择定性测定质控物浓度的选择n可选择S/CO值减去精密度

25、测定中得到的三倍批间CV（通常的ELISA测定批间变异（CV%）在15%左右）与该S/CO值的乘积（意即三倍SD）仍大于1的质控血清作监测重复性的室内质控用 计算公式：计算公式：S/CO（1-3CV%）=S/CO-3SDn同时选择S/CO处于1.5左右的质控血清以判断每次测定时试剂盒测定下限的有效性。 测定中质控样本的设置、数量及排列测定中质控样本的设置、数量及排列顺序顺序n定性测定：弱阳性和阴性质控样本n定量测定：高、中和低浓度n数量n排列顺序统计学质控的特点统计学质控的特点 n检验误差有两类，一是系统误差，一是随机误差。n系统误差通常表现为质控物测定均值的漂移，是由操作者所使用的仪器设备、

26、试剂、标准品或校准物出现问题而造成的，这种误差可以通过前述的措施方法加以控制，是可以排除的。n随机误差则表现为测定SD的增大，主要是由实验操作人员的操作等随机因素所致，其出现难以完全避免和控制。统计学质控的功能统计学质控的功能n统计学质控的功能就是发现误差的产生及分析误差产生的原因，采取措施予以避免。n开展统计质量控制前，应将可以控制的误差产生因素尽可能地加以控制，这不但是做好室内质控的前提，也是保证常规检验工作质量的先决条件。 统计质控方法统计质控方法 n基线测定n质控规则的表达方式及定义 nLevey-Jennings质控图方法 nLevey-Jennings质控图结合Westgard多规

27、则质控方法 n累积和 (CUSUM) 质控方法 n“即刻法”质控方法 n质控图的连续性基线测定基线测定n最佳条件下的变异（Optimal conditions variance, OCV）和常规条件下的变异（Routine conditions variance, RCV）； n当RCV与OCV接近，或小于2 OCV时，则RCV是可以接受的。以上为批间变异。n批内变异的测定；n室内质控物的测定准确度的评价。 临床免疫检验临床免疫检验IQC统计计算问题统计计算问题n定性测定质控统计可使用质控样本测定的S/CO值或OD值。 质控规则的表达方式及定义质控规则的表达方式及定义 n质控规则的表达方式 n

28、质控规则的功能 n常用质控规则的符号及定义 质控规则的表达方式质控规则的表达方式n通常质控规则以符号AL来表示，其中A为质控测定中超出质量控制限的测定值的个数，L为控制限，通常用均值或均值13SD来表示。 n当质控测定值超出控制限L时，即可将该批测定判为失控。 n常用的13S质控规则，其中1为原式中的A，3s为原式中的L，表示均值3s，其确切的含义为：在质控测定值中，如果有一个测定值超出均值3s范围，即可将该批测定判为失控。 质控规则的功能 n简单地说就是用于判断测定批的失控还是在控。n当整个质控过程中使用同一个质控物时，可用来判断单个或多个测定批内该质控物的测定值是否失控。 n当整个质控过程

29、中使用两个或两个以上的不同的质控物时，可用来判断同一或多个测定批内的两个或两个以上的质控物的测定值是否失控。 常用质控规则的符号及定义常用质控规则的符号及定义 符符 号号 定定 义义n12S 一个质控测定值超出2s控制限。n13S 一个质控测定值超出3s控制限。n22S 两个连续的质控测定值同时超出+2s或2s控制限。nR4S 同一批测定中，两个不同浓度质控物的测定值之间的 差值超出4s控制限。n41S 四个连续的质控测定值同时超出+1s或1s控制限。n7T 七个连续的质控测定值呈现一个向上或向下的趋势变 化。n10X 十个连续的质控测定值同时处于均值（）的同一侧。Levey-Jennings

