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1、底物浓度及抑制剂对酶促反应速度的影响底物浓度及抑制剂对酶促反应速度的影响 1.观察底物察底物浓度度对酶促反促反应速度的影响。速度的影响。2.观察抑制察抑制剂对酶促反促反应速度的影响。速度的影响。3.掌握用双倒数作掌握用双倒数作图法法测定碱性磷酸定碱性磷酸酶的的km值。酶动力学实验研究对象酶动力学实验研究对象酶促反应初速度酶促反应初速度影响因素：影响因素：酶动力学实验注意事项酶动力学实验注意事项反应反应pH值值反应温度反应温度反应时间反应时间 酶促反促反应动力学力学:影响影响酶促反促反应速度速度(V)的因素的因素: 研究研究酶促反促反应的速度以及影响此速的速度以及影响此速度的各种因素的科学度的各
2、种因素的科学。1.底物底物浓度度 S 2.酶的的浓度度 3.温度温度4.pH5.酶的激活的激活剂6.酶的的抑制抑制剂（一）底物浓度对酶促反应速度的影响（一）底物浓度对酶促反应速度的影响 当底物当底物浓度度较低低时,V随随S的增大而急的增大而急剧上升上升,两者两者成正比关系成正比关系.随着底物随着底物浓度度继续增加增加,反反应速度增加速度增加,而幅度不断下降而幅度不断下降,若若继续加大加大S反反应速度就不再增速度就不再增加加,达到一个极限达到一个极限值Vmax.VmaxS(V)SS与与V V的关系的关系: :米米- -曼氏方程曼氏方程Vmax - 最大反最大反应速度速度Km - 米氏常数米氏常数
3、当当V V1/2Vmax1/2Vmax时，时，KmKmS S Km值的物理意的物理意义:即即Km值是当是当酶反反应速率达速率达到最大反到最大反应速率一半速率一半时的底物的底物浓度。度。KmKm和和VmaxVmax值的测定值的测定 (1)测定不同底物定不同底物浓度的反度的反应初速率，以初速率，以V-S作作 图可以得到可以得到Vmax，再从，再从1/2Vmax，可求得相，可求得相应的的 S，即，即Km值。 Vmax VmaxSvKm(2) Lineweaver-Burk作图法（双倒数作图法）是用实验方法测定Km值的最常用的比较简单的方法。Lineweaver-Burk将米氏方程改写成双倒数形式：（
4、二）抑制剂对酶促反应速度的影响（二）抑制剂对酶促反应速度的影响酶的抑制的抑制剂：抑制作抑制作用用类型型可逆性可逆性不可逆性不可逆性竞争性抑制争性抑制非非竞争性抑制争性抑制反反竞争性抑制争性抑制 凡能降低凡能降低酶的活性，甚至使的活性，甚至使酶完完 全全丧失活性，但不使底物失活性，但不使底物变性的物性的物质。1.竞争性抑制曲线图竞争性抑制曲线图 竞争性抑制争性抑制剂与与酶的的底物底物结构相似构相似,与底物与底物竞争争酶的活性中心的活性中心,从而阻从而阻碍碍酶与底物的与底物的结合合.特点特点:（1）V下降下降，发生抑制生抑制（2）Vmax不不变（3）Km增大增大，亲和力下降和力下降（三）本次实验方
5、案（三）本次实验方案碱性碱性磷酸苯二磷酸苯二钠 本次本次实验以以为底底物物, 为催化催化剂, 作作为抑制抑制剂，分，分别观察无抑制察无抑制剂和有抑制和有抑制剂时底物底物浓度与度与酶促反促反应速度之速度之间的关系的关系。 磷酸磷酸酶AKP磷酸磷酸氢二二钠O-P=OONaONa磷酸苯二磷酸苯二钠+ H2O AKPOHHO-P=OONaONa+ 酚酚根据根据颜色深浅色深浅测出光密度出光密度值,计算不同底物算不同底物浓度度时A660值（产物的生成量）物的生成量）,以以1/A660-1/S双倒数作双倒数作图，获得得Km值。在碱性溶液中，苯酚还原酚试剂应用液中的磷钼酸在碱性溶液中，苯酚还原酚试剂应用液中的
6、磷钼酸-磷钨酸试剂，生成蓝磷钨酸试剂，生成蓝色物质。蓝色的深浅与苯酚的含量成正比，根据蓝色的深浅，可计算出色物质。蓝色的深浅与苯酚的含量成正比，根据蓝色的深浅，可计算出酚的含量。酚的含量。实验操作操作1.米氏常数测定 按下表操作： 管号试剂（ml） 0 1 2 3 4 50.02mol/L底物 0.2 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8蒸馏水 0.8 0.7 0.6 0.5 0.3 0.1碱性缓冲液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0混匀 37 5AKP 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1混匀 37 15 （每管准确计时）酚试剂 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.
7、010Na2CO3 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0混匀 37 15A660以1/A6601/S作图，求出Km2.抑制剂对酶促反应速度的影响 按下表操作： 管号试剂（ml） 0 1 2 3 4 50.02mol/L底物 0.2 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8蒸馏水 0.8 0.7 0.6 0.5 0.3 0.1含Na2HPO4的碱性缓冲液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0混匀 37 5AKP 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1混匀 37 15 （每管准确计时）酚试剂 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.010Na2CO3 3.0 3.0 3.0
8、3.0 3.0 3.0混匀 37 15A660以1/A6601/S作图，求出表观Km加AKP用100l移液枪加在水浴箱中加准确计时立即混匀 0管不加加酚试剂用1000l移液枪加在水浴箱中加准确计时立即混匀注注 意意 事事 项项1.取取样量准确量准确,保温准确，加保温准确，加样顺序要一致，每步序要一致，每步均混匀。均混匀。2.同一同一组实验用相同的比色用相同的比色计。3.作作图时,实验点不在同一条直点不在同一条直线上上时,尽量使各尽量使各点平均分布在直点平均分布在直线的两的两侧,两两图画在同一坐画在同一坐标纸上上,便于判断。便于判断。1/A 1/S L/mmol -1/Km x/Vm 绘图与数据处理：绘图与数据处理：两条直线必须在纵轴上交于一点。-1/Km 0.02mol/L0.2mlS = = 0.002 mol/L = 2mmol/L 2ml1/S =1/2 L/mmol绘图与数据处理：绘图与数据处理：第一管的底物浓度计算
