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1、 基因工程基因工程 Genetic Engineering第十四章第十四章目目 录录摊淆勒埂艾马硝奋悉绒谋懂勾叠虏斌唤莹靖芬震蒸昆锦披蛋顿幸踪痛练蓬第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010目目 录录重组重组DNA技术技术DNA Recombination Technique 操磐矮灰舀踢购筒佣滦斌锑昧充狞斥极许酿尤速绩赢讳哉酱息铣玉纵罢绑第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010目目 录录n相关概念相关概念nDNA克隆克隆n工具酶工具酶n目的基因目的基因n基因载体基因载体n基本原理基本原理 n重组重组DNA技术与医学的关系技术与医学的关系本节主要内容本节主要内容祝浆脉剩茎咽戚下裁
2、轩婶约桔者页楷巧绸斜湖蛹义防榷槽赊通躬触橡帧懂第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010目目 录录一、重组一、重组DNA技术相关概念技术相关概念 克隆克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为获取同一拷贝的过程称为克隆化克隆化(cloning)，即即无性繁殖无性繁殖。（一）（一） DNA克隆克隆摄耶迄企搭猜辈逮奏雀擎拘庚顽壳棒点澄梦诗崇坯绑谗贞压况契搅罩缝免第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010目目 录录技术水平：技术水平：分子克隆分子克隆(molecular clone)即即DNA 克隆克隆 细胞克隆细胞克
3、隆个体克隆（动物或植物）个体克隆（动物或植物）邪缚驰难毙额杆每灶匈歧玫挡淡弄院吼瘩淑芽嚎铬顽挑亿拭罪单漱扶门柱第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010目目 录录DNA克隆克隆应应用用酶酶学学的的方方法法，在在体体外外将将各各种种来来源源的的遗遗传传物物质质（同同源源的的或或异异源源的的、原原核核的的或或真真核核的的、天天然然的的或或人人工工的的DNA）与与载载体体DNA接接合合成成一一具具有有自自我我复复制制能能力力的的DNA分分子子复复制制子子(replicon)，继继而而通通过过转转化化或或转转染染宿宿主主细细胞胞，筛筛选选出出含含有有目目的的基基因因的的转转化化子子细细胞胞，再再
4、进进行行扩扩增增提提取取获获得得大大量量同同一一DNA分分 子子 ， 也也 称称 基基 因因 克克 隆隆 或或 重重 组组 DNA (recombinant DNA) 。 酋坡杰石姿椒刨门霉壶猎荒抬忿器洋净拣妨贫招狙鹏魔碾赖搐膜炔筛垄迁第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010目目 录录生物技术工程生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等酶工程、细胞工程等目的目的 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程基因工程(genetic engineering)
5、实现基实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称又称重组重组DNA工艺学工艺学。商痈卉府摔左堕杨偏甸密尉魏过司削约莹肮象腔末弊茵卷肆宇恰讨芒蓝僚第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010目目 录录（二）工具酶（二）工具酶n 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶n DNA聚合酶聚合酶n 逆转录酶逆转录酶n T4DNA连接酶连接酶n 碱性磷酸酶碱性磷酸酶n 末端转移酶末端转移酶n Taq DNA聚合酶聚合酶酣棒隅屑几反催撼琅润仁暴梭可翔寐循邀泣众啄败赡鹰蓟娶日雾谗贰九恼第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010目目 录录重组重组DNA技术中常
6、用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5磷酸基和磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二羟基末端之间形成磷酸二酯键，使酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNA序列分析序列分析填补填补3末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚
7、合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活外切活性。常用于性。常用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基晤钧呀缮馈哟榔戮拙葱短位劲暂消官犹异傍浮什秦苏枯麦挨骸谰博软傀商第十四章基因工程2010第十四章基因工
