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1、专题二专题二 核酸电泳技术核酸电泳技术专题三核酸电泳技术l琼琼脂脂糖糖或或聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳是是分分子子克克隆隆的的核核心心技技术术之之一一，它它用用于于分分离离、鉴鉴定定和和纯纯化化DNA片片段段。该该技技术术操操作作简简单单而而迅迅速速，并并且且能能分分离离用用其其他他方方法法如如密密度度梯梯度度离离心心等等不不能能满满意意分分离离的的DNA片片段段。此此外外，凝凝胶胶中中DNA的的位位置置可可以以用用低低浓浓度度荧荧光光插插入入染染料料如如溴溴化化乙乙锭锭或或SYBRGold染染色色直直接接观观察察到到，甚甚至至含含量量少少至至20pg的的双双链链DNA在在紫紫外外线线
2、激激发发下下也也能能直直接接检检测测到到。需需要要的的话话，这这些些分分离离的的DNA条条带带可可以从凝胶中回收，用于各种各样的目的。以从凝胶中回收，用于各种各样的目的。专题三核酸电泳技术l琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶的的分分离离范范围围很很大大。 50bp到到百百万万bp长长的的DNA都都可可以以在在不不同同浓浓度度和和构构型型的的琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶中中分分离离。小小片片段段DNA(5020 000bp)最最适适合合在在恒恒定定强强度度和和方方向向的的电电场场中中水水平平方方位位的的琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶内内电电泳泳分分离离。在在这这些些条条件件下下，DNA泳泳动动速速率率通通常常随随DNA片片段段
3、长长度度的的增增加加而而减减少少，但但与与电电场场强强度度成成正正比比。然然而而这这一一简简明明的的相相关关性性当当DNA片片段段长长度度超超过过一一个个最最大大极极限限值值时时立立即即被被破破坏坏，这这种种情情况况主主要要是是由由于于凝凝胶胶的的构构成成和和电电场场强强度度决决定定的的。当当线线状状双双螺螺旋旋DNA的的半半径径超超过过凝凝胶胶的的孔孔径径时时就就达达到到它它分分辨辨率率的的极极限限。此此时时，DNA不不再再被被凝凝胶胶按按其其大大小小筛筛分分，而而必必须须以以一一端端在在前前的的方方式式在在介介质质中中迁迁移移，就就像像通通过过曲曲折折而而又又空空间间有有限限的的管管子子。
4、这种迁移模式称作这种迁移模式称作“蠕行蠕行” 。专题三核酸电泳技术l聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶最最适适合合分分离离小小片片段段DNA(5500bp)。它它的的分分辨辨率率非非常常强强，长长度度上上相相差差1bp或或质质量量上上相相差差0.1的的DNA都都可可以以彼彼此此分分离离。虽虽然然它它能能很很快快地地进进行行电电泳泳，并并能能容容纳纳较较大大的的DNA上上样样量量，但但是是与与琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶相相比比在在制制备备和和操操作作上上还还是是更更繁繁琐琐些些。聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳是是在恒定电场中垂直方位上进行的。在恒定电场中垂直方位上进行的。专题三核酸电泳技术决定决定DN
