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1、第三节第三节 酶活力及酶动力学酶活力及酶动力学l一、酶活力l1、酶活力的测定l酶活力的表示方法:l酶活力：是指酶催化某以化学反应的能力，可用在一定条件下酶催化某一化学反应的反应速度来表示，即单位时间内底物的减少量或产物的生成量来表示，一般用单位时间内产物生成量来表示。lV=S/t和V=P/t lU（酶活力）单位：表示酶量的多少，酶活力单位与所采用的测定方法，反应条件等因素有关。国际酶学会提出使用统一的国际单位IU，即最适条件下25，每分钟催化1微摩尔底物所需要的酶量。l2、酶的比活力l比活力=活力单位系数/每毫克酶蛋白l是表示酶纯度的一个指标。l3、酶转换系数l表示酶的催化中心，每个活性中心或
2、酶分子底物转换底物的分子数。4、酶活力的测定：、酶活力的测定：l比色法：产物与试剂生成有色物质，根据颜色深浅来计算。分光光度法：底物和产物光吸收性质不同，可根据吸收光谱的变化来计算。l滴定法：产物之一是酸或碱可以使用此法。l量气法。l同位素测定法。l酶联法：S+E SE1 D+E2 DE2 l FlD：不能检测或不容易检测lF：容易检测 l旋光法l量热法l层析计算题计算题l 1、有1克淀粉酶制剂，用水溶解成1000毫升，从中取出1毫升测定淀粉酶活力，测得每5分钟分解0.25克淀粉。计算每克酶制剂所含的淀粉酶活力单位。（淀粉酶活力单位的定义是：最适条件下每小时分解1克淀粉的酶量称为1个活力单位。
3、）l 解：1、由题可知，1/1000克的淀粉酶能在5分钟内分解0.25克淀粉，1小时内1/1000克的淀粉酶能分解的淀粉为：0.25（60/5）=3克；l 2、由淀粉酶活力单位定义（每小时分解1克淀粉的酶量称为1个活力单位），可知1/1000克的淀粉酶的活力单位为：3；l 3、所以，1克的淀粉酶制剂的活力单位为31000=3000。2、影响酶作用的因素、影响酶作用的因素1)、酶浓度对酶反应速度的影响、酶浓度对酶反应速度的影响 在有足够底物和其他条件不变的情况下，反应速度与酶浓度成正比 。当SE时，V=K3E 2)、底物、底物3)、温度对酶反应速度的影响、温度对酶反应速度的影响 一方面是温度升高
4、一方面是温度升高, ,酶促酶促反应速度加快。反应速度加快。另一方面另一方面, ,温度升高温度升高, ,酶酶的高级结构将发生变化的高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降或变性，导致酶活性降低甚至丧失。低甚至丧失。 因此大多数酶都有一个因此大多数酶都有一个最适温度。最适温度。 在最适温度在最适温度条件下条件下, ,反应速度最大。反应速度最大。 最适温度不是一个固定的常数最适温度不是一个固定的常数，它随底物的种类、，它随底物的种类、浓度浓度, 溶液的离子强度溶液的离子强度, pH, 反应时间等的影响。反应时间等的影响。例例: 反应时间短，最适温度高。反应时间短，最适温度高。 反应时间长，最适温度低。
5、反应时间长，最适温度低。4)、pH对酶反应速度的影响对酶反应速度的影响 酶反应的最适酶反应的最适pH（optimum pH） 酶的最适酶的最适pH也不是一个固定的常数也不是一个固定的常数，它受到，它受到底物的种类、浓度底物的种类、浓度; 缓冲液的种类、浓度缓冲液的种类、浓度; 酶的纯酶的纯度度;反应的温度、时间等的影响。反应的温度、时间等的影响。例例: 碱性磷酸酶催化磷酸苯酯水解时碱性磷酸酶催化磷酸苯酯水解时 s为为2.5x10-5 M，最适，最适pH为为 8.3 s为为2.5x10-2 M，最适，最适pH为为10.0 pH影响反应速度的原因影响反应速度的原因 ( 1 ) pH影响了酶分子、底
6、物分子和影响了酶分子、底物分子和ES复合物的复合物的 解离状态。解离状态。 ( 2 ) 过高、过低的过高、过低的pH导致酶蛋白变性。导致酶蛋白变性。5)、激活剂对酶反应速度的影响、激活剂对酶反应速度的影响 酶的激活剂酶的激活剂1. 无机离子无机离子 （1）一些金属离子，如）一些金属离子，如Na+、K+、Mg2+、Ca2+、 Cu2+、Zn2+、Fe2+等。等。 （2）阴离子：如）阴离子：如Cl-、Br-、I-、CN- 等等 （3）氢离子）氢离子 凡能提高酶活力的物质都是酶的激活剂。如：凡能提高酶活力的物质都是酶的激活剂。如：Cl-是唾液淀粉酶的激活剂。是唾液淀粉酶的激活剂。2. 有机分子有机分