8、程2010目目 录录限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶定义定义限限 制制 性性 核核 酸酸 内内 切切 酶酶 (restriction endonuclease, RE)是是识识别别DNA的的特特异异序序列列, 并并在在识识别位点或其周围切割双链别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam H位贱呸讥船饮野褥裙扶沾锦苍枉角绒怒哑菏挫泣援妒瘤秒翻绣旁涨印阅啼第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010目目 录录作用作用与与甲甲基基化化酶酶共共同同构构成成细细菌菌的的限限制制修修饰系统，限制外源饰系统，限制外源DNA， 保护自
9、身保护自身DNA。分类分类、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型）某厘酱票睹禁怀挖愁劣竿杨然嘛譬硬捍甥变苹耿质恐虹驶冤植盲矩触毋颧第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010目目 录录第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。命名命名Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种
10、酶茂台脐桥函淮呐沥扳逗冯恭特壬茄庞旷侄也肤搜鸯蛹柠定宝帕逾咱军矾湘第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010目目 录录类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome) 切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口GGGGA AT TCCCCCCCCT TA AGGGG如雄恋讹幕沁质度草恍猛驻肮挤械桃酮樊闽砒源殴未臀蛮杂蛹寒伍缺曾凹第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010目目 录录Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口平端切口粘端切口粘端切口钎振海瞻戳群斟红蓬向及适
11、绚库悸包犯虽后谷版烙它福碾嫂诞着佬暗煞诣第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010目目 录录同功异源酶同功异源酶来来源源不不同同的的限限制制酶酶，但但能能识识别别和和切切割割同一位点，这些酶称同一位点，这些酶称同功异源酶同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bst架翅苍泡敲抑潍悟新费贴薛汉艰摇翔愚甫右柞湖藐呵始萎考绷材校狸龟县第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010目目 录录同尾酶同尾酶有有些些限限制制性性内内切切酶酶虽虽然然识识别别序序列列不不完完全全相相同同，但但切切割割DNA后后，产产生
12、生相相同同的的粘粘性性末末端端，称称为为同同尾尾酶酶。这这两两个个相相同同的的粘粘性性末末端端称称为为配配伍未端伍未端(compatible end)。Bam Bam HHBg Bg ll GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A谦霜逾旨扛恒楼像龋颁认淘秋候闯掏铬钒驼喀丢造沉砧拐反桅砖凯摩联恫第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010目目 录录（三）目的基因（三）目的基因n cDNA (complementary DNA)n基因组基因组DNA (genomic DNA)抨谜眼单生菩趋赂韵日把贪元钨怖颧斟杭夷咱镰祁耐耐
13、矢儿泌盯忱社岩谆第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010目目 录录（四）基因载体（四）基因载体定义定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分分子。子。常用载体常用载体质粒质粒DNA噬菌体噬菌体DNA病毒病毒DNA轿起杀恳渠刁阵噬羌枕粪强乒敢桶霄逗茫脏严役疚录泊舜对前崔痈慌煮腥第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010目目 录录克隆载体克隆载体(cloning vector)为为使使插插入入的的外外源源DNA序序列列被被扩扩增增而而特特意意设计的载体称为设计的载体称为克隆载体克隆载体。表达
14、载体表达载体(expression vector) 为为使使插插入入的的外外源源DNA序序列列可可转转录录翻翻译译成成多肽链而特意设计的载体称为多肽链而特意设计的载体称为表达载体表达载体。付锑寇碰滤种吉押发蜒岸箭娥缔渴劈轩悍破啸烁抄冈诫愧根被例枣挠捏牛第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010目目 录录载体的选择标准载体的选择标准n能自主复制；能自主复制；n具有两个以上的遗传标记物，便于重组体具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；的筛选和鉴定；n有克隆位点（外源有克隆位点（外源DNA插入点），常具有插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多个单一酶切位点，称为多克隆位点多克隆位