5、A在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素vDNA分分子子的的大大小小 双双链链DNA分分子子在在凝凝胶胶基基质质迁迁移移的的速速率率与与其其碱碱基基对对数数的的常常用用对对数数成成反反比比。分分子子越越大大，迁迁移移得得越越慢慢，因因为为摩摩擦擦阻阻力力越越大大，也也因因为为大大分分子子通通过过凝胶孔径的效率低于较小的分子。凝胶孔径的效率低于较小的分子。v琼脂糖浓度琼脂糖浓度 给定大小的线状给定大小的线状DNA片段在不同浓片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中迁移速率不同。在度的琼脂糖凝胶中迁移速率不同。在DNA电泳迁移率电泳迁移率的对数和凝胶浓度之间存在线状相关。的对数和凝胶浓度之间
6、存在线状相关。 专题三核酸电泳技术vDNA的的构构象象 超超螺螺旋旋环环状状(I型型)、切切口口环环状状(型型)和和线线状状(型型)DNA在在琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶中中以以不不同同速速率率迁迁移移。上上述述三三种种类类型型的的相相对对迁迁移移率率主主要要取取决决于于琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶的的浓浓度度和和类类型型，但但是是电电流流强强度度、缓缓冲冲液液离离子子强强度度和和I型型超超螺螺旋旋绞绞紧紧的的程程度度或或密密度度也也影影响响相相对对迁迁移移率率。在在一一些些条条件件下下，I型型DNA比比型型迁迁移移得得更更快快；在在另另一一些些条条件件下下，顺顺序序可可能能颠颠倒倒。绝绝大大多多数数情情况况
7、下下，区区分分不不同同构构象象DNA的的需需求求都都很很简简单单，主主要要是是区区分分未未处处理理的的环环状状DNA样样品品和和单单一一位位点点经经限限制制酶酶作作用用线线状状化化的的同同一一DNA样样品。品。v凝凝胶胶和和电电泳泳缓缓冲冲液液中中的的溴溴化化乙乙锭锭 溴溴化化乙乙锭锭插插入入双双链链DNA造造成成其其负负电电荷荷减减少少、刚刚性性和和长长度度增增加加。因因此此线线状状DNA-染料复合物在凝胶中的迁移率约降低染料复合物在凝胶中的迁移率约降低15。专题三核酸电泳技术v所所用用的的电电压压 低低电电压压下下DNA片片段段迁迁移移率率与与所所用用的的电电压压成成正正比比。电电场场强强
8、度度升升高高时时，高高分分子子质质量量片片段段的的迁迁移移率率遂遂不不成成比比例例的的增增加加。所所以以，当当电电压压增增大大时时琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶分分离离的的有有效效范范围围反反而而减减小小。要要获获得得大大于于2kbDNA片片段的良好分辨率，则所用电压不应高于段的良好分辨率，则所用电压不应高于58Vcm。v电电泳泳缓缓冲冲液液 DNA的的泳泳动动受受电电泳泳缓缓冲冲液液的的组组成成和和离离子子强强度度的的影影响响。缺缺乏乏离离子子 (如如用用水水替替代代电电泳泳槽槽及及凝凝胶胶中中的的缓缓冲冲液液)则则电电导导率率降降至至很很低低，DNA不不是是全全然然不不动动，就就是是迁迁移移极极慢慢