7、子 还原剂：抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽还原剂：抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽 金属螯合剂：金属螯合剂：EDTA 激活酶原的酶激活酶原的酶 6)、抑制剂对酶活性的影响l使酶的活性降低或丧失的现象，称为酶的抑制作用。使酶的活性降低或丧失的现象，称为酶的抑制作用。能够引起酶的抑制作用的化合物则称为抑制剂。抑能够引起酶的抑制作用的化合物则称为抑制剂。抑制剂并非变性剂，抑制剂具有不同程度的选择性。制剂并非变性剂，抑制剂具有不同程度的选择性。 l酶的抑制剂一般具备两个方面的特点：酶的抑制剂一般具备两个方面的特点： a.a.在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过 渡
8、状态相似。渡状态相似。 b.b.能够与酶以非共价或共价的方式形成比较稳定能够与酶以非共价或共价的方式形成比较稳定 的复合体或结合物。的复合体或结合物。抑制剂类型和特点 竞争性抑制剂竞争性抑制剂可逆抑制剂可逆抑制剂 非竞争性抑制剂非竞争性抑制剂 反竞争性抑制剂反竞争性抑制剂 非专一性不可逆抑制剂非专一性不可逆抑制剂不可逆抑制剂不可逆抑制剂 专一性不可逆抑制剂专一性不可逆抑制剂抑制作用的类型：抑制作用的类型：( (一一) )不可逆抑制作用不可逆抑制作用：抑制剂与酶反应中心的抑制剂与酶反应中心的活性基团以活性基团以共价共价形式形式结结合合，引起，引起酶的永久性失酶的永久性失活活。如有机磷毒剂二异。如
9、有机磷毒剂二异丙基氟磷酸酯。丙基氟磷酸酯。抑制胆碱酯酶活性，抑制胆碱酯酶活性，使乙酰胆碱不能被分解成使乙酰胆碱不能被分解成乙酸和胆碱，引起乙酰胆乙酸和胆碱，引起乙酰胆碱的积累，使神经处于过碱的积累，使神经处于过渡兴奋状态，因此此类化渡兴奋状态，因此此类化合物又称神经毒气。合物又称神经毒气。 有机磷化合物：抑制蛋白酶或酯酶活性敌敌畏敌百虫萨林有机砷化合物：与酶的巯基结合而抑制活性路易斯毒气（二）可逆抑制作用（二）可逆抑制作用(reversible inhibition) E+I EI 抑制剂与酶蛋白以抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合非共价方式结合，引起酶活，引起酶活性暂时性丧失。抑制剂性暂时性丧失
10、。抑制剂可以通过透析等方法被可以通过透析等方法被除去除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。，并且能部分或全部恢复酶的活性。二、酶动力学二、酶动力学l1、单底物酶促反应动力学 1913年，德国化学家Michaelis和Menten根据中间产物学说对酶促反应的动力学进行研究，推导出了表示整个反应中底物浓度和反应速度关系的著名公式，称为米氏方程米氏方程。 根据中间产物学说，酶促反应分两步进行根据中间产物学说，酶促反应分两步进行: :米氏方程的推导：米氏方程的推导：米氏方程米氏方程n当反应速度等于最大速度当反应速度等于最大速度一半时一半时, ,即即V V = 1/2 = 1/2 V Vmax, max,
11、 K Km = S m = S n上式表示上式表示, ,米氏常数是反米氏常数是反应速度为最大值的一半时的应速度为最大值的一半时的底物浓度。底物浓度。n因此因此, ,米氏常数的单位为米氏常数的单位为mol/Lmol/L。米氏常数的意义及测定米氏常数的意义及测定K Km m 米氏常数米氏常数V Vmax max 最大反应速度最大反应速度当底物浓度较低时当底物浓度较低时反应速度与底物浓度成正比；反反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。应为一级反应。SSV VVmaxVmax随着底物浓度的增高随着底物浓度的增高反应速度不再成正比例加速；反应反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。为混合级反应。
12、SSV VVmaxVmax当底物浓度高达一定程度当底物浓度高达一定程度反应速度不再增加，达最大速度；反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应反应为零级反应SSV VVmaxVmax米氏常数Km的意义l不同的酶具有不同不同的酶具有不同K Km m值，它是酶的一个重要值，它是酶的一个重要的特征物理常数。的特征物理常数。lKmKm值只是在固定的底物，一定的温度和值只是在固定的底物，一定的温度和pHpH条条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的下具有不同的KmKm值。值。lK Km m值表示酶与底物之间的亲和程度：值表示酶与底物之间的亲和程度：K