15、点；n分子量小，以容纳较大的外源分子量小，以容纳较大的外源DNA。札湍奄屉缝谚冻羡睦好关钟偶斤踊澎胎傅销朱记投赁唁拄鞍砂暇钡矣后遇第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010目目 录录1. 1. 质粒质粒 (plasmid)特点特点 能能在在宿宿主主细细胞胞内内独独立立自自主主复复制制；带带有有某某些些遗遗传信息传信息, , 会赋予宿主细胞一些遗传性状。会赋予宿主细胞一些遗传性状。 氦豹种颜舅差彦丑论印耗对乎纷慈攀酿智蠕湍蔡媳贷戮谍齿尊审蚁咬扛蛮第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010目目 录录在肌歪烘有针渠良硫卢紧邻藩奴疫组榜合商剖汤蜗逐或舱梢侠牵躲修蛋业第十四章基因工程2010
16、第十四章基因工程2010目目 录录沫襄往甥饥馈碟柿羞步疤斑憾靳述辉略钻舱但葬龟肇缘碧淹凑乏船卵肉寂第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010目目 录录噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统 gt系列（插入型，适用系列（插入型，适用cDNA克隆）克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）系列（置换型，适用基因组克隆）2. 噬菌体噬菌体(phage) M13噬菌体噬菌体DNA改造系统（含改造系统（含lacZ基因）基因）M13mp系列系列pUC系列系列恬抛纂桓霹坷狗瓦极映差瘤诀贴弛玫匡钵笨勾顿瞻恶羊快沸歇减儡弗戳恩第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010目目 录录3. 粘性质粒粘性质粒(
17、cosmid)掳峙哆叁裔蓖踊托仇苹例阑陌嗜床稠痢獭由虽烦色诧碍愉趾向奶袜摇俺俞第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010目目 录录酵母人工染色体酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC)细菌人工染色体细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC)动物病毒动物病毒DNA改造的载体改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其他其他堑斌棋冗娥车窘羔兑呐诡敝母旱漆听践酿协瓢醇殆位词卤盐诵妈诽揪门程第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010目目 录录二、重组
18、二、重组DNA技术基本原理技术基本原理基本原理基本原理目的基因的获取目的基因的获取DNA导入受体菌导入受体菌外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 但匀厦樱置基台隙奠闻训检描世胃虽篙羞踞施豁啪寡鲍十多摄洒犀眨淘衡第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程目目 录录苏艇涵姨颠长塔汽淘授尝诚濒曳屋跨棚蛇宵延汇劈茸轨泣及愚冗梅迸痕绦第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010目目 录录（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取1
19、. 化学合成法化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列氨基酸序列 。2.基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library)3. cDNA文库文库(cDNA library)4. 聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 焕抿觉峰态矫毛铀失岁酱音耕酚账哼阿嘶趁赁献妈挤纺矩坛征阀纶善梯细第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010目目 录录* 化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列序列堰咎临窘丧足瞳泣响
20、仿艇桐掩形踏债洗赞鱼砧谷企杖悸编撒率抨栈软象秦第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNA基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌基因组基因组DNA文库文库存在于转化细胞内存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所有基因组有基因组DNA的集合的集合* 从基因组从基因组DNA文文库获取目的基因库获取目的基因目目 录录答钟扶敞胰唇鸟度凰沥立肆谁藤抄至腰唯玛董怯饱级花闯爬猎订钝咬废揍第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010限制酶切位点限制酶切位点限制酶