9、。高高离离子子强强度度时时，如如错错用用了了10电电泳泳缓缓冲冲液液，电电导导率率升升高高，即即使使应应用用适适中中的的电电压压也也会会产产生生大大量量的的热热能。最严重时凝胶会熔化，能。最严重时凝胶会熔化，DNA会变性。会变性。专题三核酸电泳技术琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳材料材料q水平电泳槽及制胶模具水平电泳槽及制胶模具q琼脂糖琼脂糖q电泳缓冲液电泳缓冲液 q6凝胶载样缓冲液凝胶载样缓冲液 qDNA样品样品qDNA大小标准品大小标准品q溴化乙锭溴化乙锭 / SYBRGold q紫外透射仪紫外透射仪专题三核酸电泳技术琼脂糖琼脂糖l标标准准(高高熔熔点点)琼琼脂脂糖糖 制制造造它它的的原原料料
10、是是两两种种海海藻藻，Gelidium和和Gracilaria。这这两两种种琼琼脂脂糖糖的的凝凝点点和和熔熔点点有有所所不不同同，但但是是在在实实际际应应用用中中每每种种来来源源的的琼琼脂脂糖糖都都可可以以用用于于分分析析或或分分离离1-25kb范范围围的的DNA片片段段。新新类类型型的的标标准准琼琼脂脂糖糖具具有有高高凝凝胶胶强强度度和和低低电电内内渗渗(EEO)，可可以以灌灌制制浓浓度度低低至至0.3的的凝凝胶胶。这这种种凝凝胶胶用用于于电电泳泳能能方方便便地地分分离离高高分分子子质质量量DNA(直直到到60kb)。它它在在任任何何浓浓度度下下DNA迁迁移移速速度度均均比比通通用用的的标标
11、准准琼琼脂脂糖糖快快10-20。这这一一增加在百万碱基大小增加在百万碱基大小DNA的的PFGE中将明显地节省时间。中将明显地节省时间。l低低熔熔点点凝凝点点琼琼脂脂糖糖 通通过过羟羟乙乙基基化化修修饰饰的的琼琼脂脂糖糖在在较较低低的的温温度度熔熔化化，羟羟乙乙基基化化替替代代的的程程度度决决定定准准确确的的熔熔化化和和凝凝结结温温度度。低低熔熔点点凝凝点点琼琼脂脂糖糖主主要要用用于于DNA的的快快速速回回收收，因因为为大大多多数数该该类类型型琼琼脂脂糖糖在在65熔熔化化，这这个个温温度度远远低低于于双双链链DNA的的解解链链温温度度。这这种种特特性性使使它它还还可可以以用用于于DNA的的简简单
12、单纯纯化化和和酶酶处处理理；在在熔熔化化的的凝凝胶胶中中用用核核酸酸直直接接进进行行细细菌菌转转化化。化化学学修修饰饰的的琼琼脂脂糖糖比比等等浓浓度度的的标标准准琼琼脂脂糖糖有有更更高高的的筛筛分分能能力力。该该发发现现使使琼琼脂脂糖糖的的分分辨辨力力接接近近聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶，因因此此可可用用于于PCR产产物物、小小片片段段DNA和和小小RNA(lkb)的的分分离离。现现在在它它能能分分辨辨少少至至4bp的的DNA和和分分离离200-800bp范范围围内相差内相差2的的DNA片段。片段。专题三核酸电泳技术专题三核酸电泳技术电泳缓冲液电泳缓冲液电泳缓冲液电泳缓冲液专题三核酸电泳技术凝
13、胶载样缓冲液凝胶载样缓冲液 专题三核酸电泳技术载样缓冲液有三个作用载样缓冲液有三个作用：增加样品密度以保证增加样品密度以保证DNA沉入加样孔内；沉入加样孔内；使样品带有颜色便于简化上样过程；使样品带有颜色便于简化上样过程；其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。溴酚蓝在琼脂糖凝胶中迁移速率是二甲苯氰溴酚蓝在琼脂糖凝胶中迁移速率是二甲苯氰FF的的2.2倍，这倍，这一特性与琼脂糖浓度无关。在一特性与琼脂糖浓度无关。在0.5TBE琼脂糖凝胶电泳中溴琼脂糖凝胶电泳中溴酚蓝迁移速率约与长酚蓝迁移速率约与长300bp的线状双链的线状双链DNA相同
