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1、 临 床 细 菌 检 验 常用的几种试验菏泽市立医院 常做的实验方法常做的实验方法革兰氏染色法拉丝试验抗酸染色法氧化酶试验触酶试验凝固酶试验奥普妥辛实验卫星实验CAMP杆菌肽敏感实验硝酸盐还原试验DNA酶试验生化反应血清学分型(志贺,沙门，霍乱、链球菌)革革 兰兰 氏氏 染染 色色快速染色法：1、初染：结晶紫染色10秒，水洗，甩干；2、媒染：革兰氏碘液染色10秒，水洗，甩干；3、脱色：95%酒精脱色1020秒，水洗，甩干；4、复染：沙黄或复红染色10秒，水洗，干后镜检。5、结果判定：G +呈紫色，G-菌呈红色G+菌 G-菌氢氧化钾拉丝试验 n n“ “氢氧化钾拉丝试验氢氧化钾拉丝试验” ”快速
2、鉴定革兰氏阳性菌快速鉴定革兰氏阳性菌1 1、原理：由于革兰阴性细菌的细胞壁肽聚糖层数少于稀、原理：由于革兰阴性细菌的细胞壁肽聚糖层数少于稀碱溶液内易于破裂，而释放出未断裂的碱溶液内易于破裂，而释放出未断裂的DNADNA螺旋，使螺旋，使KOHKOH菌悬液呈现粘性，可有搅拌后拉出丝来，而革兰阳性菌悬液呈现粘性，可有搅拌后拉出丝来，而革兰阳性菌在稀碱溶液中仍保持不变。菌在稀碱溶液中仍保持不变。2 2、试剂：、试剂：4%KOH4%KOH水溶液。应新鲜配制。水溶液。应新鲜配制。3 3、方法：取、方法：取1 1滴滴4%KOH4%KOH水溶液于洁净玻片上，用接种环水溶液于洁净玻片上，用接种环于固体培养基上取
3、新鲜配制菌落少许，于于固体培养基上取新鲜配制菌落少许，于KOHKOH溶液中搅拌溶液中搅拌混匀，并每隔几秒钟上提接种环，观察能否拉出丝来。混匀，并每隔几秒钟上提接种环，观察能否拉出丝来。4 4、结果：能用接种环拉出丝来为阳性，仍为混悬液则为、结果：能用接种环拉出丝来为阳性，仍为混悬液则为阴性。大多数革兰阴性菌于阴性。大多数革兰阴性菌于5 5到到1010秒内出现阳性，有的需秒内出现阳性，有的需3030到到4545秒。革兰阳性菌于秒。革兰阳性菌于6060秒以后仍阴性。秒以后仍阴性。抗抗 酸酸 染染 色色1、初染：石炭酸复红加热染色3-5分钟，水 洗，甩干；2、脱色：3%盐酸酒精脱色3060秒，水 洗
4、，甩干；3、复染：碱性美兰60秒，水洗，干后镜检。4、结果判定：抗酸菌呈红色 ，非抗酸菌呈兰色5、意义：用于鉴别抗酸菌与非抗酸菌 抗酸抗酸染色染色-抗酸菌抗酸菌氧化酶试验氧化酶试验n n原理：具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素原理：具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C C氧氧化，再由氧化型细胞色素化，再由氧化型细胞色素C C使对苯二胺氧化，生使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物。成有色的醌类化合物。n n方法：取一洁净的滤纸一小块，涂抹菌苔少许，方法：取一洁净的滤纸一小块，涂抹菌苔少许，加一滴氧化酶试剂（对苯二胺溶液）于菌上，观加一滴氧化酶试剂（对苯二胺溶液）于菌上，观察颜色变化。察颜色变化。n
5、n判断：立即呈粉红色并迅速转变为紫红色为阳性，判断：立即呈粉红色并迅速转变为紫红色为阳性，不变色为阴性。不变色为阴性。n n意义：肠杆菌科细菌与气单胞、假单胞菌的鉴别意义：肠杆菌科细菌与气单胞、假单胞菌的鉴别触酶试验n n1.1.原理：具有触酶（过氧化氢酶）的细菌，能催原理：具有触酶（过氧化氢酶）的细菌，能催化过氧化氢，放出新生态氧，继而形成分子氧，化过氧化氢，放出新生态氧，继而形成分子氧，出现气泡。出现气泡。n n2.2.方法：用接种环挑取固体培养基上的菌落置于方法：用接种环挑取固体培养基上的菌落置于洁净的玻片上，然后滴加洁净的玻片上，然后滴加3%3%过氧化氢溶液一滴，过氧化氢溶液一滴，观察