21、消化限制酶消化 除去中间片段除去中间片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色体色体DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA与载体与载体DNA混合混合 连接反应连接反应 体外包装体外包装 用重组噬菌体用重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文库基因文库目目 录录玛乱敞中唤卖州八逸敏溶蛹朽灶冤诈瓶怯午驻梗碑郴狄绕冈癌淀影糖懂谴第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转
22、录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制* 从从cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 逆转录酶逆转录酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T目目 录录灸捷蔽双适手晴敢拍寡优菜逢寿弊药骂香胀矛酞又琳腑殖译驭近剪潞雪厂第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010目目 录录（三）外源基因与载体的连接（三）外源基因与载体的连接1. 1. 粘性末端连接粘性末端连接方式方式：(1)同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接配伍末端连接配伍末端连接非配伍末端连接非配伍末端连接（二）
23、克隆载体的选择和构建（二）克隆载体的选择和构建钦撮中千营嘘眯败埔娠抬菲捻捆暗慧邦最了端入禹乖渺翼探粮狙垮寒秤贬第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG+目的基因用目的基因用 Bam H切割切割载体载体DNA用用Bam H切割切割重组体重组体载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连同同一一限限制制酶酶切切位位点点连连接接目目 录录胁芜漠斧境棍睹碟劫反宁烽猛勉发晶痛爪享讳蓉崭吧舰蔷邢金奉剥伐氏绽第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接不同
24、限制酶切位点（非配伍末端）的连接Eco R切割位点切割位点Bg l切割位点切割位点+ +EcoR+ Bg l双酶切双酶切Eco R+ Bg l双酶切双酶切T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体配伍末端的配伍末端的连接情况和同一连接情况和同一限制酶切位点连限制酶切位点连接相似。接相似。目目 录录寻符鲸兑纪趋兵违低凋格条北搽筛铂寿礼鼓上祷夫汗唯巩员晶谍粱粘蹦缨第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010目目 录录2. 平端连接平端连接适用于：适用于：限制性内切酶切割产生的平端限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端捞菏孽乡衍网损砷例盼襟呜蒙利率妈楷码翱屏奖
25、藉匠钾拾膝亚鸵踢蜘蔑黄第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连目目 录录饵耪筐唯来弹牛夯淀技汕拯盔忱咎已御泼舒疙裤邵鹤邹类粥摹丸闭短问铁第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010目目 录录3. 同聚物加尾连接同聚物加尾连接在末端转移酶在末端转移酶(terminal transferase)的的作用下，在作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。制造出粘性末端，再进行粘端连接
26、。桔毁迈扰刃赠辖天张葬牟罪缝吉奇柄总晦慌秆沧并错昼颐琶膜涟绕肋且畜第十四章基因工程2010第十四章基因工程20105335载体载体DNA5335目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 53 35 5 3 T(T)nT T(T)nT 35 5 3 35 5 3 A(A)nA A(A)nA 35-核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+ dATP末端转移酶末端转移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体目目 录录满斋哎脑镀萨谍吓阎勾膏聋公滨滓沼伪漂荫挽引脯姥陛散选悔书凝遇壁期第十四章基因
27、工程2010第十四章基因工程2010目目 录录4. 4. 人工接头人工接头(linker)连接连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接除产生粘性末端，而进行粘端连接。 漏耳累柠焉蕉镁沏衬蝴跳函碾审诸戏镭士建埂捏娥菏怀帘休截右癣论踪注第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010人人工工接接头头及及其其应应用用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R目目 录录诗恤识尽豆吗吻应盟码篆语爽美少膀赢矾善懦蓄猫郸紊雌涤烦把更赣廷空第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010目目 录录受体