14、，而二甲苯相同，而二甲苯氰氰FF约与长约与长4000bp的的DNA相同。上述关系在浓度范围相同。上述关系在浓度范围0.51.4的琼脂糖凝胶中基本不受浓度变化的影响。用哪种载的琼脂糖凝胶中基本不受浓度变化的影响。用哪种载样缓冲液是个人的习惯。样缓冲液是个人的习惯。 专题三核酸电泳技术DNA大小标准品大小标准品l通通常常使使用用已已知知分分子子质质量量的的DNA样样品品，它它们们是是经经限限制制性性酶酶消消化化已已知知序序列列的的质质粒粒或或噬噬菌菌体体DNA获获得得的的。琼琼脂脂糖糖和和聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳用用的的分分子子质质量量标标准准可可以以从从市市场场购购得得，或或者者实实
15、验验室室自自己己制制备备。一一般般最最好好有有两两套套分分子子质质量量范范围围的的标标准准，一一个个是是1kb到到大大于于20kb的的高高分分子子质质量量标标准准，一一个个是是100-1000bp的的低低分分子子质质量量标标准准。分分子子质质量量标标准准贮贮备备液液用用凝凝胶胶载载样样缓缓冲冲液液稀稀释释后用于每次电泳实验。后用于每次电泳实验。专题三核酸电泳技术溴化乙锭溴化乙锭l溴溴化化乙乙锭锭首首先先于于20世世纪纪50年年代代合合成成成成功功，主主要要是是作作为为一一种种有有效效的的杀杀锥锥虫虫制制剂剂而而发发展展起起来来的的菲菲啶啶化化合合物物。溴溴化化乙乙锭锭在在筛筛选选过过程程中中脱
16、脱颖颖而而出出。它它的的杀杀锥锥虫虫效效能能是是其其母母化化合合物物的的1050倍倍，并并对对小小鼠鼠无无毒毒，且且与与早早期期的的菲菲啶啶化化合合物物不不同同，对对牛牛不不具具有有光光致致敏敏作作用用。直直到到最最近近，溴溴化化乙乙锭锭在在热热带带及及亚亚热热带带国国家家仍仍被被广广泛泛应应用于牛锥虫病的治疗和预防。用于牛锥虫病的治疗和预防。专题三核酸电泳技术溴化乙锭与核酸结合溴化乙锭与核酸结合溴溴化化乙乙锭锭包包含含一一个个平平面面的的三三环环菲菲啶啶环环，它它能能插插入入到到双双链链DNA堆堆叠叠的的碱碱基基对对之之间间。当当它它插插入入到到螺螺旋旋结结构构中中，将将保保持持与与螺螺旋旋
17、结结构构纵纵轴轴垂垂直直的的位位置置，并并在在其其上上下下方方与与碱碱基基对对形形成成范范德德华华接接触触。尽尽管管其其平平面面三三环环结结构构被被包包埋埋，其其外外围围苯苯基基及及乙乙基基基基团团却却伸伸出出插插入入到到DNA双双螺螺旋旋结结构构的的大大沟沟中中。在在高高离离子子强强度度的的溶溶液液中中，大大约约每每2.5个个碱碱基基对对中中插插入入一一个个分分子子的的溴溴化化乙乙锭锭，且且与与DNA的的碱碱基基组组成成无无关关。除除沿沿螺螺旋旋纵纵轴轴方方向向发发生生3.4A的的位位置置偏偏移移外外，碱碱基基对对的的几几何何结结构构和和位位置置相相对对于于螺螺旋旋结结构构并并未未发发生生改
18、改变变。这这使使得得与与溴溴化化乙乙锭锭结结合合达达到到饱饱和和的的双双链链DNA的的长长度度增增加加了了27。溴溴化化乙乙锭锭也也同同样样可可以以通通过过不不同同的的化化学学作作用用方方式式与与RNA以以及及热热变性或单链变性或单链DNA链内碱基对所形成的螺旋结构区相结合。链内碱基对所形成的螺旋结构区相结合。专题三核酸电泳技术溴溴化化乙乙锭锭平平面面基基团团的的固固定定位位置置以以及及它它与与碱碱基基的的高高度度临临近近使使被被结结合合的的染染料料所所产产生生的的荧荧光光与与在在自自由由溶溶液液状状态态的的染染料料相相比比增增强强2025倍倍。254 nm的的紫紫外外线线首首先先被被DNA吸