30、质控图方法质控图方法 n也称Shewhart质控图，是由美国的Shewhart 于1924年首先提出，并用于工业产品的质量控制。n二十世纪五十年代初，Levey-Jennings将其引入临床检验的质量控制 。经Henry和Segalove的改良，即为目前常用的Levey-Jennings质控图。Levey-Jennings质控图质控图Levey-Jennings质控图质控图基本的统计学含义基本的统计学含义n稳定条件下，在20个IQC结果中不应有多于1个结果超过2SD（95.5%可信限）限度；在1000个测定结果中超过3SD（99.7%可信限）的结果不多于3个。n如以3s为失控限，假失控的概率为

31、0.3%。质控图质控图的记录的记录n质控结果n日期n试剂n质控物批号和含量n测定者姓名等。 Levey-Jennings质控图方法的特点质控图方法的特点n优点：简单明了n缺点： 以2s为失控限，假失控的概率太高，通常不能接受。 以3s为失控限，假失控的概率低，但误差检出能力不强。 Levey-Jennings质控图结合质控图结合Westgard多规则质控方法多规则质控方法 nWestgard多规则质控方法即是将前述的多个质控规则同时应用进行质控判断的方法。n最初常用的有六个质控规则，即12S、13S、22S、R4S、41S和10X，其中12S规则作为告警规则。n13S和R4S规则反映的是随机误

32、差。22S、41S和10X反映的是系统误差，系统误差超出一定的程度，也可从13S和R4S规则反映出来。 Westgard多规则质控方法的特点多规则质控方法的特点n在Levey-Jennings质控图方法的基础上产生，具有Levey-Jennings 质控图方法的优点，可通过相似的质控图来进行分析。 n假失控和假告警概率低。 n误差检出能力增强 。累积和累积和 (CUSUM) 质控方法质控方法n累积和 (CUSUM) 质控方法于1977年由Westgard等提出,对系统误差有较好的测出能力。 常用的累积和常用的累积和 (CUSUM) 质控规则质控规则 质控规则质控规则 起动累积和计算的阈值（起动

33、累积和计算的阈值（k） 质控限（质控限（h） 1.0s 2.7s 1.0s 3.0s 0.5s 5.1s累积和累积和 (CUSUM) 质控图质控图“即刻即刻”质控方法质控方法 n“即刻法” 的实质是一种统计学方法,即Grubs异常值取舍法 n只要有3个以上的数据即可决定是否有异常值的存在。 免疫测定免疫测定IQCIQC的特殊性的特殊性n免疫测定有其本身的独特性，如有些激素或药物测定常覆盖较大的工作范围，且可能有数个“临床决定性水平”，测定中需进行不同浓度的质控物进行质控测定，而标准差（SD）随质控物浓度的增大往往也明显变大，从而使得用不同浓度质控物作图的间隔比例相差较大，因此有必要对质控图绘制

34、的一般方法进行修改，可采用相对误差（测定值与均值的%比差异）(CV)替代绝对误差SD来作质控图。以以CVCV替代替代SDSD作质控图作质控图质控图在不同批试剂间的连续质控图在不同批试剂间的连续y1=3.550x1+0.226（2001081501批） y2=3.238x2+0.388（2001040501批） y3=3.428x3+0.148（2001072501批） y2/y1=0.960 y3/y1=0.908 质控图在不同批试剂间的连续质控图在不同批试剂间的连续室内质控数据的评价室内质控数据的评价 nIQC为一集体活动，除实际测定者外，还应有另外一人对测定数据进行质检。n不能将IQC作为

35、一个监察方法，当发现一次测定未达到质量标准时，应以建设性的而非批评的方式去探查失控的原因。n除了将IQC数据作为日常质控外，还应定期评价累积数据以监测在测定操作中的长期变化趋势。n评价应定期进行。IQCIQC的局限性的局限性n在免疫测定中在免疫测定中IQCIQC可能测不出的误差可能测不出的误差 n 测定前测定前 测定中测定中 测定后测定后 样本鉴定不对样本鉴定不对 样本吸取不对样本吸取不对 结果记录错误结果记录错误 样本贮存中变质样本贮存中变质 试剂加入不对试剂加入不对n此类误差的发生率在不同的实验室有所不同，一此类误差的发生率在不同的实验室有所不同，一般要求小于般要求小于0.1%0.1%，且