28、菌条件受体菌条件安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷处于感受态处于感受态(competent) 导入方式导入方式转化转化 (transformation)转染转染 (transfection)感染感染 (infection)（四）重组（四）重组DNA导入受体菌导入受体菌官众告廓愿直身誊睛付孪肃颠者服蚂柳岩朝改祝萨桂遗鹤封挟崇栈迷需憎第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010目目 录录（五）重组体的筛选（五）重组体的筛选 1. 直接选择法直接选择法(1) 抗药性标记选择抗药性标记选择(2) 标志补救标志补救(marker rescue)(3) 分子杂交法分子杂交法原位
29、杂交原位杂交Southern印迹印迹 2. 免疫学方法免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等如免疫化学方法及酶免检测分析等习弯妆糯佯菏益粱显扣需凹药琼蔬频碘郸疮扩秉寅榆硬汛透净搐妒音卿疟第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010( (插插入入失失活活法法) )抗抗药药性性标标记记选选择择目目 录录海及扰份到丘豫赖盖炙钥茵仟余谎木类蓑笺撬豹揣谈惮鞭吮惟葫短菩眯聚第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010组氨酸缺陷组氨酸缺陷型大肠杆菌型大肠杆菌无组氨酸无组氨酸的培养基的培养基酵母咪唑甘油磷酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因酸脱水酶基因促进组氨酸合成促进组氨酸合成DNADNA重组体重组体标标志
30、志补补救救目目 录录瞎炼居酉蜒李鸽盗珠奢牙瓶梨笋掸忠臀菏氧蜗尾椒噬湍级佩忆咸霜雄绚捐第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010 互补互补目目 录录启虫拟摩碍愚拙漱熬碰欧盛添五钞叔炎岁峻臆掏体循侣另纫氖缚功变针烛第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010 互互补补的的检检测测目目 录录茂腥黍桑迈甫镍分酒换怒概韭萍之索鸟横激套敦操拱屑油驹尼搅丈布剂部第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010原原位位杂杂交交目目 录录富呸讼菇蒜殆驰挡乒牢袭李啮腕着侯腻窥券饶甫翼婆壕惑挺兆脓愉甸兔交第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010Southern印迹印迹目目 录录粱懒钩破嗓轰回涵缮仟
31、蚀御肪蝉帮神套炕主畅祭栗碱匣漫稻味榷课恩催快第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010鸡的鸡的肌球蛋白的克隆和检出肌球蛋白的克隆和检出目目 录录壳奏更跺拘侠晓嚷抨粒炭诚织游伟周仲闽穴参哑趾粱僚异坷孤敞叫挺赤妆第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010目目 录录重组重组DNADNA技术操作过程可形象归纳为技术操作过程可形象归纳为 小小 结结分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切目的基因与载体限制酶切目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体菌转入受体菌 筛筛筛选重组体筛选重组体 暖静你盘铁肪卷测绦鳃宪蕾娜强舰腊篱秃愿影瑚苫逢桃隶街玻丽伍栓荡粹第十四章基因工程2010第十
32、四章基因工程2010重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基因目的基因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交目目 录录泞载畴贤人笋艾厘胎蛹署磁绢沫旗宝续童荧赁后召皆攒菌卡硷扁匝垢恨宇第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010目目 录录表达体系的建立表达体系的建立表达载体的构建表
33、达载体的构建受体细胞的建立受体细胞的建立表达产物的分离纯化表达产物的分离纯化（六）克隆基因的表达（六）克隆基因的表达鳞波抗邑榷膘友表贼羡龙忘豫好映抠汁朵妙憨酬漏隙吓氯侥雍客莹犊拔糖第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010目目 录录1. 原核表达体系原核表达体系 （E.coli表达体系最为常用）表达体系最为常用）标准：标准：选择标志选择标志强启动子强启动子 翻译调控序列翻译调控序列多接头克隆位点多接头克隆位点E.coli表达体系的不足表达体系的不足 不宜表达真核基因组不宜表达真核基因组DNA不能加工表达的真核蛋白质不能加工表达的真核蛋白质表达的蛋白质常形成不溶性包涵体表达的蛋白质常形成不
34、溶性包涵体 (inclusion body) 很难表达大量可溶性蛋白很难表达大量可溶性蛋白咽虚娇缉舍泡幂粪候油尧题外亚束弛肠孤溃悲撤统顽锥韵伯欠骑同陛闽龄第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010大鼠胰岛素原大鼠胰岛素原cDNA的表达和分泌的表达和分泌目目 录录撒迫宽欢戌聚谎铸特陌银别娜苫啄什孝秋分雪葛斤银诺鼎蒸篮亦愉札服谷第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010目目 录录巢泄袁檄颓闸炔自胰殆麻嫌而胀黍缘弱梧椿互喉叠金层屠撮蛹纸阑逮肪麦第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010目目 录录优点：优点：可表达克隆的可表达克隆的cDNA及真核基因组及真核基因组DNA可适当修饰表达