19、吸收收，然然后后被被传传送送到到染染料料；而而302nm以以及及366 nm的的射射线线直直接接被被染染料料自自行行吸吸收收。这这些些被被吸吸收收的的能能量量将将在在590nm的的橙橙红红色色可见光谱区以可见光谱区以0.3的量子产额被重新释放出来。的量子产额被重新释放出来。大大部部分分商商品品化化的的紫紫外外线线光光源源产产生生302 nm的的紫紫外外线线。溴溴化化乙乙锭锭-DNA复复合合物物在在受受到到紫紫外外线线照照射射激激发发所所产产生生的的荧荧光光，在在302nm的的紫紫外外线线下下明明显显要要比比366nm的的要要强强，但但要要比比短短波波紫紫外外线线(254nm)的的稍稍弱弱。然然
20、而而，302 nm紫紫外外线线所所造造成成染染料料的的光光褪褪色色效效应应以以及及造造成成DNA的的断断裂裂和和缺缺口口明明显显要要较较254nm紫外线少得多。紫外线少得多。专题三核酸电泳技术凝胶中凝胶中DNA的染色的染色溴溴化化乙乙锭锭被被广广泛泛地地用用于于琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶中中DNA片片段段的的定定位位，通通常常将将它它以以0.5g/ml的的浓浓度度被被加加入入到到胶胶中中以以及及电电泳泳缓缓冲冲液液中中。尽尽管管加加入入溴溴化化乙乙锭锭会会导导致致线线性性双双链链DNA的的电电泳泳迁迁移移率率减减慢慢15，但但却却可可在在紫紫外外灯灯下下直直接接检检查查凝凝胶胶。由由于于溴溴化化乙乙
21、锭锭-DNA复复合合物物的的荧荧光光强强度度要要比比未未结结合合的的染染料料强强很很多多，少少量量的的DNA(10 ng条条带带)也也能能从从存存在在游游离离状状态态溴溴化化乙乙锭锭的凝胶中被检测出来。的凝胶中被检测出来。当当需需要要知知道道DNA片片段段的的准准确确大大小小(如如DNA限限制制酶酶酶酶切切图图谱谱的的鉴鉴定定)，凝凝胶胶应应该该在在无无EB情情况况下下电电泳泳，电电泳泳结结束束后后用用EB染染色色。染染色色时时，将将凝凝胶胶浸浸入入含含有有EB(0.5g/ml)的的电电泳泳缓缓冲冲液液中中，室室温温下下染染色色3045 min。染染色色完完毕毕后后，通通常常不不需需要要脱脱色
22、色。但但是是在在检检测测小小量量DNA(10 ng)片片段段时时，通通常常要要将将染染色色后后的的凝凝胶胶浸浸入入水水中中或或1mmol/L MgSO4中中，室室温温脱脱色色20min更易观察到。更易观察到。专题三核酸电泳技术双链双链DNA的定量分析的定量分析l一一种种快快捷捷和和灵灵敏敏的的方方法法是是应应用用溴溴化化乙乙锭锭分分子子的的插插入入可可通通过过紫紫外外线线照照射射产产生生荧荧光光。由由于于荧荧光光的的亮亮度度与与DNA的的含含量量成成相相关关，DNA的的含含量量可可通通过过样样品品在在590 nm处的光量度与一系列标准品的对照来估算。处的光量度与一系列标准品的对照来估算。专题三
23、核酸电泳技术凝胶凝胶SYBRGold染色法染色法 SYBRGold是是由由MolecularProbes公公司司开开发发的的一一种种新新型型的的极极敏敏感感的的染染料料的的商商品品名名称称。其其与与DNA结结合合的的亲亲和和力力高高，并并且且结结合合后后，能能够够极极大大的的增增强强荧荧光光信信号号。SYBRGold-DNA复复合合物物产产生生光光子子的的量量比比EB-DNA复复合合物物要要大大的的多多，同同时时其其激激发发的的荧荧光光信信号号强强度度是是EB-DNA复复合合物物的的1000多多倍倍。因因此此用用SYBRGold染染色色可可以以检检测测出出琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶中中小小于于20p