36、应均衡地分布于测定前、测，且应均衡地分布于测定前、测定中和测定后的不同阶段。定中和测定后的不同阶段。 酶免疫测定出现假阳性的原因酶免疫测定出现假阳性的原因n操作及仪器因素：加样、洗板、自动化加样系统的标本间“交叉污染”n标本因素：RF、补体、异嗜性抗体、动物抗体、动物抗体、高浓度Ig、溶血、细菌污染、标本贮存时间过长、标本凝固不全酶免疫测定出现假阴性的原因酶免疫测定出现假阴性的原因n操作、试剂及仪器因素：标本未加、试剂过期或变质、仪器针孔堵塞、标本“交叉污染”n标本因素：补体、自身抗体、反复冻融室间室间质量评价（质量评价（EQAEQA）nEQAnProficiency testing (PT)

37、 EQA EQA 的的程序设计程序设计n确定质评方案,定期发放质评样本；n要求参加质评实验室报告结果的单位要一致，以便于统计；n报告要清楚、简洁； n要求参评实验室在测定EQA样本时，要以与常规样本完全相同的方式测定； n对测定方法、试剂及仪器等归纳总结；n对参评实验室的测定要有评价； nEQA报告要迅速及时。 EQA质评样本质评样本n样本特征与患者样本应尽量一致n样本浓度与试验的临床应用相适应n在样本发放的条件下稳定n不存在不可避免的传染危险性EQA靶值靶值n定性测定，应为明确的阴性或阳性n定量测定，则提供参考方法值或参加实验室的修正均值或参考实验室均值或方法或归组的方法均值评价方法评价方法

38、n特定参评实验室的评分根据其与其它实验室得分之间的关系，可分为绝对评分和相对评分两种模式。 n绝对评分就是根据已定的靶值对参评实验室测定的每份质评样本计分，然后再计算该次质评的总分，以得分的高低评价参评实验室的水平。 n相对评分则是将参评实验室质评得分与所有参评实验室的平均分进行比较，观察其得分在全部参评实验室中所处的位置。 相对评分和绝对评分的例子相对评分和绝对评分的例子n相对评分：英国NEQAsn绝对评分：美国CAP采用何种评分方法较好？采用何种评分方法较好？n建立一个质评体系，上述绝对评分和相对评分的方法均可以采用，其实质内容并无太大的差别，只不过是表现形式的不同，尤其是在定量测定。从室

39、间质量评价对改善实验室测定质量的作用来看，究竟是采用上述哪一种或另外制定的评价方法其实并不重要，关键是要有一个评价方法，从而以其为标准去评价实验室的测定。 EQA对测定技术的评价对测定技术的评价n使用适当的统计学方法n全面地对方法、试剂和单个参评实验室测定技术进行评价n指明严重误差n适当时评价测定的其它方面（如测定干扰）。EQA的局限性的局限性n参评实验室没有同等的对待EQA样本和患者样本n可能会妨碍给出不同结果的改良方法的发展n在不同的EQA程序中，对实验室的评价可能不同临床免疫检验的标准化临床免疫检验的标准化n临床免疫检验标准化的一般原则（1）标准品和质控品（2）参考方法标准品和质控品（标

40、准品和质控品（1 1）n可提供标准品的国际标准化组织有：WHO生物学标准化专家委员会（ECBS）、英国国家生物学标准和质控物研究所(National Institute for Biological Standards and Control,NIBSC)、美国CDC和CAP、国家卫生研究所（NIH）、IFCC等；国内有中国药品生物制品检定所、卫生部临床检验中心标准品和质控品（标准品和质控品（2 2）n在美国免疫检验试剂方法用于临床必须有FDA批准；在德国监督机构为INSTAND；在国内试剂批准文号由SFDA负责。n仅使用标准品并不能保证免疫测定结果的可比性，但其在保证免疫测定质量中的重要性却