6、结果。观察结果。n n3.3.结果判断：在结果判断：在5 5秒内释放大量的气泡为阳性。秒内释放大量的气泡为阳性。n n4.4.意义：大多数球菌触酶试验阳性，但链球菌为意义：大多数球菌触酶试验阳性，但链球菌为阴性，主要用于鉴别葡萄球菌与链球菌。阴性，主要用于鉴别葡萄球菌与链球菌。血浆凝固酶试验n n1.1.原理：金黄色葡萄球菌可产生两种凝固酶。一种是结合原理：金黄色葡萄球菌可产生两种凝固酶。一种是结合凝固酶，结合在细胞壁上，使血浆中纤维蛋白原变成纤维凝固酶，结合在细胞壁上，使血浆中纤维蛋白原变成纤维蛋白附着于细菌表面上，发生凝集，用玻片法测出。另一蛋白附着于细菌表面上，发生凝集，用玻片法测出。另
7、一种是菌体生成后释放与培养基中的游离凝固酶，能使凝固种是菌体生成后释放与培养基中的游离凝固酶，能使凝固酶原变成凝血酶类物质，从而使血浆凝固，可用试管法测酶原变成凝血酶类物质，从而使血浆凝固，可用试管法测出。出。n n2.2.方法：方法： （1 1）玻片法：取血浆和生理盐水各一滴分别滴到清）玻片法：取血浆和生理盐水各一滴分别滴到清洁玻片上，挑去待检菌落分别与血浆及盐水混合，如血浆洁玻片上，挑去待检菌落分别与血浆及盐水混合，如血浆中出现明显凝集颗粒而盐水中无自凝现象者为阳性。中出现明显凝集颗粒而盐水中无自凝现象者为阳性。 （2 2）试管法：取试管两支，分别加入）试管法：取试管两支，分别加入0.5m
8、l0.5ml的血浆的血浆（经生理盐水（经生理盐水1 1：4 4稀释）挑去菌落数个加入测定管充分研稀释）挑去菌落数个加入测定管充分研磨混匀，用一只阳性菌株加入对照管，磨混匀，用一只阳性菌株加入对照管，37373-43-4小时。血小时。血浆凝固者为阳性。浆凝固者为阳性。奥普妥辛实验奥普妥辛实验（OP试验）试验）n n1.1.原理：肺炎链球菌对原理：肺炎链球菌对OptochinOptochin（乙基氢化去甲（乙基氢化去甲奎宁）十分敏感，作用机理是干扰肺炎链球菌叶奎宁）十分敏感，作用机理是干扰肺炎链球菌叶酸的合成，可抑制其生长，其他链球菌如草绿色酸的合成，可抑制其生长，其他链球菌如草绿色链球菌对其不敏
9、感。借此可对肺炎链球菌与草绿链球菌对其不敏感。借此可对肺炎链球菌与草绿色链球菌加以鉴别。色链球菌加以鉴别。n n2.2.方法：将待检的方法：将待检的a a溶血的链球菌均匀的涂布于血溶血的链球菌均匀的涂布于血平板上，贴放平板上，贴放OptochinOptochin纸片（含药纸片（含药5mg)355mg)35孵孵育育18-2418-24小时，观察抑菌圈的大小。小时，观察抑菌圈的大小。n n3.3.结果判断：抑菌圈结果判断：抑菌圈14mm14mm为肺炎链球菌，无为肺炎链球菌，无或见很窄的抑菌圈为草绿色链球菌。或见很窄的抑菌圈为草绿色链球菌。卫星试验n n1.1.原理：流感嗜血杆菌生长时需要原理：流感
10、嗜血杆菌生长时需要X X、V V两种因子，在血两种因子，在血平板上形成极小、圆形透明的菌落，若与金葡菌同时培养，平板上形成极小、圆形透明的菌落，若与金葡菌同时培养，由于金葡菌产生由于金葡菌产生V V因子，促进流感嗜血杆菌的生长，在金因子，促进流感嗜血杆菌的生长，在金葡菌周围的细菌菌落较大，形成卫星生长现象。在普通培葡菌周围的细菌菌落较大，形成卫星生长现象。在普通培养基上不生长。养基上不生长。n n2.2.方法：用取菌环挑去可疑菌落分别接种在血平板、方法：用取菌环挑去可疑菌落分别接种在血平板、MHMH平板上，再用取菌针挑取金葡菌与原划线垂直划一直线接平板上，再用取菌针挑取金葡菌与原划线垂直划一直