24、g的的双双链链DNA(是是EB染染色色最最低低检检测测量量的的1/25)。此此外外，利利用用SYBRGold染染色色可可以以检检测测出出广广个个条条带带少少至至100pg的的单单链链DNA或或300pg的的RNA。SYBRGold染染料料的的最最大大激激发发波波长长为为495nm。同同时时在在300nm有有第第二个激发峰。其发射的荧光波长为二个激发峰。其发射的荧光波长为537nm。 DNA片片段段经经过过凝凝胶胶电电泳泳分分离离后后，用用SYBRGold贮贮存存液液的的稀稀释释液液(1：10 000)浸浸染染凝凝胶胶。不不能能将将SYBR Gold加加入入熔熔化化的的凝凝胶胶中中或或电电泳泳前
25、前加加入入凝凝胶胶，这这是是由由于于在在SYBRGold存在的情况下，凝胶中核酸的电泳条带会产生严重变形。存在的情况下，凝胶中核酸的电泳条带会产生严重变形。当当用用SYBRGold染染色色的的凝凝胶胶在在波波长长为为300nm的的紫紫外外照照射射下下具具有有最最高高的的灵灵敏敏度度。由由于于SYBR Gold对对荧荧光光敏敏感感，所所以以其其工工作作液液(1：10 000稀稀释释的的贮贮存存液液)应应该该当当天用电泳缓冲液新鲜配制，室温存放。天用电泳缓冲液新鲜配制，室温存放。专题三核酸电泳技术琼脂糖凝胶电泳的程序琼脂糖凝胶电泳的程序准备好制胶用的模具，置于水平支架或台面上。准备好制胶用的模具，
26、置于水平支架或台面上。配配制制足足量量的的电电泳泳缓缓冲冲液液(1TAE或或0.5TBE)用用以以灌灌满满电电泳泳槽和配制凝胶槽和配制凝胶 配胶和灌满电泳槽使用同一批缓冲液很重要。因为离子强度或pH很小的差别也会在凝胶前部产生紊乱，严重影响DNA片段的泳动。根根据据欲欲分分离离DNA片片段段大大小小用用电电泳泳缓缓冲冲液液配配制制适适宜宜浓浓度度琼琼脂脂糖糖溶溶液液：应应准准确确称称量量琼琼脂脂糖糖干干粉粉加加到到盛盛有有定定好好量量的的电电泳缓冲液的三角烧瓶或玻璃瓶中。泳缓冲液的三角烧瓶或玻璃瓶中。专题三核酸电泳技术在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。 警
27、惕：微波炉加热过长，琼脂糖溶液会变得过热或剧烈沸腾。 仅加热所有琼脂糖颗粒完全溶解需要的最短时间。通常未溶解的琼脂糖呈小透明体或半透明碎片悬浮在溶液中。溶解较高浓度的琼脂糖需要较长的加热时间。要查看煮沸后是否由于蒸发而溶液体积减少，如有必要用水恢复原体积。用用隔隔离离手手套套或或夹夹子子转转移移三三角角烧烧瓶瓶或或玻玻璃璃瓶瓶到到55水水浴浴。待待熔熔化化的的凝凝胶胶稍稍冷冷却却后后加加入入溴溴化化乙乙锭锭，终终浓浓度度为为0.5g/ml。轻轻轻轻地地旋旋转转以以充充分分混混匀匀凝凝胶胶溶溶液。液。专题三核酸电泳技术琼琼脂脂糖糖溶溶液液正正在在冷冷却却时时，用用一一个个合合适适的的梳梳子子形形