41、是不可替代的。标准品和质控品（标准品和质控品（3 3）n标准品和质控品的功能:可用作临床检测的校准物; 可用来评价试验的有效性;作为室内质控样本; 作为室间质评样本.n标准品分级:可分为第一,第二和第三等三个等级. 一级标准数量有限,可使用10-20年,是冻干品,内含载体蛋白. 一级标准可用来校准第二和第三级标准. 国际标准品(IS)作为第一级标准, 二级标准可用来维持校准.标准品和质控品（标准品和质控品（4 4）对适用于免疫测定的标准品的一般要求 要 求 一级标准 二级标准 三级标准来 源 单 一 多 个 多 个使用时间 10-20年 1-5年 1-数年制 备纯化物于载体蛋白缓冲溶液中纯化物

42、,混合血清,提取物于载体蛋白缓冲溶液中血清或血浆,人工蛋白为基础的缓冲液定值方法多中心合作研究免疫测定,与一级标准比对免疫测定,与二级标准比对贮存方式 冻 干-70下冻存冰冻或于稳定溶液中,可能的话冻干 标准品和质控品（标准品和质控品（5 5）n对用于不同类型免疫测定的一级标准的特殊要求 要 求已知结构的多肽已知结构的多肽( (激激素和肿瘤标志物素和肿瘤标志物) )未未知知结结构构的的蛋蛋白白（抗抗体体确确定定的肿瘤标志物）的肿瘤标志物） 血清蛋白血清蛋白 低分子量化低分子量化合物（类固合物（类固醇、甲状腺醇、甲状腺素）素） 纯 度 最纯的蛋白部分纯化或未纯化提取物或体液混合血清 化学纯（99

43、% ）定值方法 氨基酸分析（物质浓度）；称重（质量浓度）；比对较早的标准进行免疫测定（IU）；（生物测定，IU） 国际组织的一致性结果；研制者指定的单位。国际组织的一致性结果；比对纯蛋白进行免疫测定（质量浓度） 称重（物质和质量浓度）；光电比色测定。 标准品和质控品（标准品和质控品（6 6）n标准品的单位: 国际标准品一般以IU/L表示,但已很明确的物质如类固醇和甲状腺素,则以摩尔浓度（mol/L）表示。鉴定明确的肿瘤标志物的浓度常以质量浓度（g/L）表示，而不太明确的标志物则以指定的单位（U/L）表示。 标准品和质控品（标准品和质控品（7 7）n免疫测定并不能测定生物活性，其实际上测定的是抗

44、原上一个决定基（epitope）或一组决定基的摩尔浓度，尤其是使用单克隆抗体进行测定时。因此，摩尔浓度（mol/L）最能确切地反映所测定的是什么。标准品和质控品（标准品和质控品（8 8）: : 一级标准的一级标准的值传递至校准物的几个校准步骤值传递至校准物的几个校准步骤标准品定值的测定方法标准品定值的测定方法 : :参考方法参考方法n决定性方法（Definitive method）: 是一个具有高精密度及没有系统偏差的参考方法。n参考方法:(Reference method）:应有低测下限、不受非特异干扰及不与相关的化合物发生交叉反应，同时还应该容易得到。n为保持参考方法的有效性, 有必要建立

45、一个参考实验室的网络.免疫测定标准化的难点免疫测定标准化的难点n基质效应（Matrix effects） n抗原的不均一性和交叉反应性n实验设计基质效应（基质效应（Matrix effectsMatrix effects）n定义: 干扰抗原和抗体间反应但与分析物本身无关的非特异因素。n基质效应产生的原因:蛋白、盐、磷脂、补体、抗免疫球蛋白抗体（类风湿因子和人抗鼠抗体）、药物和可能污染样本的物质引起。 抗原的不均一性和交叉反应性抗原的不均一性和交叉反应性n蛋白激素：除有生物学活性形式外，还有前激素、片段和亚单位。副甲状腺素（PTH）、ACTH及其前体、催乳素和胃泌素的大的形式以及生长激素的拼接变异体等均可引起测定问题。hCG 的亚单位。n血浆蛋白的变异体问题如何与临床如何与临床“对话对话”n滥用问题: 检验科的责任 ?n比较严重的有以下二个方面: 一是传染性病原体感染血清学标志物; 二是肿瘤标志物。