13、Km m值大值大表示亲和程度小，酶的催化活性低表示亲和程度小，酶的催化活性低; ; K Km m值小值小表示亲和程度大表示亲和程度大, ,酶的催化活性高。酶的催化活性高。 米氏常数的测定基基本本原原则则：将将米米氏氏方方程程变变化化成成相相当当于于y=ax+b的的直线方程，再用作图法求出直线方程，再用作图法求出Km。 1 1 K Km 1 1m 1 1 = = + + V V V Vmax S max S V VmaxmaxA. A. 取米氏方程式的倒数形式取米氏方程式的倒数形式取米氏方程式的倒数形式取米氏方程式的倒数形式：1/Vmax斜率斜率=Km/Vmax-1/Km米氏常数米氏常数KmKm
14、的的测定：测定：B、E-H法法l两边分别乘以Km+SS，得v=-Kmv/S+Vmax酶的Km在实际应用中的意义l鉴定酶：通过测定鉴定酶：通过测定Km，可鉴别不同来源或相同来源，可鉴别不同来源或相同来源但在不同发育阶段，不同生理状态下催化相同反应的但在不同发育阶段，不同生理状态下催化相同反应的酶是否是属于同一种酶。酶是否是属于同一种酶。l判断酶的最适底物（天然底物）判断酶的最适底物（天然底物） 。l计算一定速度下底物浓度。计算一定速度下底物浓度。l了解酶的底物在体内具有的浓度水平。了解酶的底物在体内具有的浓度水平。l判断反应方向或趋势。判断反应方向或趋势。l判断抑制类型。判断抑制类型。可逆抑制可
15、逆抑制(reversible inhibition) 及其动力学及其动力学 E+I EI 可逆抑制剂与酶蛋白以可逆抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合非共价方式结合，引起，引起酶活性暂时性丧失。抑制剂酶活性暂时性丧失。抑制剂可以通过透析等方可以通过透析等方法被除去法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。，并且能部分或全部恢复酶的活性。根椐抑制剂与酶结合的情况，又可以分为三类。根椐抑制剂与酶结合的情况，又可以分为三类。1. 竟争性抑制 某些抑制剂的化学结构与底某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争物相似，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。当抑制与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物
16、剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了。结果是酶促反应被抑制了。+IEIESP+ EE+S竞争性抑制作用 实例：磺胺药物的药用机理实例：磺胺药物的药用机理H2N- -SO2NH2对氨基苯磺酰胺对氨基苯磺酰胺H2N- -COOH对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸谷氨酸谷氨酸蝶呤蝶呤叶酸叶酸FH2磺胺类药物可与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶，影响FH2的合成，导致细菌生长繁殖受抑制，达到治病效果。例例: : 丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用 此酶的竞争性抑制剂还有：竞争性抑制作用动力学E = Ef +
17、 ES + EIVmax = k3 E v = k3ESVmaxv=Ef + ES + EIESKm =EfSESEf=ESKmSKi =EfIEIEI=EfIKi 竞争性抑制作用动力学竞争性抑制作用特点竞争性抑制作用特点：1）竞争性抑制剂的结构与底物结构十分相似，）竞争性抑制剂的结构与底物结构十分相似，二者竞争酶的结合部位。二者竞争酶的结合部位。4）Vmax不变，不变，Km增大增大2）抑制程度取决于抑制程度取决于I和和S的浓度以及与酶结合的的浓度以及与酶结合的亲和力大小。亲和力大小。SvV/2kmkm无 I有 I3）可以通过增大底物可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞浓度，即提高底物的竞争能