28、成成加加样样孔孔。梳梳齿齿的的位位置置应应在在托托盘盘底底面面上上0.51.0mm，这这样样琼琼脂脂糖糖浇浇灌灌到到托托盘盘时时将将形形成成符符合合要求的加样孔。要求的加样孔。 多数凝胶托盘都有适宜放梳子的侧壁或外侧支架。如果没有或不合适，梳齿可能会太接近托盘底面，在拔出梳子时易穿透加样孔的底部。样品液将从凝胶和加样孔之间泄漏。应用低浓度琼脂糖(0.6)或低凝点琼脂糖时这种问题尤其容易发生。浇灌温热的琼脂糖溶液进入模具。浇灌温热的琼脂糖溶液进入模具。 凝胶适宜厚度为3-5mm。需检查在梳齿下或梳齿间应无气泡。专题三核酸电泳技术让让凝凝胶胶溶溶液液完完全全凝凝结结，室室温温下下30-45 min
29、。加加少少量量电电泳泳缓缓冲冲液液于于凝凝胶胶顶顶部部，小小心心拔拔出出梳梳子子。倒倒出出电电泳泳缓缓冲冲液液。轻轻轻轻撕撕去去封封边胶带，将凝胶安放到电泳槽内。边胶带，将凝胶安放到电泳槽内。向电泳槽加入电泳缓冲液，刚好没过凝胶约向电泳槽加入电泳缓冲液，刚好没过凝胶约1mm。混合混合DNA样品和样品和0.2倍体积倍体积6载样缓冲液。载样缓冲液。 加样孔能加入DNA的最大量取决于样品中DNA片段的大小和数目。溴化乙锭染色的凝胶图像可以观测到的最小量DNA在5mm宽(通用加样孔宽度)条带中为2 ng。使用更敏感的染料，如SYBRGold可以检测出少至20pg的DNA。若一个5mm宽条带含有500n
30、g以上的DNA时，说明加样孔过载，会导致拖尾和模糊不清等现象。如果DNA长度增加上述现象变得更为严重。分析单一DNA样品，如噬菌体或质粒DNA，每个5mm宽加样孔可加100-500ngDNA。如果样品由不同大小的许多DNA片段组成，如哺乳动物DNA酶切样品，则每个加样孔加入20-30g的DNA也不会造成分辨率明显下降。 能 加 样 的 最 大 体 积 是 由 加 样 孔 容 积 决 定 的 。 通 用 的 加 样 孔0.5cm0.5cm0.15cm可容纳约40l。切忌将加样孔加得太满，甚至溢出。为避免溢出污染邻孔样品，最好凝胶稍厚些增加孔容积或通过乙醇沉淀浓缩DNA减少加样体积。专题三核酸电泳
31、技术用用微微量量移移液液器器及及一一次次性性吸吸头头，将将样样品品混混合合液液缓缓慢慢加加至至浸浸没没凝凝胶胶的的加加样样孔孔内内。分分子子质质量量标标准准应应分分别别加加至至样样品品孔孔的的左左侧侧和和右右侧的两个孔内。侧的两个孔内。关关上上电电泳泳槽槽盖盖，接接好好电电极极插插头头。DNA应应向向阳阳极极(红红色色插插头头)侧侧泳泳动动。给给予予15V/cm的的电电压压，其其中中距距离离以以阳阳极极至至阴阴极极之之间间的测量为准。的测量为准。 如电极插头连接正确，阳极和阴极由于电解作用将产生气泡，并且几分钟内溴酚蓝从加样孔迁移进入胶体内。待溴酚蓝和二甲苯氰FF迁移到适当距离后再停止电泳。
32、溴化乙锭的存在使电泳的任何阶段都可以在紫外灯下观察凝胶。当当DNA样样品品或或染染料料在在凝凝胶胶中中迁迁移移了了足足够够距距离离时时，关关上上电电源源、拔拔出出电电极极插插头头和和打打开开电电泳泳槽槽盖盖。若若凝凝胶胶和和缓缓冲冲液液有有溴溴化化乙乙锭锭即即用用紫紫外外灯灯观观察察凝凝胶胶和和照照相相。否否则则凝凝胶胶在在含含溴溴化化乙乙锭锭(0.5g/ml)的的电电泳泳缓缓冲冲液液中中室室温温浸浸染染3045min，或或者者用用电泳缓冲液电泳缓冲液1：10 000稀释的稀释的SYBRGold贮备液浸染。贮备液浸染。专题三核酸电泳技术专题三核酸电泳技术使用使用EB的注意事项的注意事项l不必过于恐慌。不必过于恐慌。l注意个人防护。注意个人防护。l关心他人身心健康，尽可能减小污染范关心他人身心健康，尽可能减小污染范围！严格遵守实验操作规范！围！严格遵守实验操作规范！责任重于泰山责任重于泰山！专题三核酸电泳技术