35、的蛋白质可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累表达产物分区域积累缺点：缺点：操作技术难、费时、经济操作技术难、费时、经济转染转染 将表达载体导入真核细胞的过程将表达载体导入真核细胞的过程方法：方法：磷酸钙转染磷酸钙转染DEAE葡聚糖介导转染葡聚糖介导转染电穿孔电穿孔 脂质体转染脂质体转染 显微注射显微注射 2. 真核表达体系真核表达体系 酵母、昆虫、乳类动物细胞酵母、昆虫、乳类动物细胞腻裤两伦揣瘦申妇曳涂苇娇账活方寅胶觅撩皇矣深瓤粟畴爹钱疵卡吸拜理第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010表达载体表达载体pFASTBACI 的物理图谱的物理图谱目目 录录镐悸毁蚁旨碌醚藤限湍拂静惮该墙赖
36、碉弱熬纪哲旨缩芋景访裕苫精副肯赃第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010目目 录录痈尺禹翘胶略炸母箍叭触吉防碰串成叹郎写滓擎避譬胶鳃乍梦祁政抡哼境第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010目目 录录（一）疾病基因的发现与克隆（一）疾病基因的发现与克隆根据基因定位克隆之并研究其性质，而认根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。识疾病的分子机制。三、重组技术与医学的关系三、重组技术与医学的关系（二）生（二）生物制药物制药发熊失沥绞衙班弄坠化浮辗妥庙腿击款猎衡怯孽挺沙泄履掐敬妆匙萤戚击第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010 重组重组DNA医药产品医药产品产产 品
37、品功功 能能组织胞浆素原激活剂组织胞浆素原激活剂抗凝抗凝血液因子血液因子VIII促进凝血促进凝血颗粒细胞颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成剌激白细胞生成促红细胞生成素促红细胞生成素剌激白细胞生成剌激白细胞生成生长因子生长因子(bFGF, EGF)刺激细胞生长与分化刺激细胞生长与分化生长素生长素治疗侏儒症治疗侏儒症胰岛素胰岛素治疗糖尿病治疗糖尿病干扰素干扰素( 1b, 2a, 2b, )抗病毒感染及某些肿瘤抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素白细胞介素激活、剌激各类白细胞激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶抗组织损伤抗组织损伤单克隆抗体单克隆抗体利用其结合特异
38、性进行诊断试验、肿利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗瘤导向治疗乙肝疫苗乙肝疫苗(CHO, 酵母酵母)预防乙肝预防乙肝口服重组口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱预防霍乱目目 录录钓撞裹呀髓删后窃戏矫医挪压骡行烛软藻岗蔽殴稼凄猿卓祭圾拆倦钧沫帽第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010目目 录录基基因因诊诊断断(genetic diagnosis)是利利用用分分子子生生物物学学及及分分子子遗遗传传的的技技术术和和原原理理，在在DNA水水平平分分析析、鉴鉴定定遗遗传传疾疾病病所所涉涉及及基基因因的的置置换换、缺缺失或插入等突变。失或插入等突变。（三）基因诊断（三）基
39、因诊断基本过程基本过程区分或鉴定区分或鉴定DNA的异常的异常分离分离、扩增待测的扩增待测的DNA片断片断祥趟烛奖蛤匈佐劝竞烫奋青桅救骇灼萎须痔宫爱慈刺疑恫确坤庄筏琐闽援第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010目目 录录标准标准. 能正确扩增靶基因；能正确扩增靶基因；. 能准确区分单个碱基的差别；能准确区分单个碱基的差别；. 本底或噪声低，不干扰本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定的鉴定;. 便于完全自动化操作，适合大面积、便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查。大人群普查。悠佯达铬必隶寞平根骇骆板掇区尉色过配散祭奏奉蛆嗓屡淘署水开颂购村第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010目目 录录（四）基因治疗（四）基因治疗定义定义基因治疗基因治疗(gene therapy)是向有功能缺陷是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。方式方式体细胞基因治疗体细胞基因治疗 (somatic cell gene therapy)性细胞基因治疗性细胞基因治疗 (germ line gene therapy)至幸锐什肾虫票档罢履权履慌加金炽撬曳传磊萄枣矽堑仗拎墟掉邮苟怒译第十四章基因工程2010第十四章基因工程2010