18、力来消除。争能力来消除。2. 非竟争性抑制l酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导致酶活性下降。抑制剂与活性中心以外的基团结合，并导致酶活性下降。抑制剂与活性中心以外的基团结合，不与底物竞争酶的活性中心，所以称为非竞争性抑制剂。不与底物竞争酶的活性中心，所以称为非竞争性抑制剂。l如某些金属离子（如某些金属离子（CuCu2+2+、AgAg+ +、HgHg2+2+）以及）以及EDTAEDTA等，通常等，通常能与酶分子的调控部位中的能与酶分子的调控部位中的-SH-SH基团作用，改变酶的空基团作用，改变酶的空间构象，引起非竞争性抑制。间构象
19、，引起非竞争性抑制。非竞争性抑制作用+IEI+SESIESP+ EE+S+I实例：重金属离子（实例：重金属离子（Cu2+、Hg2+、Ag+、Pb2+） 金属络合剂（金属络合剂（EDTA、F-、CN-、N3-）非竞争性抑制特点非竞争性抑制特点：1）抑制剂与底物结构不相似，抑制剂与酶活性）抑制剂与底物结构不相似，抑制剂与酶活性 中心以外的基团结合。中心以外的基团结合。2）Vm下降，下降，Km不变不变3）非竟争性抑制不能通过增大底物浓度的方法）非竟争性抑制不能通过增大底物浓度的方法 来消除来消除。Sv无 IV/2km有 I()非竞争性抑制作用动力学3、反竞争性抑制作用ESIESP+ EE+S+I酶只
20、有在与底物结合后，才能与抑制剂结合，引起酶酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合，引起酶活性下降。活性下降。反竞争性抑制特点：反竞争性抑制特点：1 1）抑制剂与酶和底物的复合物结合。）抑制剂与酶和底物的复合物结合。2 2）KmKm和和VmVm下降下降3 3）底物浓度增加，抑制作用加强。）底物浓度增加，抑制作用加强。反竞争性抑制作用动力学有无抑制剂存在时酶促反应的动力学方程 表观表观2、双底物酶促反应动力学、双底物酶促反应动力学l一）、顺序机制：底物的结合和产物的释放按一定顺序进行。lA、有序顺序，为底物，为底物。lB、随机顺序，为底物，为底物。序列机制序列机制的底物动力学方程及动力学图的底物动
21、力学方程及动力学图 在在B的浓度达到饱和时的浓度达到饱和时A的米氏常数的米氏常数 在在A的浓度达到饱和时的浓度达到饱和时B的米氏常数的米氏常数 底物底物A与酶结合的解离常数与酶结合的解离常数 底物底物A、B都达到饱和时最大反应速率都达到饱和时最大反应速率随第二个底物浓度的增加， Km降低和降低和Vm提高提高l二）、乒乓机制：底物与酶结合和产物的释放是交替进行的。为底物，为底物。（2）乒乓机制乒乓机制的底物动力学方程及动力学图的底物动力学方程及动力学图 在在B的浓度达到饱和时的浓度达到饱和时A的米氏常数的米氏常数 在在A的浓度达到饱和时的浓度达到饱和时B的米氏常数的米氏常数 底物底物A、B都达到
22、饱和时最大反应速率都达到饱和时最大反应速率随第二个底物浓度的增加， Km和和Vm均提高均提高三）、非米氏酶反应动力学，三）、非米氏酶反应动力学，Rs协同指数或饱和比值。协同指数或饱和比值。别构酶与非调节酶动力学曲线的比较例题例题l为了确定某酶的催化反应的初速度的底物依赖关系，制备了一为了确定某酶的催化反应的初速度的底物依赖关系，制备了一系列的系列的l00mll00ml含有不同底物浓度的反应混合物。向每个混合物加含有不同底物浓度的反应混合物。向每个混合物加入相同量的酶后便开始反应。通过测定每单位时间（分钟）所入相同量的酶后便开始反应。通过测定每单位时间（分钟）所形成的产物量而获得催化反应的初速度
23、，其结果如下表所示。形成的产物量而获得催化反应的初速度，其结果如下表所示。 底物浓度(mol/L) 1106 5106 1105 1104 1103 1102 初速度 (mol/min) 0.08 0.25 0.33 0.48 0.50 0.50 l把表中的数据绘制成图，在给出的酶量下的把表中的数据绘制成图，在给出的酶量下的VmaxVmax是是多少多少? ? l根据米氏方程，用根据米氏方程，用VmaxVmax、和和S S推演出推演出KmKm的代的代数表达式。计算每个反应混合物的数表达式。计算每个反应混合物的KmKm。 KmKm值取决于值取决于底物浓度吗底物浓度吗? ? l当底物浓度为当底物浓度为0.1mol0.1molL L1 1和和ll0ll07 7molmolL L1 1时，时，计算它们的初速度。计算它们的初速度。l 反应混合物保温反应混合物保温2 2分钟后确定反应的初速度。当初分钟后确定反应的初速度。当初始底物浓度为始底物浓度为1101102 2molmolL L1 1时，计算产物的生成时，计算产物的生成量。在量。在2 2分钟后底物总量的百分之几被转换分钟后底物总量的百分之几被转换? ?