11、线接种在平板上。种在平板上。35352424小时观察结果。小时观察结果。n n3.3.结果判断：金葡菌周围的细菌菌落较大，卫星试验阳性结果判断：金葡菌周围的细菌菌落较大，卫星试验阳性n n4.4.意义：仅血平板上出现卫星现象意义：仅血平板上出现卫星现象-流感嗜血杆菌；流感嗜血杆菌； 血平板与血平板与MHMH均呈卫星现象均呈卫星现象-副流感嗜血杆菌。副流感嗜血杆菌。借此用于鉴别流感与副流感嗜血杆菌。借此用于鉴别流感与副流感嗜血杆菌。CAMP试验n n1.1.原理：原理：B B群链球菌在血平板上能产生群链球菌在血平板上能产生CAMPCAMP因子，因子，可促使金黄色葡萄球菌可促使金黄色葡萄球菌 溶血
12、素的活性，故在血溶血素的活性，故在血平板上两种细菌交界处溶血能力增强，形成箭头平板上两种细菌交界处溶血能力增强，形成箭头状透明状溶血区。其他链球菌一般不产生状透明状溶血区。其他链球菌一般不产生CAMPCAMP因子，故此试验可作为因子，故此试验可作为B B群链球菌的鉴定指标之群链球菌的鉴定指标之一。一。n n2.2.方法：在血平板上，用金黄色葡萄球菌划一条方法：在血平板上，用金黄色葡萄球菌划一条横线，再于该直线相距横线，再于该直线相距5mm5mm左右用被检菌接种一左右用被检菌接种一或两条垂直短线，或两条垂直短线，35352424小时观察结果。小时观察结果。n n3.3.结果观察：在被检菌接种线与
13、金葡菌接种线之结果观察：在被检菌接种线与金葡菌接种线之间有一个箭头形或半月形透明溶血区为阳性，可间有一个箭头形或半月形透明溶血区为阳性，可推断为推断为B B群链球菌。无溶血区为阴性。群链球菌。无溶血区为阴性。杆菌肽敏感试验n n1.原理：A群链球菌对杆菌肽非常敏感，而其他链球菌对杆菌肽通常耐药，故此试验可鉴别链球菌。n n2.方法：将被检链球菌，密涂于血平板上，将杆菌肽纸片贴于血平板表面，3524小时观察结果。n n3.在杆菌肽周围出现明显抑菌环 10mm为阳性，则被推断为A群链球菌,10mm 为阴性，为其他群的链球菌。硝酸盐还原试验n n1.1.原理：某些细菌能还原培养基中的硝酸盐生成亚硝酸
14、盐、原理：某些细菌能还原培养基中的硝酸盐生成亚硝酸盐、氨和氮等。亚硝酸盐与醋酸作用生成亚硝酸，亚硝酸再与氨和氮等。亚硝酸盐与醋酸作用生成亚硝酸，亚硝酸再与对氨基苯磺酸作用形成重氮苯磺酸，它可与对氨基苯磺酸作用形成重氮苯磺酸，它可与a-a-萘胺结合成萘胺结合成红色的红色的N-a-N-a-奈氨苯磺酸。奈氨苯磺酸。n n2.2.方法：将待检菌接种硝酸盐培养基中，方法：将待检菌接种硝酸盐培养基中，35352424小时，小时，加入硝酸盐还原试剂甲液（对氨基苯磺酸和醋酸）和乙液加入硝酸盐还原试剂甲液（对氨基苯磺酸和醋酸）和乙液（ a-a-萘胺和醋酸）各一滴后观察结果。萘胺和醋酸）各一滴后观察结果。n n3
15、.3.判断结果：呈现红色为阳性。若不出现红色，则加入少判断结果：呈现红色为阳性。若不出现红色，则加入少许锌粉，仍不出现红色者为阳性，出现红色为阴性。许锌粉，仍不出现红色者为阳性，出现红色为阴性。n n4.4.意义：肠杆菌科细菌，硝酸盐还原试验阳性意义：肠杆菌科细菌，硝酸盐还原试验阳性DNA 酶试验n n1.1.原理：某些细菌可产生原理：某些细菌可产生DNA DNA 酶。酶。 DNA DNA 酶能将酶能将DNA DNA 长链水解成有几个单核苷酸组成的寡核苷酸长链水解成有几个单核苷酸组成的寡核苷酸链。水解形成的寡核苷酸可溶于酸，在链。水解形成的寡核苷酸可溶于酸，在DNADNA平板平板上加入酸后，可在菌落周围形成透明环。上加入酸后，可在菌落周围形成透明环。n n2.2.将待检菌点种于将待检菌点种于DNADNA琼脂平板上，琼脂平板上，35352424小小时，用时，用1mol/L1mol/L盐酸滴加在细菌生长的平板表面，盐酸滴加在细菌生长的平板表面，观察结果。观察结果。n n3.3.结果观察：菌落周围出现透明环为阳性，无透结果观察：菌落周围出现透明环为阳性，无透明环为阴性。此试验用于奈瑟菌与卡他布兰汉菌明环为阴性。此试验用于奈瑟菌与卡他布兰汉菌的鉴别。卡他布兰汉菌为阳性，奈瑟菌为阴性。的鉴别。卡他布兰汉菌为阳性，奈瑟菌为阴性。
